Introducción

Las floraciones son eventos en los que se produce un in­cremento de la biomasa de una o unas pocas especies de cianobacterias en períodos cortos de tiempo. La importan­cia de estos eventos radica en el impacto que tienen sobre el ecosistema acuático, ya que alteran el ciclado de los nutrientes y disminuyen la disponibilidad de luz y oxígeno, causando una disminución de la biodiversidad y deterioro de la calidad del agua (Sivonen y Jones, 1999; Havens, 2007; Karjalainen, et al., 2007). En Uruguay se han registrado floraciones de cianobacterias en diferentes ecosistemas acuáticos desde la década de los 80 (Quirós y Luchini, 1982; Feola, et al., 2008; Kruk, et al., 2015; Bonilla, et al., 2015) y las especies de cianobacterias formadoras de floraciones más frecuentes son Microcystis aeruginosa, Nodularia spumigena, Planktothrix agardhii . Cylindospermopsis raciborskii (Aubriot, et al., 2011; UNESCO, 2009; Vidal y Kruk, 2008; De León y Yunes, 2001; Bonilla, 1997).

Las floraciones son favorecidas por las actividades antropogénicas (actividad agrícola-ganadera, industrial y urbanización), tales como el uso de fertilizantes, el vertido al agua de desechos domiciliarios no procesados, entre otros (Mazzeo, et al., 2002; Chalar, 2009; Rodríguez-Gallego, 2010). Estas actividades aportan nutrientes (principalmente nitrógeno y fósforo) al ecosistema acuático y pueden causar su eutrofización, favoreciendo el crecimiento de cianobacterias (De León y Yunes, 2001). Una de las preocupaciones asociadas a la presencia de floraciones de cianobacterias es debida a la capacidad de producir toxinas (cianotoxinas) que tienen algunas especies. Entre las especies potencialmente tóxicas que producen floraciones en todo el mundo se encuentran las pertenecientes al género Microcystis (Huisman, et al., 2005). Estas tienen la capacidad de producir microcistinas, una cianotoxina ampliamente conocida y reportada (Dittmann y Wiegand, 2006). A pesar de que existe abundante información acerca de la ecología de Microcystis spp. en diversos ecosistemas, no hay un consenso acerca de las condiciones ambientales que favorecen la producción de microcistinas y la proliferación de poblaciones capaces de producirlas.

Se ha descrito que durante una floración de Microcystis spp. conviven poblaciones tóxicas y no tóxicas y que la presencia de los genes involucrados en la síntesis de microcistinas es el factor determinante de su toxicidad (Rinta‐Kanto, et al., 2009). Así, las cianobacterias tóxicas serán portadoras de genes mcy (genotipo tóxico, mcy+) y las no tóxicas serán aquellas que carecen de dichos genes (genotipo no tóxico, mcy-). La biosíntesis de microcistinas es realizada a partir de dos complejos enzimáticos conocidos como el complejo polikétido sintetasa (KPS) y el complejo péptido sintetasa (NRPS), cuyos genes se organizan en un cluster genético integrado por dos operones bidireccionales conocido como cluster mcy .mcyA-J) (Tillett, et al., 2000).

Los primeros registros de floraciones de Microcystis spp. en Uruguay fueron en el embalse de Salto Grande (Quirós y Luchini, 1982) y en la actualidad se siguen registrando floraciones en todas las estaciones del año (Bordet, et al., 2017). Asimismo, Kruk et al. (2015) detectaron la presencia de floraciones de especies de Microcystis en el Río Uruguay tanto en verano como en invierno, sugiriendo que dadas las condiciones nutricionales adecuadas estos organismos son capaces de proliferar a bajas temperaturas. Estudios anteriores de nuestro grupo de investigación mostraron que a lo largo del gradiente ambiental comprendido por el Río Uruguay y el Río de la Plata existen diferentes genotipos tóxicos de Microcystis spp. identificados de acuerdo a las variaciones en las secuencias nucleotídicas del gen mcyJ (Martínez de la Escalera, comunicación personal). Cada genotipo identificado se asoció a un conjunto determinado de condiciones ambientales, principalmente en relación a la temperatura, salinidad y turbidez. Este hallazgo llevó a proponer la existencia de ecotipos de Microcystis spp. adaptados a distintas condiciones ambientales (Martínez de la Escalera, comunicación personal). En este contexto, existirían distintas poblaciones de Microcystis adaptadas a condiciones ambientales claramente diferentes, tales como baja temperatura o alta conductividad, lo que evidencia la existencia de una gran diversidad intraespecífica que sería crucial para el éxito y proliferación de estos organismos.

Basados en estos antecedentes, la hipótesis de este trabajo propone que la estrategia que presentan las especies tóxicas del género Microcystis para prosperar en condiciones ambientales diversas de temperatura, salinidad, turbidez, disponibilidad de nutrientes, etcétera, involucra la existencia de alta diversidad a escala intraespecífica. Esta variabilidad incluye poblaciones con distinta capacidad para adaptarse a diversas combinaciones de las variables ambientales consignadas. Con el fin de contribuir a dilucidar esta hipótesis, el objetivo principal de este trabajo fue evaluar la diversidad genética de poblaciones tóxicas de Microcystis en el embalse de Salto Grande y conocer las condiciones ambientales en las que prosperan. La diversidad genética se evaluó mediante el análisis de melting de alta resolución (HRM) de amplicones del gen mcyJ. La elección de este gen estuvo basada en evidencias que indican que no sufre recombinación (a diferencia de mcyA,B,C) y por tanto su secuencia presenta un mayor grado de conservación que la del resto de los genes del cluster mcy. Estas características lo convierten en candidato para estudios filogenéticos (Tanabe, et al., 2004, 2009; Kim, et al., 2010).

La técnica de high resolution melting (HRM por su sigla en inglés) se basa en la amplificación de un gen determinado mediante PCR en tiempo real y permite detectar poliformismos de nucleótido único (SNPs por su sigla en inglés). Por tanto, fue empleada para detectar variaciones en las secuencias del gen mcyJ teniendo en cuenta que el perfil de melting de una muestra estará integrado por los perfiles de cada organismo portador del gen allí presente. Esto determina que al hablar del genotipo tóxico de una muestra nos referimos al conjunto de genotipos mcyJ que la componen, cuya variabilidad se refleja en su perfil de melting.

Materiales y Métodos

Sitio de estudio y muestras

El embalse de Salto Grande comprende una obra de represamiento del Río Uruguay de carácter binacional argentino-uruguayo. Fue creado para la generación de energía hidroeléctrica, además de su utilización con fines domésticos y sanitarios, navegación y riego. Se presenta como un ambiente con dos subambientes diferenciados (Figura 1): una zona central que abarca un 70% de la superficie total, con un tiempo medio de permanencia histórico a cota máxima de 0,031 años, y cinco brazos laterales de distintas características (Quirós y Cuch, 1982; Quirós y Luchini, 1982). De ellos, el brazo Gualeguaycito está ubicado en las proximidades de la represa de Salto Grande correspondiente a la margen argentina, abarca un 8,5% de la superficie total, es el área más crítica respecto a la calidad del agua del embalse, y es zona de actividades náuticas deportivas y recreativas. A su vez, en la margen izquierda (uruguaya), de condiciones morfométricas similares, se ubica el brazo Itapebí, que presenta diferencias limnológicas significativas con el brazo de margen derecha. El sitio Las Palmeras constituye una playa con condiciones tipo litoral respecto a los sitios canal, es de uso recreativo intenso, y presenta los registros máximos históricos de densidad y toxinas. El embalse se ubica pocos kilómetros aguas arriba de las ciudades de Concordia (Argentina) y Salto (Uruguay), 29° 43’ y 31° 12’ S y 57° 06’ y 57° 55’ O. Por su temperatura media anual mayor a 15 °C es considerado un sistema cálido tropical (Salas y Martino, 1991). En los brazos del embalse se han registrado floraciones de cianobacterias Microcystis spp. y Dolichospermum spp. (Quiros y Lucchini, 1982).

Se obtuvieron 19 muestras de tres estaciones de muestreo (Figura 1): Gualeguaycito, Las Palmeras (únicamente muestreado en los meses de invierno) e Itapebí en seis meses del año 2013 (febrero, abril, junio, julio, agosto, setiembre). En cada estación se extrajeron tres muestras a diferentes profundidades: nivel sub-superficial (0,2 m), límite inferior de la capa fótica (2,5 a 3 m) y una muestra a un metro de fondo. Todas las muestras se obtuvieron empleando una botella de Van Dorn.

En cada muestreo se midió conductividad (µS cm^-1), pH, oxígeno disuelto (mg L^-1) y temperatura del agua (°C) mediante una sonda multiparamétrica Hydrolab DS5. Además, se determinó la concentración de nutrientes, nitrógeno total (NT, mg L^-1) y fósforo total (PT, mg L^-1), clorofila-a (mg L^-1), abundancia de Microcystis spp. (células mL^-1) y concentración de microcistina-LR (µg L^-1).

La concentración de PT y NT fueron determinadas siguiendo las técnicas Standard Methods (American Public Health Association, et al., 2005).

Para determinar la concentración de clorofila-a, las muestras de agua se almacenaron en bidones de 2 L y se filtraron luego de 3-6 horas empleando filtros GF/C (Whatman) que se conservaron en oscuridad a -20 °C. La extracción se realizó con acetona 90% y se aplicó el método espectrofotométrico tricromático (Lorenzen, 1967).

Abundancia y toxicidad de Microcystis spp.

La abundancia de células de Microcystis spp. se estimó mediante conteo en cámaras de sedimentación de 1 y 20 mL en microscopio invertido (método Utermöhl descrito en Hasle, 1978). La concentración de microcistina-LR en las muestras de agua se determinó por HPLC-DAD en el LATU tanto para agua potable como para agua bruta con base en la Norma ISO 20179 (International Organization for Standarization, 2005; Lawton, et al., 1994). El límite de detección del ensayo fue de 0,03 µg L^-1.

Extracción de ADN

Las muestras obtenidas se filtraron a través de filtros de celulosa de 0,45 µm de tamaño de poro y 13 mm de diámetro (Millipore) y los filtros se aplicaron al método descrito por Martínez de la Escalera et al. (2014) con modificaciones. Los filtros fueron colocados en tubos de lisis con una matriz de esferas de cerámica (diámetro 1,4 mm) con 800 µl de buffer de extracción (composición del buffer de extracción: 100 mM Tris-HCL pH= 8.0, 100 mM EDTA pH=8,0, 100 mM Na-Fosfato pH=8,0, 1,5M NACL, 1% CTAB). Luego se homogeneizó en el equipo Fast Prep (MP Biomedicals) durante 40 segundos a 6,0 m s^-1. Posteriormente se continuó según el método de Martínez de la Escalera et al. (2014).

PCR cuantitativo en tiempo real (qPCR)

Se cuantificó la abundancia del gen mcyE involucrado en la síntesis de la microcistina mediante qPCR utilizando cebadores específicos (Sipari, et al., 2010). En cada reacción se utilizó 10 nmol de cada cebador, 2 µL del ADN muestra (aproximadamente 5 ng) y 7,76 µL del kit Power SYBR Green PCR (Invitrogen), con un volumen final de reacción de 20 µL. La PCR constó de 2 min a 50 °C, 15 min a 95 °C y 40 ciclos de 15 s a 95 °C, 30 s a 60 °C y 30 s a 72 °C (Martínez de la Escalera, et al., 2017) y se realizó en un termociclador CFX96 Real Time System (BIORAD). Para cuantificar de manera absoluta el número de copias de mcyE se empleó un clon y se realizaron diluciones seriadas de 1/1E-4 a 1/1E-10 para generar curvas de calibración y determinar el número de copias del gen por mL de muestra.

Análisis de HRM (High Resolution Melting)

Para realizar el análisis HRM primero se obtuvieron amplicones del gen mcyJ y luego se analizaron mediante la técnica de HRM. Del total de las muestras evaluadas en este trabajo (19) se emplearon 8 (3 muestras obtenidas en verano y 5 en invierno) que mostraron una amplificación eficiente del gen mcyJ mediante qPCR y por tanto fueron empleadas para realizar el HRM. Para ello, se utilizó el kit MeltDoctor HRM (Invitrogen) en un volumen final de reacción de 20 µL. Cada reacción contenía: 9.5 µL de agua, 0,5 µL de BSA (30 mg mL^-1), 7,76 µL de mix MeltDoctor HRM, 0,12 µL de cada cebador (10 nmol) y 2 µL del ADN muestra (aproximadamente 5 ng). Se utilizó el termociclador CFX96 Real Time System (BIORAD) y el software Bio-Rad Precision Melt Analysis.

Análisis de datos

Para detectar las relaciones entre las variables ambientales y biológicas se realizaron análisis de correlación de Spearman. El estudio de las diferencias significativas entre verano e invierno y entre los sitios de estudio en relación a los parámetros ambientales y biológicos fueron evaluados mediante el test de Kruskal-Wallis (KW).

Por último, los perfiles de melting obtenidos por HRM se analizaron mediante métodos de agrupamiento jerárquico aglomerativo: UPGMA (Unweighted Pair Group Method using Arithmetic averages), utilizando la distancia euclidiana. Los análisis estadísticos se realizaron empleando la plataforma libre R versión 3.4.1.

Resultados

Caracterización ambiental

La temperatura del agua mostró estacionalidad; la máxima temperatura se registró en verano (25,9 °C) y la mínima en invierno (13,0 °C). La conductividad del agua fue similar en ambas estaciones y el pH fue ligeramente alcalino. Respecto a las concentraciones de nutrientes (fósforo y nitrógeno total) no se observaron diferencias significativas entre verano e invierno y tampoco entre los sitios de muestreo (Tabla 1).

La concentración de clorofila . fue significativamente mayor en verano en Gualeguaycito e Itapebí (KW, p < 0,05) (Figura 2A).

Abundancia y toxicidad de Microcystis spp.

En general, se encontró una abundancia de células de Microcystis spp. significativamente mayor en las muestras correspondientes al verano en comparación al invierno (KW, p < 0,05) (Figura 2B). En Gualeguaycito, la abundancia de Microcystis spp. varió entre 328 y 87.700 células mL^-1. Por otro lado, Itapebí presentó una abundancia de Microcystis spp., que varió entre 585 y 267.000 células mL^-1, mientras que Las Palmeras presentó menor abundancia de Microcystis spp. (0-6.975 células mL^-1).

Cuando se analizó la abundancia de mcyE como proxy del potencial tóxico, el mayor valor se detectó en verano (5.228,3 copias mL-1). Sin embargo, durante el invierno también se detectó el gen mcyE con una abundancia máxima de 2.490,9 copias mL-1. Si bien se observaron diferencias en la abundancia del gen mcyE entre verano e invierno, estas no fueron significativas (KW, p < 0,1).

Al evaluar la presencia y concentración de microcistina-LR, esta se detectó únicamente en verano (Gualeguaycito e Itapebí). En Gualeguaycito, la concentración de la toxina varió entre 5,5 y 96 µg L^-1, mientras que en Itapebí se encontró entre 0 y 5,5 µg L^-1 (Figura 2). El número de copias del gen mcyE se correlacionó positiva y significativamente con la temperatura del agua (Spearman, rho = 0,67, p = 0,01) y con la concentración de microcistina-LR (Spearman, rho = 0,45, p = 0,049). Sin embargo, la correlación con la abundancia de células de Microcystis spp. fue no significativa para un p-valor de 0,05 (Spearman, rho = 0,42 p = 0,07).

Diversidad estacional de genotipos mcyJ

El análisis de cluster realizado a partir de los perfiles de melting de HRM del gen mcyJ obtenidos para cada muestra permitió distinguir dos grupos de genotipos tóxicos denominados cluster 1 y cluster 2 (Figura 3).

Se evaluaron las condiciones ambientales en las que aparecía cada cluster de genotipos y se observó que las muestras pertenecientes al cluster 1 aparecían a temperaturas bajas (entre 13,8 y 17,6 °C), mientras que el cluster 2 incluía muestras obtenidas en condiciones de temperatura entre 17,0 y 25,9 °C (KW, p < 0,05) (Figura 4A). Asimismo, se observaron diferencias en la conductividad del agua entre ambos clusters aunque no fueron significativas (KW, p < 0,1). El cluster 1 estaba integrado por muestras cuya conductividad se encontraba en el rango entre 48 y 57 µS cm^-1, mientras que las muestras que componían el cluster 2 presentaron conductividades entre 52 y 60 µS cm^-1 (Figura 4B). Asimismo, se observaron diferencias significativas en el número de células de Microcystis spp. entre ambos clusters (Figura 5A). El 1 presentó una abundancia de Microcystis spp. significativamente menor que el 2 (0 – 2.875 células mL^-1), que presentó una variación entre 2.100 y 87.700 células mL^-1. La toxicidad de las muestras (concentración de microcistina-LR) también presentó diferencias significativas entre clusters (KW, p < 0,05) (Figura 5B); el cluster 2 fue el único que presentó muestras tóxicas, con concentraciones de microcistina-LR de 5,5 a 96 µg L^-1.

Discusión

En este trabajo se evaluó la diversidad genética de Microcystis spp. en el embalse de Salto Grande mediante HRM del gen mcyJ. Con base en el análisis de los perfiles de melting de los amplicones obtenidos se pudo detectar la presencia de dos grupos de genotipos mcyJ (indicador de poblaciones potencialmente tóxicas), cada uno caracterizado por proliferar a distintas condiciones de temperatura y conductividad del agua (Figura 3). Asimismo, la mayor abundancia de células de Microcystis spp. y las mayores concentraciones de microcistina-LR se detectaron durante el verano, a temperaturas del agua de entre 21 y 23 °C. Sin embargo, no se encontró relación entre la abundancia y toxicidad de las cianobacterias con los nutrientes, ya que estos presentaron valores similares a lo largo del año.

Debido a la concentración de fósforo total, de clorofila-. y a la abundancia de fitoplancton a lo largo del año, el embalse de Salto Grande se clasifica como un ambiente eutrófico (Chalar, et al., 1993) en el que las floraciones de cianobacterias son comunes (De León y Yunes, 2001; Chalar, 2009). Si bien la eutrofización es generalmente el factor que se considera responsable principal de las floraciones de cianobacterias (Reynolds, 2006; Schindler, et al., 2008), existe evidencia de que factores físicos tales como irradiancia, temperatura, turbulencia, mezcla vertical y flujo hidráulico contribuyen a la promoción de estos eventos (Paerl y Huisman, 2008; Kosten, et al., 2011; Paerl, 2014).

No obstante, hasta el momento no se conoce cuál es la combinación de condiciones ambientales e hidrológicas que estimulan la producción de toxinas por parte de las poblaciones tóxicas (O´Neil, et al., 2012; Pearl y Huisman, 2009). Desde los primeros estudios que analizaron la influencia del ambiente sobre la producción de microcistinas en cultivos, la temperatura ha sido propuesta como una variable relevante. En este sentido, se ha reportado que la producción de toxinas es generalmente mayor entre 20 y 25 °C (van der Westhuizen y Eloff, 1985; Watanabe y Oishi, 1985; van der Westhuizen, et al., 1986). Más recientemente, Davis et al. (2009) observaron que al aumentar la temperatura en condiciones controladas que simulaban un ambiente eutrófico la tasa de crecimiento de células tóxicas de Microcystis (cuantificadas a través de la presencia del gen mcyD) aumentaba significativamente en relación a la de células no tóxicas. Incluso en algunos casos las células no tóxicas mostraban una disminución de sus tasas de crecimiento, lo que lleva a concluir que el incremento de la temperatura por encima de los valores promedio de los ecosistemas (por ejemplo en un escenario de aumento de temperatura por calentamiento global) llevaría a un aumento selectivo de las poblaciones tóxicas de Microcystis(Davis, et al., 2009; Joung, et al., 2011). En adición, otros estudios que involucran expresión génica mostraron que la fracción de células productoras de toxina en M. aeruginosa es significativamente mayor a temperaturas entre 20 y 26 °C (Dziallas y Grossart, 2011). Estos resultados están en línea con los obtenidos en este trabajo, ya que se encontró mayor concentración de microcistina-LR a temperaturas cercanas a la óptima de crecimiento de las especies del género Microcystis (21-23 °C).

Diversos estudios han reportado resultados contrastantes al evaluar la asociación entre el ambiente y la diversidad de Microcystis spp. (Pobel, et al., 2012; Hu, et al., 2016), por lo que aún no hay evidencia clara acerca de cuáles son las variables ambientales que influyen sobre la diversidad genética de Microcystis. Por ejemplo, basándose en el análisis del gen mcyA mediante geles en gradiente desnaturalizante, Hu et al. (2016) encontraron que la variación genotípica de una comunidad de Microcystis se relacionaba con distintas variantes de microcistina, lo que implica que la composición de la comunidad determinaría el tipo de toxina producida. Asimismo, se ha reportado que a diferentes temperaturas M. aeruginosa sufre cambios significativos en el patrón de microcistinas que produce, mientras que el contenido total de toxina por célula no cambia (Amé y Wunderlin, 2005). Por tanto, la temperatura no solo estimularía el crecimiento selectivo de poblaciones tóxicas, sino también el tipo de microcistina producida por estos organismos.

Tanto los hallazgos reportados en la literatura como los de este trabajo sugieren que a temperaturas que optimizan la tasa de crecimiento la producción de toxinas sería máxima. Dado que el rol de la microcistina en la biología y ecología de los organismos que la producen aún no está esclarecido, la información generada hasta el momento (tanto a partir de cultivos como de muestras ambientales) en relación a la temperatura brinda nuevos enfoques para analizar este tema.

En relación a la conductividad y su efecto sobre Microcystis spp., al momento se ha reportado que su aumento no tendría impacto diferencial en poblaciones tóxicas y no tóxicas (Tonk, et al., 2007; Joung, et al., 2011; Tanabe, et al., 2018). Sin embargo, la mayoría de los estudios se centran en concentraciones de sales más altas que las encontradas normalmente en sistemas de agua dulce, evaluándose por lo general salinidades estuarinas a marinas. Cabe destacar que en este trabajo los cambios en la conductividad asociados a la aparición de uno u otro genotipo tóxico, si bien fueron significativos, estuvieron siempre en el rango de lo esperado para un sistema de agua dulce como el embalse de Salto Grande. Asimismo, dado que se evaluaron únicamente genotipos tóxicos, no es posible conocer el efecto de la conductividad sobre las poblaciones no tóxicas de Microcystis. Una hipótesis para explicar los resultados obtenidos es que el aumento de conductividad sea consecuencia de algún otro proceso hidrológico, por ejemplo la resuspensión de sedimento debida al viento (F. Bordet, comunicación personal), cuyo efecto sobre el metabolismo celular sea en detrimento de la producción de toxinas. Sería necesario realizar estudios específicos para detectar qué otra variable se asocia a los cambios de conductividad en el sistema de estudio.

Trabajos previos de nuestro grupo demostraron que la temperatura y la conductividad son las variables más relevantes para determinar la abundancia de genotipos tóxicos de Microcystis en el gradiente ambiental Río Uruguay-Río de la Plata (Kruk, et al., 2015; Martínez de la Escalera, et al., 2017). O´Farrell et al. (2012) propusieron que la intensidad y frecuencia de floraciones de cianobacterias en el embalse de Salto Grande podrían ser en gran medida explicadas por el ciclo hidrológico y por la morfología del embalse, encontrándose mayores acumulaciones de biomasa en los brazos donde desembocan cursos de agua tales como Gualeguaycito e Itapebí. Es en estos sitios que presentan baja profundidad, altos tiempos de residencia del agua y acumulación de nutrientes provenientes de la cuenca donde se generan floraciones masivas de Microcystis spp. tóxicas, probablemente asociadas a mayores temperaturas que las que alcanza el resto del embalse. En este contexto, el hallazgo de genotipos mcyJ de Microcystis spp. con diferente potencial tóxico y asociados a diferentes temperaturas sugiere que la variable es relevante no solo a la hora de condicionar la abundancia de poblaciones tóxicas, sino también para inducir la expresión de los genes involucrados en la síntesis de microcistinas.

Con base en los resultados obtenidos, es de esperar que aquellas condiciones ambientales que favorezcan altas temperaturas del agua en el embalse promuevan el crecimiento de poblaciones de Microcystis spp. con genotipo tóxico y estimulen la producción de toxinas.

Reconocimientos

Este trabajo fue realizado en el marco de la tesina para obtener el grado de Licenciado en Ciencias Biológicas (Facultad de Ciencias, UDELAR) de Facundo Lepillanca. Parcialmente financiado por PEDECIBA-Biología y por la Comisión Técnico-Mixta de Salto Grande.

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