Diagnóstico molecular en biopsias de sarcoma de Ewing y rabdomiosarcomas pediátricos: experiencia en el Hospital de Niños Dr. Ricardo Gutiérrez

Molecular diagnosis applied to Ewing's sarcoma and alveolar rhabdomyosarcoma biopsies: experience at the "Dr. Ricardo Gutiérrez" Children's Hospital, Buenos Aires, Argentina

La patología oncológica es poco frecuente en la edad pediátrica, sin embargo, es la primera causa de muerte por enfermedad en el grupo etario de 5 a 15 años, por lo cual el desarrollo de estrategias diagnósticas y abordajes terapéuticos de gran especificidad son una necesidad. Según el Registro Oncopediátrico Hospitalario Argentino (ROHA), cada año, alrededor de 1322 niños son diagnosticados con cáncer, con una tasa de incidencia anual de alrededor de 130 casos por millón de niños menores de 15 años. Los diagnósticos más frecuentes son: leucemias (37 %), tumores del Sistema Nervioso Central (SNC), intraespinales (19 %) y linfomas (12 %), seguidos por tumores de partes blandas (6 %; dentro de este grupo, un 48 % corresponde a rabdomiosarcomas -RMS-), neuroblastomas (5,7 %), tumores renales (4,8 %) y óseos (4,7 %; dentro de este grupo, el sarcoma de Ewing (SE) corresponde al 33 %). Del total de niños incluidos en el ROHA, el 74 % fueron registrados por hospitales públicos, 16 %, por centros privados y 10 %, por otras fuentes (registros poblacionales, servicio de patología, certificados de defunción, etc.). El Hospital de Niños Dr. Ricardo Gutiérrez como reflejo de estos datos y como centro de referencia recibe la demanda de atención y de diagnóstico de gran parte de los casos derivados.¹

El SE se presenta como un tumor óseo, en el 80 % de los casos (con mayor incidencia en pelvis, fémur, tibia y costillas), o de partes blandas, en el 10 a 20 % de las ocasiones (predominantemente en pared torácica, glúteos, cavidades pleurales y músculos cervicales), que afecta principalmente a niños, adolescentes y adultos jóvenes con una incidencia de 1,5 casos por millón a nivel global.² El 85 % de los SE clásicos presentan una translocación recurrente t(11;22) (q24;q12), la cual ocasiona la fusión del gen EWSR1 con el gen FLI1. El EWSR1 codifica una proteína de unión a ARN involucrada en la transcripción del ADN y FLI1 es miembro de una gran familia de factores de transcripción de ADN que contiene dominios de ETS altamente conservados. Sin embargo, la variabilidad en la ubicación del punto de ruptura lleva la transcripción de ARNs de fusión diversos que se traducen en proteínas quiméricas de diferente tamaño y con actividad anómala. En la mayoría de los casos, el rearreglo cromosómico se presenta entre los intrones 7 u 8 del gen EWSR1 y los intrones 5 o 4 del gen FLI1, lo cual origina la fusión entre el exón 7 del gen EWSR1 con el exón 6 del gen FLI1 (transcripto de fusión tipo 1: 50 % de los casos) o con el exón 5 del gen FLI1 (transcripto de fusión tipo 2: 27 % de los casos). En la mayoría de los casos restantes no tipo 1/ no tipo 2, la porción EWSR1 del transcripto se extiende hasta el exón 10. Ocasionalmente, se pueden observar isoformas de fusión más cortas que carecen de los exones 6, 7 y 8 de FLI1.^3,4

Los genes de fusión generan la transcripción de factores quiméricos aberrantes que alteran la expresión génica. EWSR1 proporciona un poderoso dominio de activación, que resulta en la alteración de vías de señalización moleculares necesarias para la proliferación y diferenciación celular.⁵ La oncoproteína EWSR1-FLI1 funciona como un factor de transcripción aberrante, sin embargo, alrededor del 10 % de los SE muestran translocaciones análogas y genes de fusión que involucran al gen EWSR1 y a un miembro de la familia de factores de transcripción ETS.

Por otra parte, el RMS es el sarcoma de partes blandas más frecuente. Representa el 5 % de todos los cánceres pediátricos y es el tercer tumor sólido extracraneal más frecuente luego del neuroblastoma y el tumor de Wilms.⁶ El rabdomiosarcoma alveolar (RMSA) y el embrionario (RMSE) constituyen los dos principales subtipos histopatológicos. El RMSE es un tumor de niños pequeños, con una distribución principalmente axial y se presenta en sitios desprovistos de músculo esquelético maduro. El RMSA se presenta comúnmente en tejidos blandos de las extremidades. A pesar de estos perfiles tan diferentes, existen casos complejos de RMSE y RMSA que se superponen tanto clínica como morfológicamente.⁷ Estos datos evidencian que la evaluación morfológica resulta insuficiente para el diagnóstico diferencial de ambas entidades y su correcta clasificación es indispensable para la asignación de riesgo y para seleccionar el régimen terapéutico apropiado, ya que cada uno de ellos tiene un protocolo de quimioterapia diferente. La identificación de las translocaciones recurrentes t (2;13) (q35;q14) y t(1;13)(p36;q14) y sus transcriptos de fusión asociados entre los genes PAX3.FOXO1 . PAX7.FOXO1 se observa en el 80 % de los casos de RMSA: en general, PAX3-FOXO1 se halla en el 60 % de los casos y PAX7-FOXO1, en el 20 % restante.^8,9 Se ha demostrado que el status de fusión PAX-FOXO1 es un marcador de peor pronóstico de sobrevida libre de eventos (SLE).^10,11,12

La mayoría de los sarcomas se tratan aún según estándares tradicionales¹³; no obstante, los marcadores moleculares vinculados a su patogénesis han allanado el camino para un diagnóstico más preciso, además de proporcionar la oportunidad de explorar otras estrategias terapéuticas..

La identificación de estos marcadores moleculares en la práctica clínica se basa sobre dos técnicas, principalmente: la Hibridación In Situ Fluorescente (FISH) y la reacción en Cadena de la Polimerasa a partir de retrotranscripción (RT-PCR); ambas se complementan y constituyen importantes herramientas que permiten definir con precisión las líneas de diferenciación tumoral.^14,15,16

Los objetivos de este estudio fueron detectar las alteraciones moleculares en SE y RMS mediante la complementación de dos técnicas: FISH con sondas específicas para detectar alteraciones cromosómicas y RT-PCR seguida de secuenciación para la identificación de transcriptos de fusión originados a partir de translocaciones génicas, y, además, evaluar el impacto de la conservación de biopsias sobre la integridad de los ácidos nucleicos.

En el estudio se incluyeron 13 niños con sospecha de SE y 4 con sospecha de RMS. En total se trabajó sobre 17 biopsias de tumor primario, de las cuales 7 fueron conservadas a -70ºC y 12 FFEP. Además, se incluyeron 2 aspirados de médula ósea.

Detección de rearreglos génicos por FISH

Mediante la técnica de FISH se ensayaron 13 biopsias de tumores con sospecha de SE y se detectó el rearreglo del gen EWRS1 solo en 9 (Figura 2a). De todos los casos con rearreglo, dos mostraron patrones diferentes, a saber: uno presentó el rearreglo con un patrón de señales atípicas y el otro, monosomía del gen EWSR1 en un 10 % de los núcleos evaluados (Tabla II). Las PAMO no se estudiaron con esta metodología.

Respecto de los casos con sospecha diagnóstica de RMS, a partir de los estudios morfológicos de la biopsia, se evidenció el rearreglo del gen FOXO1en 3/4 biopsias estudiadas, como lo muestra la tabla III (Figura 2b).

Detección de transcriptos de fusión por RT-PCR

Como se resume en las tablas II y III, se extrajo ARN de buena calidad para estudios moleculares, según la determinación del gen control PGK en 8/12 (67 %) de las biopsias fijadas en formol y embebidas en parafina. Con respecto a las muestras conservadas a -70°C, en las 7 (100 %) muestras ensayadas el ARN extraído fue apto para el estudio molecular por RT-PCR. De estas, 5 correspondían a biopsias de tumores primarios y 2, a PAMO de pacientes con SE y con sospecha de infiltración de células neoplásicas en médula ósea.

Para SE se detectó por RT-PCR el transcripto de fusión EWS-FLI1 en 7/13 tumores (54 %), de los cuales 2/7 correspondieron al rearreglo tipo 1 (EWS exón 7 con FLI1 exón 6); 3/7, al tipo 2 (EWS exón 7 con FLI1 exón 5); 1/7 al tipo 4 (EWS exón 10 con FLI1 exón 5) y 1/7, a una translocación inusual que involucra al exón 7 del gen EWS con el exón 4 del gen FLI1. En la figura 3 se ilustra a modo de ejemplo un electroferograma que muestra esta translocación. Ningún caso presentó translocación EWS-ERG. Por otra parte, en las dos muestras de PAMO se confirmó molecularmente la ausencia de infiltración neoplásica observada por histopatología. Cuando se analizaron los casos de RMS, 1/4 resultó no evaluable por técnicas moleculares, ya que la amplificación del gen control, PGK, fue negativa. Con respecto a los 3 casos evaluables, en 1/3 se detectó por RT-PCR el transcripto de fusión de los genes FOXO1-PAX3, que así confirmó el diagnóstico de RMSA. En otro caso, se confirmó el diagnóstico de RMS embrionario por ausencia de la translocación con ambos métodos, RT-PCR y FISH negativos (fusión negativa). Por último, se observó un resultado discordante en un caso con RT-PCR negativa que por FISH evidenció el rearreglo de FOXO1; en consecuencia, este caso se asumió como RMSE (fusión negativa). Ninguno de los casos estudiados (0/3) evidenció la translocación FOXO1-PAX7.

Figura 2.
Microscopía de fluorescencia (100X).
(a) Hibridación in situ fluorescente (FISH, Fluorescent in situ hybridization) de un tumor correspondiente a un sarcoma de Ewing con sondas break apart para el gen EWSR1, donde se observa la separación de las señales en los núcleos neoplásicos; (b) FISH con sondas break apart donde se muestra el gen FOXO1 rearreglado/translocado. Flechas blancas: separación de la señal fluorescente, que indica la presencia del rearreglo del gen contra el que se dirigen las sondas.

Figura 3.
Gráfico de una secuencia de ácido desoxirribonucleico (ADN) obtenida por electroforesis capilar (electroferograma).
Secuenciación del transcripto de fusión entre los genes EWSR1-FLI1 del exón 7 con el exón 4, respectivamente, en un caso de SE.

Tabla II.
Casos de Sarcoma de Ewing estudiados.

P, tejido fijado en formol e incluido en parafina; F, tejido en fresco conservado a -70°C; PAMO, médula ósea; NEG, negativo; POS, positivo; PGK: fosfoglicerato quinasa; SE, Sarcoma de Ewing.

Tabla III
Casos de rabdomiosarcoma estudiados.

P, tejido fijado en formol e incluido en parafina; F, tejido en fresco conservado a -70°C; NEG, negativo; POS, positivo; RMS, rabdomiosarcoma.

Los tumores de la familia de SE y los RMS forman parte del 6% de los casos de cáncer anuales en niños menores de 15 años, según el Registro Oncopediátrico Hospitalario Argentino. La complementación entre diferentes técnicas diagnósticas representa la base de los sistemas de clasificación actuales para estos tumores e incluye entre sus criterios los aspectos clínicos, morfológicos, inmunofenotípicos y genéticos para lograr finalmente un diagnóstico de certeza.²⁰

Los datos aquí presentados son el resultado de la primera experiencia en la detección de mutaciones o alteraciones genéticas en tumores de partes blandas en la población pediátrica que asiste al hospital de Niños Dr. Ricardo Gutiérrez.

En este estudio se realizaron los diagnósticos mediante dos técnicas: FISH y RT-PCR-secuenciación, sin embargo, no siempre todos los resultados fueron coincidentes. En particular en los tumores de Ewing de esta serie, el abordaje realizado mediante la técnica de FISH nos permitió identificar la translocación del gen EWSR1, inclusive en un caso en el que solo un 25 % de núcleos lo presentaba, porcentaje muy cercano al valor de corte por bibliografía. Esta observación fue corroborada por RT-PCR-secuenciación mediante la cual se caracterizó el transcripto de fusión EWS-FLI1, lo que pone en evidencia la utilidad de esta técnica molecular para confirmar el diagnóstico, en especial en aquellos casos con valor cercano al corte. Por otra parte, en un caso con diagnóstico morfológico de RMS, se encontró una discrepancia entre FISH y RT-PCR similar a lo descripto por Qian X. y colaboradores.²¹ Mediante la técnica de FISH se evidenció el rearreglo de FOXO1 en un 25% de los núcleos, pero el ensayo de RT-PCR resultó negativo para ambos transcriptos de fusión PAX3-FOXO1 y PAX7-FOXO1. La discordancia observada llevó a establecer un diagnóstico final de rabdomiosarcoma embrionario debido a la ausencia del transcripto de fusión. Este resultado discordante plantea diversas situaciones: por un lado, se pueden reconsiderar los valores de corte para la técnica de FISH con respecto al gen FOXO1. Por otro lado, dado que se partió de una biopsia incluida en parafina, existe la posibilidad de que el ARN se haya estado parcialmente degradado y esto llevó a una disminución de la sensibilidad de la técnica. Al respecto, es importante tener en cuenta que la reacción de control para el ARN amplificable utilizó como blanco el transcripto del gen PGK, correspondiente a una enzima que se expresa a niveles significativamente más altos que los transcriptos de fusión FOXO1. Esto plantea la posibilidad a futuro de incluir genes reporteros con diferente nivel de expresión del transcripto, según el transcripto de fusión que se quiera diagnosticar.

Por otra parte, es importante señalar que la forma de conservación de la muestra ensayada puede condicionar el resultado obtenido y por ello se debe considerar la calidad de biopsias conservadas en fresco a -70°C vs. FFPE. Se demostró que el ARN obtenido a partir de las biopsias preservadas a -70°C fue de mejor calidad que el de las fijadas en formol e incluidas en parafina en cuanto a la integridad de los ácidos nucleicos. Esto se vio reflejado en la amplificación del gen control PGK, elegido especialmente para este tipo de biopsias, ya que en todos los casos en que partimos de material en fresco, se recuperó ARN de calidad, mientras que el ARN recuperado a partir de parafinas fue apto en un 66 %. Otro inconveniente que se puede presentar al ensayar biopsias fijadas es la imposibilidad de detectar transcriptos de fusión de mayor longitud, tal como lo describen Bridge y col.²² en su trabajo sobre SE, en aquellas biopsias en las cuales los diversos puntos de translocación del exón EWS-FLI1 pueden producir transcriptos de fusión muy extensos (mayores a 650 pb), dependiendo del sistema de cebadores utilizados, que no se amplifiquen de manera eficiente a partir de tejido fijado y embebido en parafina.

Las dos técnicas aquí utilizadas, FISH y RT-PCR-secuenciación, presentaron ventajas y desventajas diagnósticas. Los ensayos citomoleculares permiten detectar los rearreglos con una sola sonda para un gen específico (por ejemplo, EWRS1 o FOXO1) sin la necesidad de conocer el segundo gen de la fusión, lo cual representa una ventaja, dado que permite detectar una alteración genética sin necesidad de conocer el gen con el cual se translocó, pero su sensibilidad es menor que la de las técnicas moleculares. Por su parte, los ensayos de RT-PCR son más sensibles, pero dado que es necesario conocer ambos genes que participan de la fusión, hay que diseñar una estrategia específica para cada punto de ruptura. Esto podría ser un inconveniente, por ejemplo, para el SE, donde el gen EWS puede translocarse con numerosos genes candidatos. Por lo tanto, se evidencia la importancia de contar con ambas técnicas complementarias en estos casos para arribar al diagnóstico de certeza y así dirigir los tratamientos de manera óptima. Los casos de SE confirmados fueron incluidos en el protocolo de tratamiento específico Euro EWING 2012.²³ En los casos con diagnóstico de RMS, los estudios moleculares nos permitieron realizar su clasificación molecular para incluir a los pacientes con RMSA con fusión de genes positivo en el grupo de alto riesgo e incorporarlos a un régimen terapéutico más intensivo. Cabe señalar también la importancia de secuenciar los genes de fusión detectados, dado que esto permite la identificación certera de los puntos de ruptura de los genes implicados, ya sea en el caso de los SE o de los RMS. La justificación de la secuenciación surge del hecho de que, si bien se requiere de mayor evidencia, la bibliografía sugiere que conocer el tipo de transcripto de fusión generado podría brindarnos información de pronóstico adicional; y este tipo de información solo está disponible con este método.^22,24 En esta serie en particular, se detectó un rearreglo génico infrecuente en uno de los SE correspondiente a la unión del exón 7 del gen EWS con el exón 4 del gen FLI1.

En lo referente al SE, otros autores han descripto que el trascripto EWS.FLI1 tipo 1 fue el que se detectó en la mayoría de los casos^24,25,26, sin embargo, en la pequeña serie estudiada, aún no se ha observado esa distribución, por lo cual se propone estudiar un mayor número de casos para evaluar el transcripto predominante en los casos de nuestro centro.

Como conclusión final, destacamos que la evaluación conjunta de los resultados mediante la complementación de los estudios moleculares y citomoleculares con los datos morfológicos e inmunohistoquímicos permitió arribar a los diagnósticos definitivos de los casos estudiados y generó la oportunidad de tratamiento adecuado en los casos prospectivos. Respecto de los tumores que fueron analizados en forma retrospectiva, que fueron oportunamente diagnosticados, su reevaluación nos brindó la posibilidad de revalidar las técnicas empleadas, así como de ampliar la información genética de la enfermedad y correlacionar con la evolución de estos pacientes.