INTRODUCCIÓN

El silenciamiento por RNA es un sistema de regulación mediado por RNAs pequeños que causan la inhibición o supresión de moléculas de ácidos nucleicos a través de interacciones específicas. Este proceso está altamente conservado en organismos eucariotas, donde está presente en plantas, hongos y animales (Wang y Metzlaff, 2005).

Este fenómeno fue descubierto en plantas transgénicas de petunia (Petunia hybrida L.), donde la introducción de una copia foránea de un gen endógeno que se quería sobreexpresar resultó en la co-supresión de ambos, el transgén y el gen endógeno (Napoli et al., 1990; van der Krol et al., 1990). Posteriormente, en diferentes sistemas virales se demostró que, en contra del modelo propuesto, no era necesaria la expresión de proteínas virales para obtener resistencia frente al virus, sino que era suficiente con una secuencia viral no traducible (Lindbo y Dougherty 1992; van der Vlugt et al., 1992). La observación de que un transgén β-glucuronidasa (GUS) silenciado podía prevenir la acumulación viral de Potato virus X (PVX) portador de una secuencia GUS, indicaba que se trataba de un mecanismo de defensa antiviral específico de secuencia (English et al., 1996).

Otra evidencia que indicaba que se trataba de un mecanismo general de respuesta de la planta frente a la infección viral, fue el hallazgo de que en planta no sólo se encontrara resistencia frente a un virus inoculado inicialmente, sino también frente a otros virus que portaran secuencias homólogas (Ratcliff et al., 1997). El posterior descubrimiento de que los genomas virales codificaban proteínas supresoras de silenciamiento, capaces de bloquear o interferir con este proceso de silenciamiento por RNA, confirmó su implicación en defensa antiviral (Anandalakshmi et al., 1998; Kasschau y Carrington, 1998). La prueba inequívoca que explicaba la extrema especificidad de secuencia del proceso de silenciamiento por RNA fue el hallazgo de que en plantas que contenían un transgén silenciado, se acumularan RNAs pequeños de aproximadamente 24 nucleótidos (nt) de tamaño con secuencias idénticas a la del transgén (Hamilton y Baulcombe, 1999).

Para contrarrestar un mecanismo de defensa antiviral basado en el silenciamiento por RNA, los virus han evolucionado codificando una o varias proteínas supresoras de silenciamiento que bloquean distintos puntos de la cascada de silenciamiento antiviral (Anandalakshmi et al., 1998; Voinnet, 2005). Estas proteínas supresoras frecuentemente son multifuncionales, las cuales además de suprimir el silenciamiento antiviral, cumplen funciones indispensables para el ciclo vital del virus, como son: la proteína de cubierta, la proteína de movimiento, la replicasa, la proteasa, las proteínas implicadas en la transmisión viral y en la regulación de la transcripción (Csorba et al., 2009). Además, estos supresores frecuentemente están implicados en interacciones sinérgicas en infecciones mixtas, que pueden dar lugar a una acentuación de la sintomatología y en algunos casos a un aumento de los niveles de acumulación viral. La diversidad encontrada tanto a nivel estructural como funcional de estas proteínas, muestra la importancia de los estudios encaminados a conocer mejor el mecanismo de acción de estos supresores virales.

En este trabajo se ha llevado a cabo una revisión de los diversos mecanismos de supresión del silenciamiento antiviral en plantas de los supresores más representativos descritos hasta el momento, codificados por virus de ssRNA; así mismo, ya que estos supresores además de funcionar en defensa antiviral pueden interferir en procesos fisiológicos de la planta que dependen del silenciamiento por RNA, se ha abordado también el tema de su posible implicación en los procesos de patogénesis y sinergismo viral.

Mecanismos moleculares del silenciamiento por RNA en plantas

En plantas, el silenciamiento por RNA engloba una serie de procesos que pueden actuar a nivel transcripcional (transcriptional gene silencing, TGS) o post-transcripcional (post-transcriptional gene silencing, PTGS). Ambos procesos tienen en común el reconocimiento específico de secuencias de DNA o RNA por pequeñas moléculas de RNA. Este mecanismo está implicado en procesos tales como el mantenimiento de la integridad del genoma, la regulación de procesos del desarrollo y la defensa frente a ácidos nucleicos invasores, tales como transgenes, transposones y virus (Ruiz-Ferrer y Voinnet, 2009; Vaucheret, 2006; Voinnet, 2001).

El silenciamiento por RNA se induce por la presencia de moléculas de dsRNA que podrían derivar de la replicación viral, de repeticiones invertidas, de la transcripción convergente de transgenes y transposones, de loci endógenos con una alta estructura secundaria, o bien generarse por la acción de RNAs polimerasas dependientes de RNA (RDR) a partir de ssRNA. Estas moléculas son procesadas por RNasas de tipo III denominadas en plantas DCLs (Dicer-like), en pequeños RNAs (small RNAs, sRNAs) de doble hebra de entre 19 y 25 nt que presentan 2 o 3 nt protuberantes en el extremo 3' de ambas cadenas (Elbashir et al., 2001). DCL requiere de la acción de DRB (dsRNA binding protein), para que el procesamiento del dsRNA se produzca de un modo preciso y eficiente (Eamens et al., 2012a, b; Hiraguri et al., 2005). La metilación de los sRNAs generados mediada por la metiltransferasa HEN1 (Boutet et al., 2003), los protege de la degradación. Una de las hebras del sRNA es incorporada a un complejo de silenciamiento inducido por RNA (RNA induced-silencing complex, RISC) que contiene, entre otros componentes, una endonucleasa llamada Argonauta (AGO).

Una vez ensamblado, en el caso del PTGS (post-transcriptional gene silencing), este complejo es guiado por el sRNA hasta un mRNA diana de secuencia complementaria al que se une induciendo la inhibición de su traducción o su degradación. En el TGS (transcriptional gene silencing), este complejo es guiado hasta un DNA de secuencia complementaria al que se une e induce su metilación y el bloqueo de su transcripción. Existe un proceso de amplificación de la señal de silenciamiento mediado por RNA polimerasas dependientes de RNA (RDR), que resulta en la generación de nuevas moléculas de dsRNA que son procesadas en sRNAs secundarios (Figura 1).

En plantas existen tres rutas básicas del silenciamiento por RNA: 1) la ruta de los microRNA (miRNA), 2) la ruta de degradación mediada por pequeños RNAs interferentes (small interfering RNAs, siRNAs), y 3) la ruta de metilación del DNA mediada por RNA (RNA-directed DNA methylation, RdDM). En la ruta de los miRNAs, la transcripción de los genes MIR da lugar a un miRNA primario, que forma una estructura secundaria parcialmente plegada, que es procesada por DCL1, una de las cuatro proteínas DCL de Arabidopsis thaliana, para dar lugar a una estructura precursora tipo horquilla de la que serán escindidos los dúplex de miRNA de 21 a 24 nt (Kim, 2005).

Otros factores, como la proteína de dedo de zinc SERRATE y las proteínas de unión a dsRNA DRB1 o HYL1, también están implicadas en la biogénesis de los miRNAs. Los miRNAs juegan un papel crítico en el control del desarrollo de la planta porque reprimen o controlan la expresión de genes reguladores tales como los factores de transcripción. Los miRNAs de planta tienen principalmente como diana las regiones codificantes de los mRNAs y, aunque funcionan predominantemente mediante la acción de corte del RNA, se ha visto que también pueden actuar mediante represión traduccional (Brodersen et al., 2008). En la ruta de degradación mediada por siRNAs, dsRNAs de tamaño largo endógenos o exógenos, o estructuras en horquilla son procesados por DCL4 y DCL2 en siRNAs de 21 y 22 nt, respectivamente. El dsRNA largo endógeno precursor de esos siRNAs es sintetizado por la RNA polimerasa dependiente de RNA 6 (RDR6), una de las seis RDRs de A. thaliana, usando ssRNA como molde. Los siRNAs endógenos conocidos como trans-acting siRNAs (tasiRNAs) juegan un papel muy importante durante el desarrollo de la planta y en las respuestas a estrés; sin embargo, parece que una de las funciones principales de esta ruta es la defensa antiviral de la planta (ver el siguiente apartado).

Por su parte, la ruta RdDM juega un importante papel en el silenciamiento de transposones y elementos de DNA repetitivos, lo que mantiene la estabilidad e integridad del genoma (Haag y Pikaard 2011; Matzke et al., 2009). Esta ruta también parece tener un papel importante en la defensa de la planta frente a virus de DNA. Los siRNAs de 24 nt implicados en esta ruta son procesados por DCL3 a partir del dsRNA sintetizado por la RNA polimerasa IV dependiente de DNA (Pol IV) y RDR2 (Henderson et al., 2006; Xie et al., 2004). Aunque los detalles moleculares de la RdDM no están del todo claros, como resultado de su actuación, se produce la metilación de novo del DNA por mediación de la DNA metiltransferasa DRM2 (Cao y Jacobsen, 2002; Henderson et al., 2010), con lo que se inhibe la transcripción.

En plantas, la activación del silenciamiento en una célula induce el silenciamiento de la misma secuencia en células adyacentes y en tejidos distales. Así, se han descrito tres tipos de movimiento de la señal de silenciamiento que ocasionarían un silenciamiento a corta distancia, un silenciamiento local extensivo y un silenciamiento sistémico (Kalantidis et al., 2008). El movimiento de la señal de silenciamiento a través de la planta presenta un patrón similar al del movimiento viral, que se mueve célula a célula a través de los plasmodesmos, y a larga distancia a través del floema desde tejidos fuente a tejidos de demanda (Voinnet, 2008). Aunque no se conoce la naturaleza exacta de la señal de silenciamiento, los datos disponibles indican que se trata de un ácido nucleico (Molnar et al., 2010), y se han propuesto posibles modelos de como ocurre el mismo. Así, mientras la proteína RDR6 parece jugar un papel crucial en la amplificación de la señal y su movimiento a largas distancias (Schwach et al., 2005), DCL4, en las células acompañantes, estaría implicada en la generación de sRNAs de 21 nt que son capaces de moverse de 10 a 15 células más allá del límite del floema (Dunoyer et al., 2005). Estudios recientes han demostrado que tanto siRNAs como miRNAs tienen la capacidad de moverse de una célula a otra y alcanzar el tejido vascular (Melnyk et al., 2011).

Silenciamiento por RNA como mecanismo de defensa antiviral en plantas

En plantas, el silenciamiento por RNA también funciona como mecanismo de defensa antiviral (Baulcombe, 2004; Burgyán y Havelda, 2011). Las infecciones virales en plantas están asociadas con la acumulación de siRNAs virales (viral small interfering RNAs, vsiRNAs) que pueden, a su vez, actuar silenciando el propio genoma viral. Por esta razón, los virus son tanto inductores como dianas del silenciamiento por RNA. Mientras que en virus de DNA los vsiRNAs podrían provenir de dsRNAs generados durante la transcripción bidireccional de sus genomas (Chellappan et al., 2004), en virus de RNA los vsiRNAs podrían generarse a partir de dsRNAs sintetizados durante el proceso de replicación viral. En este último caso se ha propuesto también que la presencia de regiones altamente estructuradas del genoma podría constituir una fuente de generación de vsiRNAs (Molnár et al., 2005); sin embargo, estudios recientes han mostrado que la mayor parte de los vsiRNAs se generarían por la acción de RDR celulares; por lo tanto, su biogénesis sería similar a la descrita para los siRNAs endógenos (Díaz-Pendón et al., 2007; Donaire et al., 2008; García-Ruiz et al., 2010; Qi et al., 2009; Wang et al., 2010).

En A. thaliana, las cuatro proteínas DCL identificadas están involucradas en la biogénesis de vsiRNAs. En el caso de virus RNA, el papel esencial en defensa antiviral lo tienen DCL4 y DCL2 (Ding y Voinnet, 2007) que generan vsiRNAs de 21 y 22 nt, respectivamente. De las dos, DCL4 parece tener un papel dominante, porque los vsRNAs de 21 nt son generalmente más abundantes que los de 22 nt. Esta predominancia de DCL4 sobre DCL2 podría también deberse a un efecto más potente en silenciamiento antiviral de los vsiRNAs de 21 nt con respecto a los de 22 (Wang et al., 2011). En el caso de DCL3, aunque hay indicaciones que sugieren que puede contribuir en defensa antiviral, especialmente si DCL4 es inactivada (Díaz-Pendón et al., 2007; Donaire et al., 2008; García-Ruiz et al., 2010; Qu et al., 2008), esta contribución parece no ser muy relevante (Deleris et al., 2006; García-Ruiz et al., 2010). También la contribución de DCL1 a la generación de vsiRNAs parece ser minoritaria (Deleris et al., 2006; Dunoyer et al., 2005; García-Ruiz et al., 2010). En el caso de virus con genoma de DNA, las cuatro proteínas DCL están implicadas en la biogénesis de vsiRNAs (Blevins et al., 2006).

Los vsiRNAs generados se asocian con el complejo antiviral RISC (RNA-induced silencing complex) del que AGO (proteína argonuta) forma parte, en el que se produce el reconocimiento de las dianas virales y su corte. De entre los 10 miembros de AGO identificadas en A. thaliana, AGO1 parece ser el más importante en defensa antiviral, aunque también se ha descrito la participación de AGO2, AGO3, AGO4, AGO5 y AGO7 (Brosseau y Moffett, 2015; Chiu et al., 2010; Jaubert et al., 2011; Morel et al., 2002; Qu et al., 2008). Se ha propuesto que AGO1 formaría parte de una primera línea de defensa antiviral, mientras que otras proteínas AGO actuarían en una segunda fase (Harvey et al., 2011; Qu et al., 2008).

De los vsiRNAs producidos durante el proceso de silenciamiento, sólo una pequeña fracción resulta de la acción de corte de DCL sobre la diana inicial. Existe un proceso de amplificación de la señal de silenciamiento mediado por RDR, que resulta en la generación de vsiRNAs secundarios (Voinnet, 2008). De las seis proteínas RDR identificadas en A. thaliana, RDR1, RDR2 y RDR6 parecen estar implicadas en respuesta antiviral (Dalmay et al., 2000; Díaz-Pendón et al., 2007; Donaire et al., 2008; García-Ruiz et al., 2010; Mourrain et al., 2000; Qu et al., 2008). Entre ellas, el papel de RDR6 es especialmente importante, pues se ha observado que una disminución en la actividad de esta enzima, hace que aumente la susceptibilidad a un gran número de virus (Mourrain et al., 2000;Qu et al., 2005; Schwach et al., 2005).

En plantas, el silenciamiento inducido en una célula puede moverse célula a célula y a largas distancias para alcanzar tejidos distales. De este modo, si la señal de silenciamiento se propaga de un modo más rápido del que lo hace el virus, los tejidos distales estarán alertados y de este modo tendrán la capacidad de resistir a la invasión viral (Ding y Voinnet, 2007). El silenciamiento sistémico, cuya amplificación está mediada por RDR6, juega un papel muy importante en defensa antiviral, porque previene la invasión viral del meristemo (Schwach et al., 2005). Esta exclusión del meristemo es especialmente importante en defensa antiviral, porque puede facilitar tanto la recuperación de la planta como prevenir la transmisión por semillas.

Supresión viral del silenciamiento

Para contrarrestar el silenciamiento por RNA, los virus han evolucionado codificando en su genoma proteínas supresoras del silenciamiento. El primer supresor de silenciamiento viral descrito fue la proteína HCPro de potyvirus (Anandalakshmi et al., 1998; Kasschau y Carrington, 1998). Desde entonces distintas aproximaciones han permitido identificar un gran número de supresores virales (http://www.revistafitotecniamexicana.org/documentos/40-2/7a-cuadro1.pdf). Así, se ha propuesto que los virus de plantas codifican en su genoma al menos un supresor del silenciamiento, aunque en algunos casos codifican más de uno como ocurre en los géneros Closterovirus, Crinivirus y Begomovirus (Csorba et al., 2015; Díaz-Pendón y Ding, 2008). Los supresores del silenciamiento, incluso dentro de la misma familia o grupo viral, son muy diversos tanto en secuencia como en estructura. Esta alta diversidad sugiere que han evolucionado de manera independiente y que son el resultado de procesos evolutivos recientes (Ding y Voinnet, 2007).

Muchas de estas proteínas supresoras son multifuncionales; es decir, además de cumplir con las funciones del ciclo viral, interfieren con la ruta de silenciamiento del hospedero (Voinnet, 2005), aunque también han sido descritas proteínas supresoras cuya única función es la supresión del silenciamiento. Los mecanismos de acción de los supresores son tan diversos que pueden interferir en cualquier etapa de la ruta de silenciamiento. Así mismo, cada vez existen más casos en que se describe que un mismo supresor viral es capaz de interferir en distintas etapas de la ruta de silenciamiento, lo que acentúa la efectividad de la supresión. Otra estrategia usada por los virus de plantas para suprimir de un modo más efectivo el silenciamiento por RNA es, como se ha comentado arriba, la producción de varias proteínas supresoras que podrían actuar en distintos puntos de la ruta de silenciamiento y complementarse entre sí.

Mecanismos moleculares de supresión del silenciamiento

Los detalles de los mecanismos moleculares subyacentes a la actividad específica de los supresores virales se conocen en pocos casos. En general, actúan sobre moléculas de RNA relacionadas con la ruta o interaccionan con los componentes proteicos de ésta ( http://www.revistafitotecniamexicana.org/documentos/40-2/7a-cuadro1.pdf).

Entre los distintos mecanismos de acción descritos para supresores virales de silenciamiento se encuentran:

Unión a dsRNA. Dado el papel clave que los dsRNAs juegan en la ruta de silenciamiento, se espera que cualquier mecanismo que impida su actuación, comprometa la efectividad de la misma. De este modo, uno de los mecanismos de acción más comunes de los supresores de silenciamiento es la unión a dsRNAs (Lakatos et al., 2006; Mérai et al., 2006). Depende de si se unen a dsRNAs de tamaño largo o de tamaño corto, se afectarán distintas etapas de la ruta; de este modo si el supresor se une a dsRNAs de tamaño largo, la enzima Dicer no podrá acceder a su sustrato y la digestión del mismo se verá afectada, mientras que la unión a dsRNAs pequeños (siRNAs) puede impedir que éstos se carguen al complejo RISC, y se inhiba por lo tanto esta etapa de la ruta.

Entre el grupo de supresores que se unen a dsRNAs de tamaño largo se encuentran la proteína P14 del aureusvirus (género Aureusvirus, familia Tombusviridae) Photos latent virus (PoLV), la proteína P38 del carmovirus (género Carmovirus, familia Tombusviridae) Turnip crinkle virus (TCV) (Mérai et al., 2006), y la proteína NSs del tospovirus (género Tospovirus, familia Bunyaviridae) Tomato spotted wilt virus (Schnettler et al., 2010). Estos supresores también son capaces de unir siRNAs, y representan la estrategia más común utilizada por las proteínas supresoras de silenciamiento de los virus de plantas (Chapman et al., 2004; Csorba et al., 2007; Goto et al., 2007; Kurihara et al., 2007; Martínez-Turiño y Hernández, 2009; Mérai et al., 2006; Schnettler et al., 2010). Entre las evidencias experimentales que apoyan que la unión a siRNAs interferiría con su carga en el complejo RISC, se encuentran las descritas para las proteínas p19 de tombusvirus (género Tombusvirus, familia Tombusviridae), p21 de closterovirus (género Closterovirus, familia Closteroviridae), NS3 de tenuivirus (género Tenuivirus), HCPro de potyvirus (género Potyvirus, familia Potyviridae) y p122 de tobamovirus (género Tobamovirus, familia Virgaviridae) (Csorba et al., 2007; Hemmes et al., 2007; Lakatos et al., 2006).

Como consecuencia de la unión del supresor a siRNAs, se interferiría en la metilación de los mismos por parte de la enzima HEN1, y afectaría así su estabilidad (Csorba et al., 2007; Lózsa et al., 2008; Vogler et al., 2007). Probablemente, el supresor mejor caracterizado entre los que unen siRNAs es la proteína p19 de tombusvirus (Silhavy et al., 2002). Estudios cristalográficos han mostrado que p19 forma un homodímero que selecciona específicamente siRNAs de 21 y 22 nt de tamaño (Vargason et al., 2003; Ye et al., 2003). El secuestro de siRNAs por parte de p19, bloquearía la formación de complejos RISC activos (Lakatos et al., 2006) e interferiría en el movimiento sistémico de la señal de silenciamiento (Molnar et al., 2010). Una estrategia totalmente distinta a la unión a siRNAs, aunque con el mismo resultado, es llevada a cabo por la proteína supresora RNasa III del crinivirus Sweet potato chlorotic stunt virus (SPCSV). Así, el corte de los siRNAs virales de 21 a 24 nt en productos de 14 nt mediado por la actividad endonucleasa de la proteína RNasa III, hace que éstos sean inactivos sin poder ser incorporados en el complejo RISC (Cuellar et al., 2009).

Interferencia con DCL. Los supresores virales que actúen directamente inhibiendo la maquinaria enzimática implicada en el procesamiento de dsRNAs, actuarán afectando la eficiencia de corte de DCL. Así, el factor DRB4 (dsRNA binding protein 4), que se requiere para el procesamiento de vsiRNAs mediado por DCL4, constituye la diana de varios supresores virales que se unen a él, y lo inhibirían. Como consecuencia de la interacción con este factor auxiliar de DCL4, se inhibe la formación de vsiRNAs de 21 nt (Deleris et al., 2006; Haas et al., 2008; Hiraguri et al., 2005; Qu et al., 2008; Shivaprasad et al., 2008). Otra estrategia que también resultaría en la interferencia de la acción de corte de DCL, es la utilizada por el dianthovirus (género Dianthovirus, familia Tombusviridae) Red clover necrotic mosaic virus (RCNMV). Así, la incorporación de DCL en el complejo de replicación de RCNMV conduciría a su inhibición (Takeda et al., 2005).

Interacción con proteínas AGO. El bloqueo de complejos RISC funcionales puede llevarse a cabo por medio de la unión directa a la unidad catalítica AGO (Zhang et al., 2006), su desestabilización o degradación (Baumberger et al., 2007; Bortolamiol et al., 2007; Pazhouhandeh et al., 2006). La primera proteína supresora en la que se describió la unión a AGO1 y AGO4 in vivo fue la proteína 2b del cucumovirus (género Cucumovirus, familia Bromoviridae) Cucumber mosaic virus (CMV) (González et al., 2010; Hamera et al., 2012; Zhang et al., 2006). Así, el que la interacción con AGO1 resulte en la inhibición de la actividad de corte de AGO1 (Zhang et al., 2006), sugiere que podría estar implicada en la prevención de la amplificación y dispersión de vsiRNAs (Goto et al., 2007; Zhang et al., 2006). Por su parte, la interacción con AGO4 que actúa uniendo siRNAs de 24 nt de origen endógeno que participan en RdDM, reduciría el acceso de los siRNAs a su diana endógena y modularía, de este modo, la transcripción de genes del hospedero en beneficio del virus (Hamera et al., 2012).

Por otra parte, la proteína supresora P0 de polerovirus (género Polerovirus, familia Luteoviridae), contiene un dominio tipo F-box, típico de factores celulares relacionados con la ubiquitinación y la degradación de proteínas, que tiene como diana AGO1 y cuyo papel sería promover su degradación (Baumberger et al., 2007; Bortolamiol et al., 2007; Csorba et al., 2010; Pazhouhandeh et al., 2006). En el caso del nepovirus (género Nepovirus, familia Secoviridae) Tomato ringspot virus (ToRSV), la proteína supresora CP se uniría a AGO1 para promover su degradación por autofagia (Karran y Sanfaçon, 2014) y como consecuencia suprimir su actividad inhibidora durante la traducción. Por su parte, la proteína p25 del potexvirus (género Potexvirus, familia Flexiviridae) PVX también interacciona físicamente con AGO (AGO1, 2, 3 y 4) y promueve su degradación a través de una ruta dependiente del proteosoma (Chiu et al., 2010). Estudios recientes han puesto de manifiesto la existencia de un nuevo tipo de interacción con AGO1 a través de repeticiones aminoacídicas del tipo GW/WG (glicina/triptófano). Este tipo de repeticiones son típicas de proteínas celulares que intervienen en el ensamblaje y funcionamiento de los complejos RISC (Karlowski et al., 2010), y los supresores que las contienen pueden interferir por competencia en la formación de novo de RISC o en su actividad (Azevedo et al., 2010; Giner et al., 2010).

Además de estos dos primeros casos descritos para la proteína p38 del carmovirus TCV y la proteína P1 del ipomovirus (género Ipomovirus, familia Potyviridae) Sweet potato mild mottle virus (SPMMV), se ha descrito que esta estrategia es utilizada también por la proteína p37 del carmovirus Pelargonium line pattern virus (PLPV). En este caso, se ha demostrado que estos dominios GW además de implicados en la unión a AGO1, también lo están en la unión a siRNAs, y ambas actividades son esenciales para que p37 pueda ejercer su actividad supresora (Pérez-Cañamás y Hernández, 2015). Resultados de este mismo trabajo también muestran que los dominios GW/WG de TCV p38, aparte de implicados en la interacción con AGO1, son necesarios para que se mantengan sus propiedades de unión tanto a siRNAs como a dsRNAs de tamaño largo. Estos resultados sugieren que ambas funciones podrían actuar de modo cooperativo; durante la interacción del supresor con AGO se incrementaría el secuestro de dúplex de siRNAs, e interferiría de este modo con la actividad de RISC.

Modulación de la homeostasis de AGO1. Aunque recientemente descrito, este mecanismo de acción basado en la modulación de la expresión génica del hospedero a nivel transcripcional, podría ser una estrategia ubicua en las interacciones virus-planta. AGO1, como se ha comentado anteriormente, es uno de los componentes más importantes de la ruta de silenciamiento implicado en defensa antiviral, cuya homeostasis depende de la expresión de miR168 (Rhoades et al., 2002). Resultados recientes muestran que durante la infección por tombusvirus se produce una inducción de la transcripción de AGO1 como parte del arsenal de respuestas antivirales de la planta. Para contrarrestar un mecanismo de defensa basado en AGO1, el supresor p19 promueve la inducción transcripcional de miR168, que resulta en la disminución de los niveles de expresión de AGO1 (Várallyay et al., 2010). Además de presentarse en la infección por tombusvirus, este fenómeno ha sido observado en el caso de otras infecciones virales (Du et al., 2011; Várallyay y Havelda, 2013).

Interferencia en la amplificación de siRNA secundarios. Las proteínas RDR del hospedero, en especial RDR1 y RDR6, están implicadas en la amplificación del silenciamiento y en la dispersión de la señal sistémica del mismo mediante la síntesis de vsiRNAs (Schwach et al., 2005); por lo tanto, la supresión de la actividad RDR puede constituir un punto clave dónde actuar para el supresor, porque al interferir en la amplificación del silenciamiento, la replicación y dispersión viral se verían favorecidas. Entre las proteínas supresoras que actúan en este punto se encuentra la proteína V2 del geminivirus (género Begomovirus, familia Geminiviridae) Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), que interacciona directamente con SGS3, el cofactor de RDR6, y bloquea de este modo la amplificación del silenciamiento (Glick et al., 2008). Estudios in vitro realizados con este mismo supresor han mostrado que V2 compite con SGS3 por dsRNAs que contengan extremos 5´ protuberantes, que podría constituir un intermediario de RDR6/SGS3 en la amplificación de vsiRNAs (Fukunaga y Doudna, 2009; Kumakura et al., 2009).

De igual modo, la proteína TGBp1 de potexvirus inhibe la síntesis de dsRNA dependiente de RDR6/SGS3 (Okano et al., 2014). También, el supresor βC1, codificado por el DNA satélite de Tomato yellow leaf curl China virus (TYLCCNV) interacciona con el supresor endógeno rgsCaM, una proteína celular relacionada con la calmodulina, en Nicotiana benthamiana, y reprime la expresión de RDR6 y por lo tanto la producción de siRNAs secundarios (Li et al., 2014). Ensayos de expresión transitoria en N. benthamiana mostraron que los supresores HCPro del potyvirus Sugarcane mosaic virus (SCMV) y 2b del cucumovirus Tomato aspermy virus (TAV), están implicados en la reducción de los niveles de acumulación de mRNA de RDR6 (Zhang et al., 2008). Del mismo modo, el supresor Pns10 del phytoreovirus (género Phytoreovirus, familia Reoviridae) Rice dwarf phytoreovirus (RDV) reduce los niveles de expresión de RDR6, y favorece la invasión viral de los ápices (Ren et al., 2010). También la proteína 2b de cucumovirus evita la dispersión de la señal de silenciamiento a larga distancia (Guo y Ding, 2002), al inhibir la producción de siRNAs secundarios (Wang et al., 2010). Es notorio por lo tanto que una actividad supresora centrada en RDR6 es una estrategia ampliamente utilizada por distintos virus que bloquea de un modo efectivo el silenciamiento antiviral.

Interacción con reguladores endógenos de la ruta de silenciamiento. Algunos supresores modulan una respuesta defensiva por parte de la planta basada en el silenciamiento por RNA, mediante su actuación sobre reguladores endógenos de la ruta de silenciamiento. Entre ellos se encuentra la proteína AL2 de geminivirus que inhibe a la enzima ADK (Adenosina kinasa) (Wang et al., 2003), implicada en procesos de metilación. Debido a que una parte de la respuesta defensiva contra estos virus implica la metilación de sus genomas, la inhibición de ADK, indirectamente, conseguiría bloquear el proceso de metilación (Wang et al., 2005). Debido a que para este grupo de virus de DNA es muy importante evitar la metilación de sus genomas, la interacción e inhibición de otra enzima implicada en el ciclo de metilación como SAHH (S-adenosil homocisteína hidrolasa), sería el factor endógeno sobre el que actuaría el supresor βC1 codificado por el DNA satélite de Tomato yellow leaf curl China virus (TYLCCNV) (Yang et al., 2011). De manera interesante, la proteína de geminivirus mencionada en primer lugar, AL2, también actúa induciendo la expresión e interacciona con la proteína celular rgs-CaM (Chung et al., 2014).

Otro ejemplo de factor endógeno que parece ser diana de diversos supresores no relacionados, es el factor transcripcional inducible por etileno (RAV2) (Endres et al., 2010). En el caso del Papaya ringspot virus (PRSV) la proteína supresora HCPro interacciona con calreticulina y modula de este modo la respuesta defensiva antiviral a través de la ruta de señalización del calcio (Shen et al., 2010b). Por su parte la proteína HCPro de los potyvirus Potato virus A (PVA), Potato virus Y (PVY) y Tobacco etch virus (TEV) interacciona con una proteína asociada al microtúbulo (HIP2), a través de su región altamente variable (HVR). Así, mientras que la reducción de HIP2 está asociada con una disminución de los niveles de acumulación viral, mutaciones en el dominio HVR de HCPro provocan una inducción sistémica mediada por etileno y ácido jasmónico de genes de defensa de la planta y necrosis (Haikonen et al., 2013a, b).

Supresores virales como determinantes de patogenicidad

Sinergismo viral

El que un virus sea capaz de replicarse en un hospedero, no necesariamente va unido al hecho de que sea patogénico. La patogénesis tiene lugar cuando una infección viral afecta a la fisiología del hospedero lo que causa alteraciones en el desarrollo y otras manifestaciones fenotípicas, que son consideradas como síntomas de la enfermedad (Culver y Padmanabhan, 2007; García y Pallás, 2015; Mandadi y Scholthof, 2013; Pallás y García, 2011). Como se ha visto, los virus, para infectar con éxito una planta, deben hacer frente a una repuesta defensiva basada en el silenciamiento por RNA, proceso que además de funcionar como defensa antiviral está implicado en la regulación de diversos procesos celulares. Para ello, la estrategia más comúnmente utilizada es la de codificar en su genoma proteínas supresoras del silenciamiento (Li y Ding, 2006). Estos supresores, además de funcionar en defensa antiviral, pueden interferir en procesos fisiológicos de la planta que dependen del silenciamiento por RNA, y esta interferencia contribuir a la patogénesis. Así, muchos supresores virales suelen ser considerados como los principales determinantes de patogenicidad tanto en infecciones simples como en infecciones mixtas sinérgicas.

Una de las rutas endógenas de silenciamiento por RNA en planta que más frecuentemente se ve afectada es la de los miRNAs. Como se ha visto, los miRNAs regulan negativamente importantes factores reguladores implicados en procesos de desarrollo, homeostasis de nutrientes y respuestas a estrés (Carrington y Ambrós, 2003; Pasquinelli y Ruvkun, 2002; Zhang et al., 2010). Es, por lo tanto, concebible que los supresores puedan ocasionar alteraciones en el desarrollo de procesos, tales como la división celular, la formación de hojas y el desarrollo de la flor, mediante la interferencia en la expresión y la función de los miRNAs, y que estas interferencias puedan resultar en el desarrollo de síntomas de enfermedad (Kasschau et al., 2003). De acuerdo con esto, plantas transgénicas que expresan proteínas supresoras de silenciamiento, a menudo muestran fenotipos similares a los síntomas virales (Chapman et al., 2004; Chellappan et al., 2005; Jay et al., 2011). Muchos de los supresores de silenciamiento que actúan secuestrando vsiRNAs, pueden interferir en estas rutas endógenas al inhibir su papel regulador. Como ejemplo se encuentra el caso del miRNA167 que resulta en la alteración de la regulación de su diana AUXIN RESPONSE FACTOR 8, y que parece ser especialmente relevante porque es el principal factor implicado en la alteración del desarrollo causada por al menos tres proteínas supresoras, HCpro de potyvirus, p19 de tombusvirus y p15 de pecluvirus (género Pecluvirus, familia Virgaviridae) (Jay et al., 2011).

También los genes R del tipo NBS-LRR están regulados negativamente por miRNAs para evitar que una expresión incontrolada dispare reacciones autoinmunes deletéreas. Es posible, por lo tanto, que la inactivación de esos miRNAs por los supresores resulte en un aumento de los niveles de expresión de los genes R lo que causaría síntomas de enfermedad como la necrosis letal (Shivaprasad et al., 2012; Wang et al., 2012b; Weber et al., 2004). La unión e inactivación de otros componentes de la ruta de silenciamiento como las proteínas AGO, estrategia comúnmente utilizada por las proteínas supresoras, puede también producir alteraciones en el desarrollo, como es el caso de la proteína 2b de CMV (Zhang et al., 2006) y de la proteína TGBp1 del carlavirus (género Carlavirus, familia Flexiviridae) Plantago asiatica mosaic virus (PlAMV) (Okano et al., 2014).

Es importante remarcar que los supresores pueden producir efectos patogénicos que no dependen directamente de su capacidad para suprimir el silenciamiento (Du et al., 2014). Como ejemplo se pueden citar, en el caso de geminivirus, el de la proteína supresora βC1 codificada por el DNA satélite asociado con TYLCCV, y el de la proteína C2 que actúan inhibiendo la ruta del ácido jasmónico (Lozano-Durán et al., 2011; Yang et al., 2008). Otros ejemplos de interacción de supresores con factores del hospedero que pueden tener un impacto en patogénesis viral son los propuestos para la interacción de la proteína supresora p6 del caulimovirus (género Caulimovirus, familia Caulimoviridae) Cauliflower mosaic virus (CaMV) con componentes implicados en la ruta de señalización del etileno (Geri et al., 2004), el de la interacción del supresor 2b de CMV con una catalasa del hospedero (Inaba et al., 2011) o el de la interacción del supresor HCpro de PVA con la proteína asociada al microtúbulo HIP2 (Haikonen et al., 2013b). También, una función incorrecta del proteosoma como consecuencia de la interacción con el supresor HCpro podría considerarse como otro factor que contribuye al incremento de la patogenicidad asociado a la actividad de una proteína supresora (Pacheco et al., 2012).

Dada la importancia de la supresión del silenciamiento por RNA para la supervivencia viral, es razonable considerar que los supresores virales podrían ser diana de mecanismos de defensa alternativos que podrían causar importantes síntomas de enfermedad (García y Pallás, 2015; Pallás y García, 2011; Wang et al., 2012b). De hecho, algunos supresores como la proteína p6 de CaMV en Nicotiana cleveladii, (Király et al., 1999), la proteína p19 de TBSV (Chu et al., 2000) y 2b de TAV (Li et al., 1999) en tabaco (Nicotiana tabacum), o la proteína CP de TCV en A. thaliana (Ren et al., 2000), han sido descritas como inductoras de respuestas necróticas locales o sistémicas similares a las mediadas por los genes R. También la proteína HCpro de TEV induce una débil respuesta específica que estimula la resistencia de la planta frente a diversos patógenos (Pruss et al., 2004). Aunque ninguna de estas respuestas es capaz de bloquear completamente la infección viral, son capaces de condicionar el desarrollo de síntomas.

Ya que diferentes supresores de silenciamiento actúan con mecanismos distintos que afectan a diversas etapas de la ruta de silenciamiento por RNA, no es sorprendente que en infecciones donde virus de diferentes familias se mezclan se produzca una acentuación de la sintomatología, lo que puede inducir mayores niveles de acumulación viral que en infecciones individuales. Este fenómeno es conocido como sinergismo viral. La mayoría de los estudios de sinergismo viral implican a un virus del género Potyvirus. Entre ellos, el caso mejor estudiado es el de la interacción PVX-PVY en Nicotiana tabacum, donde se produce tanto una acentuación de la sintomatología como un incremento en los niveles de acumulación de PVX (González-Jara et al., 2004; Pruss et al., 1997; Vance et al., 1991). El incremento en la patogenicidad observado cuando el supresor HCpro fue expresado a partir de un virus heterólogo, mostró que ésta era la secuencia implicada en la interacción sinérgica (Pruss et al., 1997); sin embargo, cuando el hospedero utilizado fue N. benthamiana no se observó un incremento en los niveles de acumulación de PVX en plantas co-infectadas con los potyvirus PVY, TEV o Plum Pox virus (PPV), a pesar de los severos síntomas observados, donde la aparición de lesiones necróticas sistémicas en hojas y tallos, conducía a la muerte de la planta (González-Jara et al., 2004, 2005).

En este sentido, se ha sugerido que el sinergismo entre PVX y potyvirus es dependiente del hospedero (González-Jara et al., 2004). De hecho, un estudio reciente en este mismo sistema ha propuesto el posible mecanismo implicado en esta interacción sinérgica. De este modo, se ha visto que la presencia del potyvirus, aunque no produce ningún efecto a nivel del RNA genómico de PVX, ayuda a la estabilización de los RNAs subgenómicos lo que permite que se alcance un nivel umbral de expresión de la proteína p25 de PVX, que sería de este modo reconocida por un posible gen R presente en N. benthamiana. Este reconocimiento es el que dispararía la respuesta que desencadenaría los síntomas observados de necrosis sistémica (Aguilar et al., 2015). De modo general, en las múltiples interacciones sinérgicas descritas en las que un potyvirus está implicado, los niveles de acumulación de potyvirus tales como PVY, TEV, Tobacco vein mottling virus (TVMV), Zuchini yellow mosaic virus (ZYMV), Pepper mottle virus (PepMoV) o Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV), no se ven afectados, mientras que los del virus heterólogo aumentan (Fukuzawa et al., 2010; Murphy y Bowen, 2006; Pruss et al., 1997; Taiwo et al., 2007; Vance et al., 1995; Zeng et al., 2007).

La capacidad que tienen los virus de planta de causar infecciones sinérgicas en diferentes cultivos tiene implicaciones biológicas, epidemiológicas y económicas. El incremento de la multiplicación de uno o ambos virus implicados N. benthamiana, puede alterar la gama de hospederos o la tasa de transmisión por vectores (Elena, 2011), con las impredecibles consecuencias que ello ocasionaría. Como ejemplo se encuentra el caso de la ruptura de resistencia observada en plantas de tomate co-infectadas con ToCV y el tospovirus Tomato spotted wild virus (TSWV) (García-Cano et al., 2006), el de CMV en plantas de pepino (Cucumis sativus) co-infectadas con ZYMV (Wang et al., 2004) y el de un número de virus de batata (Ipomoea batatas L.) simultáneamente infectada con el crinivirus SPCSV (Karyeija et al., 2000; Mukasa et al., 2006; Untiveros et al., 2007). A pesar de las serias implicaciones biológicas y epidemiológicas que tienen estas interacciones sinérgicas, los mecanismos moleculares implicados en las mismas apenas se conocen.

Agradecimientos

Yazmín Landeo-Ríos fue beneficiaria de una beca predoctoral MAEC/AECID del Ministerio de Asuntos Exteriores y Cooperación de España. M. Carmen Cañizares fue beneficiaria de un contrato I3P (I3P-PC2004L) del CSIC (España) con la ayuda del Fondo Social Europeo (FSE). Este trabajo fue financiado por los proyectos AGL2010-22287-C02-01/AGR y AGL2013-48913-C2-1-R del Ministerio de Economía y Competitividad de España, co-financiado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional FEDER. Jesús Navas-Castillo y Enrique Moriones son miembros del Grupo de Investigación AGR-214, financiados parcialmente por la Consejería de Economía, Innovación y Ciencia, Junta de Andalucía, España, co-financiado por FEDER y FSE.

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Notas de autor

Autor para correspondencia (carmen.canizares@eelm.csic.es)