INTRODUCCIÓN

Las bacterias del género Rhizobium tienen la capacidad de inducir en las raíces de las leguminosas la formación de estructuras especializadas llamadas nódulos, dentro de las cuales el N2 atmosférico, que es muy estable y relativamente inerte, se reduce a iones amonio (NH₄⁺) fácilmente asimilables por la mayoría de las especies vegetales (Marquina et al., 2011).

La asociación Rhizobium-leguminosa se considera un proceso de alta eficiencia en fijación biológica del nitrógeno atmosférico (FBN); se estima que la fijación de nitrógeno varía de 24 hasta 584 kg ha^-1 y tiene la capacidad de abastecer hasta 90 % de las necesidades de la planta (Ángeles-Núñez y Cruz-Acosta, 2015); además, la FBN contribuye a reducir el uso de fertilizantes nitrogenados, a remediar los problemas de contaminación del suelo y agua, y a disminuir los costos de producción, lo cual representa una ventaja económica, a la par de una buena práctica ambiental en la producción agrícola (Granda et al., 2014; Yadegari y Rahmani, 2010).

Las especies del género Rhizobium son bacilos móviles Gram-negativos con pared celular, flagelados (1 a 6 flagelos), aerobios que miden 0.5-0.9 × 1.2-3.0 μm, y pueden ser peritricales o subpolares. Las colonias generalmente son blancas o color beige, circulares, convexas, semitraslúcidas u opacas y mucilaginosas, que miden de 2 a 4 mm de diámetro de los 3 a los 5 d de incubación en extracto de levadura manitol agar rojo congo (ELMARC) (Abd-Alla et al., 2012).

El estudio de la taxonomía de los rizobios se basa en varios aspectos como caracterización morfológica, bioquímica y fisiológica, entre otros, y no se pueden adelantar otros como eficiencia en la fijación de N, si no se ha demostrado que pertenecen al género Rhizobium e identificado sus características fenotípicas (Granda et al., 2014; Villanueva y Quintana, 2012).

Los estudios de caracterización morfológica, bioquímica o molecular en el género Rhizobium se han utilizado con diferentes y múltiples propósitos. Destacan los trabajos para evaluar su efectividad potencial (capacidad de fijar N₂) y capacidad infectiva (inducción de nodulación) (Ángeles-Núñez y Cruz-Acosta, 2015; Mendoza y Bonilla, 2014); diversidad genética (Aserse et al., 2012;Granda et al., 2009); resistencia a metales (Abd-Alla et al., 2012); taxonomía (Gauri et al., 2011; Wei et al., 2003); y para uso como bioinóculo (Cuadrado et al., 2009; Pérez et al., 2008).

Los estudios de caracterización morfológica de cepas de Rhizobium aisladas de nódulos de frijol común (Phaseolus vulgaris L.) han incluido las variables de velocidad de crecimiento, color, apariencia, tipo de borde y elevación de las colonias. Sosa et al. (2004) señalan que las colonias de Rhizobium se observan blancas o ligeramente rosadas, forman colonias circulares, son de forma convexa, semitraslúcidas y de crecimiento rápido. Sostienen que las bacterias del género Bradyrhizobium forman colonias circulares, secas, raramente traslúcidas, blancas, convexas, con tendencia a ser granulosas y de crecimiento lento, de 5 a 7 d. En Ecuador, Granda et al. (2013) investigaron la identidad de 45 aislados, 24 de los cuales presentaron características morfológicas pertenecientes al género Rhizobium, crecimiento rápido (2 a 3 d), coloración blanca o rosada, bordes lisos y ondulados y figura elevada y plana.

Por su parte Villanueva y Quintana (2012) estudiaron variables morfológicas en 10 aislados de rizobios nativos de Perú; señalan que seis de las muestras presentaron características referentes al género Rhizobium: consistencia gelatinosa, color blanquecino y velocidad de crecimiento entre 3 y 5 d. Keneni et al. (2010) hicieron una caracterización morfológica y bioquímica de cinco aislados nativos de Rhizobium procedentes de frijol común del norte de Etiopía y dos cepas de alta eficiencia en fijación. Los aislados nativos fueron tolerantes a concentraciones de 5 % de sal, mostraron mayor resistencia a antibióticos y mayor eficiencia en fijación biológica de nitrógeno. Los autores indicaron que los aislados no presentaron crecimiento a niveles de pH menores de 4.

Se han efectuado caracterizaciones morfológicas y bioquímicas de aislados de Rhizobium procedentes de otras especies de leguminosas. El estudio realizado por Carpio (2013 Com. Pers.)¹ con aislados de rizobios procedentes de cinco especies de leguminosas: chícharo (Pisumsativum L.), lupinos (Lupinus spp.), frijol común (Phaseolus vulgaris L.), haba (Vicia faba) y Vicia sp., encontraron que las bacterias asociadas a frijol, chícharo, haba y Vicia sp. presentaron características correspondientes al género Rhizobuim, mientras que los rizobios aislados en lupinos mostraron rasgos del género Bradyrhizobium. Por otra parte, Berrada et al. (2012) realizaron estudios de caracterización de 110 cepas de Rhizobium procedentes de leguminosas de grano y forrajeras. Encontraron que 81 de los aislados estudiados fueron de crecimiento rápido, 44 presentaron tolerancia a concentración de 2 % de NaCl e indicaron que la mayoría presentaron tolerancia a pH de 4 a 8.8, resistencia a antibióticos y a metales pesados (zinc, cobre, níquel y mercurio).

Con base en la diversidad genética de Phaseolus vulgaris silvestre en la región occidente de México (Lépiz-Ildefonso y Ramírez-Delgadillo, 2010) y la presencia de bacterias de Rhizobium asociadas a diferentes formas de frijol común, el objetivo del presente estudio fue la caracterización morfológica y bioquímica de una colecta de 20 cepas de Rhizobium aisladas de nódulos de raíces de plantas de frijol silvestre y domesticado.

MATERIALES Y MÉTODOS

Colecta de nódulos y purificación de las cepas de Rhizobium

La colecta de nódulos se realizó en seis localidades de los estados de Jalisco y Michoacán en los meses de septiembre y octubre de 2012 (Cuadro 1). Se extrajeron raíces de cuatro plantas en etapa de floración por sitio de colecta, a una profundidad de 20 cm; las raíces de cada planta se colocaron en una bolsa de plástico, la muestra se identificó y se registraron los datos de tipo de suelo, ubicación geográfica y tipo de vegetación. En el laboratorio se lavaron con agua; de cada raíz se seleccionaron de cinco a seis nódulos grandes, color rosado, superficie rugosa y con estrías claras y blancas; se lavaron en solución jabonosa y se desinfectaron con alcohol etílico al 70 % por 1 min; se enjuagaron con agua destilada estéril, se les transfirió a una solución de hipoclorito de sodio al 2 % durante 3 min y finalmente se lavaron cinco veces con agua destilada estéril para retirar el exceso de cloro (Rodríguez, 1993; Somasegaran y Hoben, 1994).

Los nódulos lavados y desinfectados de cada una de las raíces, se depositaron en un tubo de ensayo con 5 mL de agua destilada y se maceraron con una varilla de vidrio. De cada tubo se tomó una muestra de la suspensión y se sembró en estrías en cajas de Petri en medio extracto de levadura manitol agar rojo congo (ELMARC). Las cajas se incubaron a 28 ºC por un periodo de 5 d, para el crecimiento de las colonias de bacterias (Ángeles-Núñez y Cruz-Acosta, 2015; Vincent, 1970).

Para la purificación de los aislados, de cada caja se seleccionaron aquellas colonias blancas o ligeramente rosadas, con poca o nula absorción de rojo congo, característica de las bacterias de Rhizobium (Pérez et al., 2008). Las colonias seleccionadas se resembraron cinco veces en cajas de Petri siguiendo el mismo procedimiento. Para su mantenimiento y conservación, los aislados se sembraron en medio extracto de levadura manitol agar (ELMA) en tubos de ensayo a 4 ºC (Rodríguez, 1993).

Caracterización de los aislados

Caracterización morfológica

Se incluyeron seis variables a nivel de colonia: velocidad de crecimiento (d), forma (convexa, cupular), color (blanco, rosado), aspecto (traslúcido, opaco), borde (liso, rugoso) y textura (gomosa, acuosa) (Cuadro 1). Para la caracterización se siguió la metodología descrita por el CIAT (1988). Los aislados se sembraron en cajas de Petri con medio ELMA, en dos cajas por aislado. Las cajas se incubaron a 28 ºC por un periodo de 5 d hasta observar crecimiento de las bacterias y entonces se procedió a evaluar el comportamiento de las colonias.

Caracterización bioquímica

Se realizaron cuatro pruebas: tolerancia a pH, tolerancia a cloruro de sodio (NaCl), resistencia a metales pesados y resistencia a antibióticos (Cuadros 2, 3 y 4). En todos los casos y antes de cada prueba, los aislados se cultivaron en tubos de ensayo que contenían medio líquido extracto de levadura manitol (CELM) (Rodríguez, 1993), se colocaron en agitación a 200 rpm hasta alcanzar un crecimiento mínimo de 10⁶ UFC mL^-1, concentración medida por comparación con la escala de McFarland (1907). En todos los casos se utilizó 1.0 mL de la suspensión, dilución que se distribuyó uniformemente con una varilla de vidrio en las cajas de Petri con medio ELMA. Igualmente, después de la inoculación de las bacterias en las cajas con el tratamiento respectivo, se incubaron a 28 ºC por 5 d antes de registrar el resultado de la evaluación correspondiente. Se utilizaron tres cajas de Petri por tratamiento. La respuesta de los aislados de Rhizobium a las cuatro pruebas bioquímicas, se registró como positiva (+) cuando hubo crecimiento y negativa (-) cuando no lo hubo.

Para la evaluación por tolerancia a pH, se incluyeron nueve valores del factor: 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0 y 8.5. Los aislados se sembraron en cajas de Petri en medio ELMA, con el pH ajustado a los diferentes valores, con hidróxido de sodio (NaOH) y ácido clorhídrico (HCl) 1N. La tolerancia a cloruro de sodio (NaCl) se evaluó a concentraciones de 1, 2, 3, 5 y 10 %.

La prueba de resistencia a metales incluyó cuatro compuestos: sulfato de zinc (ZnSO₄·7H₂O), sulfato de magnesio (MgSO₄·7H₂O), cloruro de mercurio (HgCl2) y sulfato de cobre (CuSO₄·5H₂O) en tres concentraciones cada uno: 10, 50 y 100 (µg mL^-1). Una vez realizada la siembra de los aislados en cajas de Petri con medio ELMA, se colocaron los discos de papel filtro humedecido con las diferentes concentraciones de los metales. Los aislados se consideraron resistentes cuando ocurrió crecimiento (+) y sensibles cuando no lo hubo (-).

La evaluación por resistencia a antibióticos incluyó 12 productos contenidos en sensidiscos Gram negativo ll (BIO-RAD, modelo 71080580, México), cuyas concentraciones en µg fueron: trimetroprim-sulfametoxazol (25 µg), amikacina (30 µg), ampicilina (10 µg), levofloxacina (5 µg), cefalotina (30 µg), cefotaxima (30 µg), ceftriaxona (30 µg), cloranfenicol (30 µg), gentamicina (10 µg), netilmicina (30 µg), cepefime (30 µg) y nitrofurantoína (30 µg). Como en las anteriores evaluaciones, las cajas de Petri se incubaron por 5 d antes de proceder a la evaluación.

Análisis estadístico

La inspección y análisis de los datos de la caracterización morfológica, donde cada rasgo presenta dos opciones posibles en cada factor, se hizo directamente en la matriz de resultados. Con los datos de la caracterización bioquímica obtenidos en los 38 tratamientos producto de las combinaciones de cuatro factores (tolerancia a pH, tolerancia a NaCl, resistencia a metales pesados y resistencia a antibióticos) y los niveles probados, se realizó un análisis de agrupamiento de los 20 aislados mediante el coeficiente de correlación. Para el análisis, la respuesta positiva (+) que significa crecimiento del aislado, se calificó como 1, y la respuesta negativa (-) que significa ausencia de crecimiento, como 0.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Caracterización morfológica

Los resultados de la caracterización morfológica a nivel de colonia se muestran en el Cuadro 1. Las cepas mostraron diferencias en velocidad de crecimiento, forma, aspecto y textura, no así en color (todas blancas) ni borde (todas lisas). En velocidad de crecimiento, todas las cepas mostraron crecimiento rápido, entre 2 y 3 d. Once de ellas completaron su desarrollo en 2 d, incluidas seis provenientes de frijoles silvestres. En cuanto a la forma de las colonias, 14 cepas mostraron forma convexa y seis forma cupular. En aspecto, 12 cepas presentaron apariencia traslúcida y ocho opaca; fue notable que todos los aislados de la forma silvestre de frijol, mostraran aspecto traslúcido. En textura de colonias, 14 de los 20 aislados presentaron textura gomosa. Seis de las nueve cepas de la forma silvestre mostraron esta textura.

Los resultados de caracterización morfológica son similares a los reportados en la literatura (Granda et al., 2013; Keneni et al., 2010; Villanueva y Quintana, 2012) donde se consigna que las colonias de aislados de Rhizobium son de crecimiento rápido (2 a 3 d), blancas o ligeramente rosadas, forman colonias circulares, convexas y de aspecto traslúcido.

En vista de que todos los aislados presentaron color blanco y borde liso, que mostraron crecimiento rápido (1 a 3 d), aspecto traslúcido (60 %) y textura gomosa (70 %), además de tener en cuenta lo asentado en la literatura, se puede afirmar que los 20 aislados pertenecen a bacterias del género Rhizobium, y que las cepas procedentes del frijol silvestre y del domesticado son similares.

Caracterización bioquímica

Tolerancia a pH

Con excepción de cuatro cepas que no crecieron en pH de 4.5 a 5.5, 16 mostraron crecimiento en todos los niveles evaluados (Cuadro 2). Estos resultados muestran que las cepas estudiadas presentan tolerancia a pH ácido con valores hasta de 4.5. Resultados similares reportaron Cuadrado et al. (2009) y Marquina et al. (2011) al evaluar aislados de Rhizobium procedentes de frijol cómun; afirman que los aislados de crecimiento rápido pueden desarrollarse a partir de pH de 4.0.

Tolerancia a cloruro de sodio

Todas las cepas crecieron a 1 % de concentración, 15 de las 20 a 2 %, 13 a 3 % y solo Rhizojal VC2 a 5 % de concentración (Cuadro 2). Los resultados son similares a lo reportado en la literatura, donde se señala que el crecimiento bacteriano decrece al aumentar la cantidad de sal en el medio (Berrada et al., 2012; Cuadrado et al., 2009; Patil et al., 2014).

Resistencia a metales pesados

Todas las cepas fueron suseptibles a las concentraciones evaluadas de cloruro de mercurio y sulfato de cobre (Cuadro 3). De las 20 cepas, trece (siete de variedades domesticadas y seis de frijol silvestre) mostraron resistencia a sulfato de magnesio y dos de éstas (Rhizojal VC2 de frijol silvestre y Rhizojal ZGZ3 de frijol domesticado) a sulfato de zinc. Abd-Alla et al. (2012) consignaron resultados similares en los que hicieron referencia a tolerancia a Zn y susceptibilidad a Hg. En cambio, Berrada et al. (2012) reportaron que 110 aislados de diferentes leguminosas presentaron alta resistencia a diferentes concentraciones de Zn (10, 20, 40), Cu (10, 50, 100) y Hg (20, 25, 100) μg mL^-1. En la presente investigación, ningún aislado exhibió resistencia a cloruro de mercurio, ni a sulfato de cobre. Las diferencias podrían explicarse por las distintas concentraciones utilizadas entre los estudios y por las diferencias genéticas entre las cepas estudiadas.

Resistencia a antibióticos

Esta prueba mostró a 16 cepas como resistentes a la mayoría de los antibióticos utilizados; Rhizojal TP1 y Rhizomich CR2 procedentes de los alrededores del Lago de Chapala, fueron susceptibles a los 12 antibióticos ensayados (Cuadro 4). Keneni et al. (2010) evaluaron la resistencia de siete cepas de Rhizobium a seis antibióticos; todos mostraron resistencia a cloranfenicol y penicilina y dos mostraron resistencia a cloranfenicol, penicilina, estreptomicina y tetraciclina; además, afirman que los aislados nativos presentaron mayor resistencia a los antibióticos, que los introducidos. También Hernández et al. (2012), quienes estudiaron 12 cepas y seis antibióticos, reportaron que todas las cepas crecieron en presencia de tetraciclina, cloranfenicol, ampicilina y ácido nalidíxico.

Los resultados de la caracterización bioquímica que incluyó tolerancia a pH y a cloruro de sodio, resistencia a metales y resistencia a antibióticos, indican que las cepas estudiadas pertenecen al género Rhizobium.

Análisis de agrupamiento

El análisis de agrupamiento de las 20 cepas mediante coeficiente de correlación practicado con las 38 variables correspondientes a caracterización bioquímica, dio como resultado la formación de dos grupos principales, A y B, y dentro del grupo A, dos subgrupos A1 y A2 (Figura 1). Dentro de A integrado por 15 cepas, el subgrupo A1 con siete cepas, lo conformaron tres provenientes de frijol silvestre y cuatro de la forma domesticada; la mayoría de las cepas de este subgrupo mostró crecimiento en pH de 4.5, resistencia a metales y resistencia a los antibióticos ensayados. Hubo similitud de resultados entre las cepas Rhizojal VC1 y Rhizojal VC3, y Rhizojal MA1 y Rhizojal MA2, lo que podría indicar que se trata de la misma cepa en cada par, porque fueron colectadas y aisladas de plantas diferentes, pero en el mismo sitio.

Las ocho cepas del subgrupo A2 (cinco procedentes de frijol silvestre), mostraron crecimiento a pH de 4.5, a 3 % de NaCl, a las concentraciones de 10 y 50 μg mL^-1 de sulfato de magnesio y a 1 μg mL^-1 de sulfato de zinc, excepto Rhizojal ZGZ2. En este grupo destacan Rhizojal BH1, Rhizojal ZGZ2 y Rhizojal ZGZ3 por su resistencia a los 12 antibióticos probados. El alto coeficiente de correlación entre Rhizojal BH2 y Rhizojal BH3 indica que son cepas muy similares.

El grupo B constituido por cuatro cepas aisladas de frijol domesticado procedentes del área del Lago de Chapala, se distinguió por ser susceptible a pH ácido (4.5), a concentraciones bajas de sal (3 %) y a los antibióticos; además, mostraron similitud de resultados en cinco variables de caracterización morfológica: forma, color, aspecto, borde y textura (Cuadro 1). En el caso de Rhizojal VC2 colectado en raíces de frijol silvestre en el volcán Nevado de Colima, no mostró cercanía con ninguna otra cepa. Creció en todos los niveles de pH probados, fue el único que se desarrolló a la concentración de 5 % de NaCl y el único con resistencia a las concentraciones evaluadas de sulfato de zinc y sulfato de magnesio. Se requieren estudios adicionales para verificar si se trata de una especie diferente.

La caracterización morfológica y bioquímica de las cepas estudiadas, evidencian la variabilidad genética de Rhizobium en el occidente de México y alto potencial para seleccionar cepas de Rhizobium de crecimiento rápido, resistentes a factores adversos como acidez del suelo y a niveles moderados de salinidad y con resistencia a antibióticos. Esta afirmación se basa en lo expresado tanto por Hernández et al. (2012), como por Abera et al. (2015), quienes señalan que los factores de supervivencia, persistencia y competitividad confieren a los rizobios ventajas adaptativas para sobrevivir y competir con otras bacterias del suelo, lo que favorece la colonización de las raíces de las leguminosas y la fijación de nitrógeno atmosférico.

CONCLUSIONES

Los estudios de caracterización practicados a 20 cepas de bacterias, 11 procedentes de nódulos de frijol cultivado y nueve de frijoles silvestres de la región occidente de México, evidenciaron que se trata de bacterias del género Rhizobium. Las cepas exhibieron diferencias morfológicas y bioquímicas, y mostraron variabilidad fenotípica. Las cepas estudiadas presentaron diferencias marcadas de crecimiento en valores distintos de pH, en concentraciones de cloruro de sodio, en reacción a metales pesados y en respuesta a los antibióticos utilizados. Las cepas mostraron de manera general crecimiento rápido, tolerancia a valores de pH ácido, tolerancia a concentraciones moderadas de cloruro de sodio, susceptibilidad a metales pesados, y resistencia a antibióticos. La caracterización y estudios de agrupamiento de las 20 cepas de Rhizobium no mostraron diferencias morfológicas y bioquímicas entre cepas de poblaciones de frijol silvestre y de variedades domesticadas, con excepción de una cepa procedente de frijol silvestre del Nevado de Colima.

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Notas de autor

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