Introducción

El citral (3, 7-Dimetil-2, 6-octadienal), es un compuesto de amplio uso en las industrias de bebidas, refrescos, panificación, golosinas, farmacia, perfumería, cigarrillos y otros [1,2]; principalmente debido al amplio espectro antimicrobiano in vitro y la capacidad antioxidante que ha demostrado [3–6].

Sin embargo, estas estructuras son susceptibles a degradación frente a altas concentraciones de oxígeno, cambios de pH, procesos de deshidratación, presencia de luz y humedad durante el almacenamiento, dando como resultado la pérdida de su actividad [6]. En este sentido, investigadores como Lu et al. [4] y Yang et al. [6] indican que una alternativa para proteger las actividades del citral es la microencapsulación.

Las técnicas para microencapsular citral y otros derivados del aceite de limón en la industria alimentaria, en su mayoría se basan en sistemas coloidales blandos, siendo principalmente las emulsiones de aceite en agua, nanoemulsiones, complejos moleculares, liofilización, secado por atomización y secado por lecho fluidizado. Sin embargo, el secado por atomización es el método más utilizado en alimentos [2,7] y su eficiencia se evalúa principalmente mediante la cantidad del compuesto activo que es atrapado dentro de la matriz (Eficiencia de encapsulación - EM) [1]. La cantidad de compuesto activo que queda fuera del agente encapsulante, viene a ser el activo superficial; con la cuantificación de este activo superficial se puede inferir el cálculo de la EM [8].

Se ha demostrado que el parámetro EM se encuentra relacionado con los parámetros de formulación y de proceso como: tipo de material de pared utilizado, concentración de sólidos en la solución de alimentación y temperatura del aire de entrada al secador [7]. En la literatura se reporta que para aceites esenciales, el activo superficial o encapsulado ha sido medido usando las siguientes técnicas de análisis:

Gravimétrico .Gv). Es la de mayor uso en microencapsulación de aceites, la cuál ha sido aplicada por Chang et al. [9] en encapsulación de aceite de canola y nuez; Sharif et al. [10] en emulsiones de β-caroteno, eugenol y aceite de semilla de lino; Timilsena et al. [11] en aceite de semilla de chia (Salvia hispanica L.) y Velmurugan et al. [12] en aceite esencial de naranja (Citrus sinensis) y lavanda (Lavandula angustifolia).

Espectrofotometría ultravioleta .EUV). Se ha empleado en aceite esencial de jengibre [13]; en eugenol recubietas con β-ciclodextrina [14]; aceite esencial de albahaca [15] y en aceite de semilla de rosa [16].

Cromatografía líquida de alta eficiencia .HPLC). Ha sido aplicada en tebuconazol y resveratrol [17].

Cromatografía de gases .GC). Se ha reportado su aplicación por Campelo et al. [1], para aceite esencial de lima.

Cromatografía de gases con espectrómetrometría de masas .GC-MS). Se ha empleado en aceite de hojas de canela (Canela verum), aceite de orégano (Origanum vulgare) [18] y aceite esencial de naranja [12].

En el caso de citral se han usado diferentes técnicas, para medir el activo superficial: GC en diversos trabajos [19–22]; GC con microextracción en fase sólida (solid phase microextraction gas chromatography: SPMEGC) [23]; GC-MS [24,25]; HPLC [26]; EUV [4,27]. El uso de estas técnicas en su mayoría demandan de tiempos prolongados, preparación previa de muestras, alto costo y uso de reactivos químicos perjudiciales para el ambiente.

Por otro lado, una técnica de amplio uso y gran potencial, es la espectroscopía de infrarrojo cercano (NIR), la cual ha mostrado una aplicación potencial para el análisis en industrias de polímeros, textiles, en el control de procesos industriales, en las ciencias biomédicas [28] y principalmente más utilizado en las industrias agrícolas y alimentarias [29]. Sin embargo, existen relativamente pocos trabajos sobre la aplicación de la espectroscopía NIR para la cuantificación de citral, en aceites esenciales de limón y naranja [30].

La espectroscopía NIR tiene entre sus ventajas: permite realizar mediciones de varios componentes en forma rápida y simultánea, no es destructiva, es de bajo costo, no requiere reactivos, no requiere preparación intensiva de la muestra [29]. Esta técnica tiene como principio medir la respuesta, principalmente vibraciones de enlaces -CH, -OH, -SH y –NH, de una muestra cuando es sometida a energía electromagnética entre 800 a 2500 nm conformando así huellas o perfiles espectrales [28]. Sin embargo, por la cantidad de información contenida, el análisis de estos perfiles espectrales requiere el uso de herramientas quimiométricas como análisis de componentes principales (ACP), coeficiente de correlación (CC), redes neuronales artificiales (RNA); regresión multilineal múltiple (RLM), regresión parcial por mínimos cuadrados (PLSR), entre otras [28,31].

En función de lo anteriormente expuesto, esta investigación tiene como objetivo predecir el contenido superficial de citral en micropartículas mediante espectroscopía NIR y regresión por mínimos cuadrados parciales.

Parte Experimental

Reactivos

Los reactivos usados en la producción y análisis de las microcápsulas fueron lecitina de soya (Epikuron® 145 V, Cargill, Alemania), dextrina (Amisol® 4810, Ingredion, Perú), citral mixture cis y trans ≥ 96% (Sigma - Aldrich, Alemania) y citral analytical estandard (Sigma - Aldrich, Alemania).

Encapsulación

La encapsulación de citral mediante secado por atomización, se realizó variando la relación citral:dextrina (Ct:Dx) (1:5 y 1:20) en la solución de alimentación y la temperatura del aire de entrada al secador (TAI) al secador de atomización (120 – 200 °C); generando un total de doce tratamientos experimentales.

Para cada tratamiento se consideró 100 g de solución de alimentación. La emulsión (Citral y lecitina de soya – LS) se preparó disolviendo 1 g de LS en 30 mL de agua destilada a 50 °C, se mantuvo en agitación constante (350 rpm) por 15 minutos, se enfrió a 30 °C, luego se agregó 1 g de citral mixture y se homogenizó por 3 minutos a 15000 rpm con un homogeneizador Polytron PT 2100 (Kinematica AG, Suiza). Paralelamente, la dextrina - Dx (5 – 20 g) se disolvió en agua destilada (48 – 63 g) a 50 °C, manteniendo en agitación constante por 3 horas, se enfrió a 30 °C y luego se mezcló con la emulsión. La mezcla resultante se homogenizó a 15000 rpm por 3 minutos y se alimentó inmediatamente al secador mini Spray.

Secado por atomización

Las dispersiones obtenidas fueron alimentadas a un secador mini Spray-Dryer Büchi modelo B-290 (Suiza), con alimentación y flujo de aire de secado en configuración co-corriente. Las condiciones de proceso en el secador fueron: temperatura de alimentación de la solución de 42 ± 2,5 °C, flujo de alimentación de 5 mL/min, presión de atomización de 50 mbar, porcentaje de aspiración de 100%, flujo de aire de 600 L/h y temperatura de entrada del aire al secador que varió entre 120 y 200°C. Las micropartículas se almacenaron a -20°C en tubos falcón de 45 mL hasta su análisis.

Determinación del contenido superficial de citral (SC)

Para la determinación del contenido SC se pesaron 0,2 g de micropartículas (mcp), se adicionaron 2 mL de hexano, luego se agitaron manualmente con tres movimientos de inversión, se centrifugaron a 2000 rpm por 1 minuto, finalmente, los sobrenadantes se transfirieron a viales ámbar de 2 mL para la lectura de sus absorbancias en el cromatógrafo de gases [32,33]. La concentración SC se calculó de acuerdo a la Ec. (1) [8].

donde CCs es la concentración del citral superficial en el solvente (mg citral en 2 mL de hexano), y es la masa de la micropartícula de citral en (g).

Cromatografía de gases

La determinación del contenido de citral superficial de las micropartículas se realizó en un cromatógrafo de gases (7890A, Agilent Technologies, USA) equipado con una columna capilar de sílice fundido DB-5MS 30m x 0,25 mm x 0,25 µm (J&W Scientific, USA) y un detector de ionización de llama (FID- flame ionization detector). La temperatura del inyector y el detector fue de 250 °C. Como gas transportador se utilizó nitrógeno a un flujo de 1,11 mL/min; la inyección del volumen de muestra fue 1 µL; la temperatura de la columna se programó inicialmente a 60 °C por 5 min, luego se calentó hasta 120 °C a una razón de 5°C/ min, posteriormente, hasta 250 °C a un ratio de 10 °C/ min; siguiendo la metodología propuesta por Ruktanonchai et al. [24]. La cuantificación de citral se realizó utilizando una curva de calibración (1 – 2000 µg/mL, R. = 0,999). Los análisis se realizaron por duplicado para cada tratamiento y los resultados se expresaron en mg citral/g de mcp [8].

Espectroscopía NIR

Las microcápsulas obtenidas en los doce tratamientos se dividieron en seis partes, cuatro para modelado y dos para validación, obteniéndose un total de 72 muestras a las cuales se les determinó su perfil espectral.

La medición de los espectros de absorbancia se realizó de acuerdo a los trabajos de Escudero et al. [34] y Steuer et al. [35]; usando un espectrómetro infrarrojo cercano Unity Scientific NIRS (SpectraStar 2500XL, EE.UU.) equipado con lámpara halógena de tungsteno como fuente de luz y detector InGaAs (Indio – Galio – Arsénico) en el rango de 1100 y 2500 nm, con una resolución de 1 nm. Las mediciones se realizaron en el modo reflectancia aplicado directamente a las micropartículas sin tratamiento ni manipulación previa, utilizando una cubeta de cuarzo de 3,5 cm de diámetro interno y 1,0 cm de espesor, donde se adicionaron 2,3±0,5 g de micropartículas.

Pretratamiento de los perfiles espectrales

Los espectros se pretrataron utilizando un filtro de Savitzky-Golay de segundo orden de acuerdo con los estudios de Vásquez et al. [36] y Castro et al. [37]. Posteriormente, se dividieron aleatoriamente en conjuntos de datos de calibración y validación, cuarenta y ocho y veinticuatro perfiles espectrales, respectivamente. Todos los datos se guardaron en hojas de cálculo Excel para la etapa de modelado.

Modelado

Para modelar las relaciones entre los perfiles espectrales y los parámetros del contenido de SC se utilizó el método de regresión de mínimos cuadrados parciales (PLSR) [28,31,36].

PLSR es un método estadístico que transforma variables de entrada . en la salida .. En este trabajo, . es una matriz de absorbancia , donde . es la longitud de onda y m es el número de observaciones, . son los valores de la variable respuesta (contenido SC) de las micropartículas. PLSR descompone . e .al proyectarlos en nuevas direcciones con la restricción de que la descomposición describe cómo las variables cambian juntas tanto como sea posible. Después de la descomposición variable, se realiza un paso de regresión en el que las . y las . descompuestas se usan para calcular un modelo de regresión llamado modelo completo (Ec. 2) [36].

Esta ecuación se puede reescribir como en la Ec. (3).

donde Y es la matriz de valores de la variable respuesta, . es la matriz de coeficientes beta, . es la matriz de datos de absorbancia, y X es el error del modelo.

La metodología fue adaptada de Vásquez et al. [36], los modelos PLSR completos se construyeron usando todas las longitudes de onda en un perfil espectral, y la relevancia de cada longitud de onda en el modelo se evaluó sobre la base de los pesos w de carga según Mehmood et al. [38]. Las longitudes de onda se vincularon a los pesos de carga absolutos para el modelo PLSR y se seleccionaron de acuerdo con su valor y capacidad para explicar ., lo que redujo el error cuadrático medio (RMSE). Posteriormente, se construyeron modelos simplificados u optimizados utilizando solo las longitudes de onda más relevantes [36]. Las funciones usadas para el modelado se implementaron en script de Matlab 2015ª.

Evaluación del modelo

Para la medición de la robustez y predictibilidad de técnicas basadas en análisis multivariados es común el uso del coeficiente de determinación (R²) y el RMSE. Estas medidas pueden ser calculadas usando conjunto de muestras para calibración (modelado), obteniendo R2_c; RMSE_c; y para validación, obteniendo R²_v, RMSE_v ; usando las Ecs. (4) y (5) (39).

donde e son los valores de los atributos de calidad de lasmuestras para predicción y referencia, respectivamente.e son los valores promedio de los conjuntos de datosde calibración y validación, respectivamente. e sonlos números de muestras de los conjuntos de datos decalibración y validación, respectivamente.

La validación del modelo se realizó con el conjunto de datos para validación mencionadas en los apartado anteriores; comparando los valores reales y predichos de las variables respuesta. Se determinaron los estadísticos R² y RMSE. Finalmente, dichos estadísticos permitieron comparar los modelos completo y optimizado.

Resultados y Discusión

Análisis de referencia

Según los análisis de referencia de las micropartículas, realizado mediante cromatografía de gases, la concentración del citral superficial varió entre 0,17 y 1,28 mg citral/ g mcp.

Perfiles espectrales del contenido superficial de citral

La Figura 1 muestra los perfiles espectrales medios para las micropartículas con diferentes concentracones de citral; en esta figura se observa picos relacionados con las bandas de absorbancia en la región de sobretonos de 1206 a 1761 nm y la región de combinación de 1934 a 2490 nm.

Los picos de absorción entre 2096 y 2312 nm están dentro de los rangos correspondientes a las interacciones C-H flexión- extensión y C=O extensión, posiblemente debido a la presencia del grupo aldehído [35,40]. Los picos 1206, 1710 y 1761 nm corresponden a la interacción C-H extensión, probablemente por la presencia de dextrina, polímero usado en este estudio para la encapsulación del citral; estos resultados obtenidos coinciden con los reportados por Magwaza et al. [41] y Shenk et al. [42].

Igualmente; los picos 1457 y 1934 corresponden a las bandas de vibración del estiramiento de O-H extensión y O-H combinación, respectivamente, principalmente debido a la presencia de agua; además se observó un pequeño pico a 1574 nm, que está dentro de la banda vibratoria de C-H extensión, asociado a los lípidos, probablemente debido a la presencia de lecitina de soya utilizada como emulsificante en la preparación de las micropartículas [29].

Estos perfiles indicaron una correspondencia entre los cambios de los espectros y el contenido de SC en las micropartículas, lo que permite el análisis de patrones y la implementación de modelos de predicción.

Modelado PLSR

En las siguientes subsecciones se muestran los principales resultados de la etapa de modelado.

a) PLSR completo

Los resultados de los modelos PLSR completos se muestran en la Figura 2 y la subsección 3.4; en ambas figuras, se observó que el R. estuvo cerca de 1.0.

Sin embargo, en los resultados la Figura 2b presentó una mayor dispersión, con respecto a la Figura 2a. En este caso, de acuerdo con Esposito et al. [43], Maaten et al. [44] y Vega et al. [45], estos resultados pueden deberse a la alta colinealidad y la superposición de los perfiles espectrales que introducen ruido en el modelo, siendo necesario determinar previamente la relevancia de cada longitud de onda antes de ser utilizada en el modelo.

b) PLSR optimizado

La Figura 3 resume los resultados de esta etapa. La Figura 3a muestra el número óptimo de variables latentes (LV) (longitudes de onda), los cuales fueron 17, obtenidos a través de la minimización de RMSE y la maximización de R., utilizando PLSR con validación cruzada para el contenido de SC según lo propuesto por Liu et al. [46]

La Figura 3b muestra los β-coeficientes del modelo PLSR, que representa la relevancia de cada longitud de onda y las longitudes de onda relevantes (marcadas con puntos negros), que se distribuyeron principalmente en el rango de [2251 -2491] nm, y otros dos rangos [1287 – 1544] nm y [1827 – 2100] nm.

Igualmente, se observó un mayor β-coeficiente a 2306 nm para citral causado por la combinación de las frecuencias de C=O y C-H extensión del grupo aldehído que está contenido en citral. Los picos negativos (2251 y 2322 nm) podría deberse a que los picos de absorbancia se invierten en el cálculo del β-coeficiente [40]. Estos resultados están dentro de los rangos reportados por Steuer et al. [35], en la evaluación del espectro NIR del limoneno puro, en la que obtuvieron picos predominantes entre las áreas de 2250 y 2360 nm. Por otro lado, los resultados del presente estudio fueron ligeramente superiores a los reportados por Wilson et al. [40] obtenidos en la evaluación del espectro NIR de citral en aceites esenciales de hierva de limón o limoncillo (Cymbopogon citratus) y limón (Citrus limon), observaron que el grupo funcional aldehídico C-H (contenido en el citral) exhibía bandas características de combinación entre 2210 y 2250 nm; además, un incremento en la absorbancia alrededor de 2212 nm con el incremento del contenido de citral; esta diferencia en los resultados podría deberse a la presencia de dextrina y lecitina de soya como parte de la formulación de las micropartículas.

Finalmente, las longitudes de onda relevantes se usaron para construir los modelos optimizados PLSR, que resultaron del uso del conjunto de datos de calibración (Figura 4a y Figura 4b). En ambas figuras, se observaron que los R² fueron 0,97 y 0,94 para calibración y validación.

Comparación de modelos

Las medidas estadísticas de los modelos PLSR(completos y optimizados) utilizando el conjunto de datosde calibración y validación se muestran en la Tabla 1.

Los modelos PLSR produjeron resultados aceptables con altos valores de R. superiores a 0,89, y con valores bajos de RMSE inferiores a 6,38 x10^-4, resultados similares a los obtenidos por Juliani et al. [47], en la evaluación de las estadísticas de correlación NIR para la composición de aldehídos de aceites esenciales en hoja de canela (Cinnamomum zeylanicum), hojas y brotes de clavo de olor (Syzygium aromaticum). Además, estos resultados fueron similares a los obtenidos por Steuer et al. [35] y Schulz et al. [48], para limoneno en aceite de cítricos; y citral en aceites esenciales de hierba de limón y limón. Finalmente, los resultados del presente estudio estuvieron dentro de los rangos obtenidos por Schulz et al. [49], quienes evaluaron la composición química de los aceites esenciales de tomillo, orégano y manzanilla, utilizando espectroscopía FT-IR y NIR; en todos estos estudios reportaron R. mayor a 0,90.

Conclusiones

El método NIR-PLSR fue capaz de predecir el contenido superficial de citral en las micropartículas, con R. superiores a 0,89. Asimismo, al generar el modelo optimizado se observa que la robustez del modelo mejora reduciendo el valor RMSE e incrementaando el R.. En consecuencia, esta técnica permite inferir la eficiencia de encapsulación en micropartículas y muestra potencial para reemplazar los métodos tradicionales de evaluación de encapsulación de citral. En este contexto, la tecnología espectroscópica NIR junto a los métodos quimiométricos, por su rapidez y bajo costo, tendrá cada vez más importancia en el futuro cercano.

Agradecimientos

El primer autor agradece el apoyo al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONCYTEC) por financiar la presente investigación y otorgar la beca para cursar el doctorado en Ciencia de Alimentos dentro del programa doctoral de la Universidad Nacional Agraria La Molina - Lima.

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