Artículos originales
Estudio del valor de Ct: el polimorfismo D/I del gen ECA1 en la respuesta al SARS-COV-2.
Study of the impact of the ACE1 I/D polymorphism and SARS-COV-2 Ct value on COVID-19 infection
Estudio del valor de Ct: el polimorfismo D/I del gen ECA1 en la respuesta al SARS-COV-2.
Bioquímica y Patología Clínica, vol. 87, núm. 1, pp. 35-39, 2023
Asociación Bioquímica Argentina
Resumen: El gen de la ECA1 (Enzima convertidora de la Angiotensina) presenta un polimorfismo (rs4646994) de inserción/deleción (I/D). La deleción se ha asociado con una menor expresión de ECA2, el receptor de SARS-Cov-2. Se ha estudiado que el valor de Ct (cycle threshold) para SARS-Cov-2 tiene relación con el desarrollo de síntomas. Nuestro objetivo fue evaluar si el polimorfismo rs4646994 está vinculado a la susceptibilidad a SARS-Cov-2 y si el Ct influye en el desarrollo de síntomas. Se estudiaron 658 individuos no relacionados, 325 individuos no infectados, 132 portadores asintomáticos y 201 individuos sintomáticos en los cuales la presencia o ausencia del virus SARS-Cov-2 fue determinada mediante kit comercial de RT-qPCR. Se registró edad, sexo, valor de Ct, así como los síntomas de cada individuo. Las muestras se genotipificaron para rs4646994. Se encontraron diferencias significativas entre la presencia de síntomas y el valor de Ct (asintomáticos: Ct= 23,84 vs. sintomáticos: Ct= 20,22, p<0,001). Se encontraron diferencias significativas entre la presencia de malestar general, fiebre, cefalea, odinofagia, tos, mialgia, anosmia y el valor de Ct, (p<0,001). La frecuencia del alelo D en los no infectados fue de 0,51, mientras que en el grupo de portadores asintomáticos de SARS-Cov-2 fue de 0,54 y de 0,53, en los sintomáticos, sin mostrar diferencias significativas entre los tres grupos. Nuestros resultados sugieren que el polimorfismo rs4646994 no estaría vinculado a la susceptibilidad al SARS-Cov-2 en nuestra población y que la carga viral, analizada como valor de Ct, influye en la aparición de algunos síntomas.
Palabras clave: COVID-19, valor de Ct, polimorfismo del gen ECA1, síntomas, susceptibilidad genética.
Abstract: The Angiotensin Converting Enzyme (ACE1) gene presents an insertion/deletion (I/D) polymorphism (rs4646994). The deletion has been associated with a lower expression of ACE2, the SARS-Cov-2 receptor. It has been described that the SARS-Cov-2 cycle threshold (Ct) value is related to the development of symptoms. Our objective was to evaluate whether the rs4646994 polymorphism is linked to the susceptibility to SARS-Cov-2 infection and whether the Ct value influences the development of symptoms. We studied 658 unrelated individuals: 325 uninfected individuals, 132 asymptomatic carriers and 201 symptomatic individuals, in whom the presence/absence of SARS-Cov-2 in a nasopharyngeal swab sample was determined using a commercial RT-qPCR kit. The age, gender, Ct value, and symptoms of each individual were recorded. Samples were genotyped by PCR for rs4646994. No differences were found in the age and gender of SARS-Cov-2-positive patients, or in the presence of symptoms. Significant differences were found between the presence of symptoms and the Ct value (asymptomatic Ct: 23.84 vs symptomatic Ct: 20.22, p <0.001). Significant differences were found between the presence of general malaise, fever, headache, odynophagia, cough, myalgia and anosmia and the Ct value (p <0.001). The D allele frequency in uninfected individuals was 0.51, whereas that in asymptomatic carriers was 0.54 and that in symptomatic ones was 0.53, showing no significant differences between the three groups. Our results suggest that the rs4646994 polymorphism is not linked to the susceptibility to SARS-Cov-2 infection in our population, and that the viral load, analyzed as the Ct value, influences the appearance of some symptoms.
Keywords: COVID-19, Ct value, ACE1 polymorphism, symptoms, genetic susceptibility.
Introducción
En diciembre de 2019, China reporta por primera vez la enfermedad llamada COVID-19 .Coronavirus disease 2019), causada por un nuevo coronavirus al cual se denominó SARS-Cov-21. Dada su alta tasa de diseminación en el mundo, existen 433.000.000 de casos confirmados y 5.900.000 muertes, al 27/02/20222. La COVID-19 ha mostrado una amplia gama de comportamientos clínicos, desde asintomáticos hasta síndromes de enfermedad respiratoria grave. Los síntomas más habituales que presentan las personas infectadas por SARS-Cov-2 son fiebre, tos, cansancio, pérdida del gusto y/o del olfato. Dentro de los síntomas menos habituales, se encuentran: dolor de garganta, dolor de cabeza, malestar general, diarrea y erupción cutánea. Los síntomas de mayor gravedad son: dificultad para respirar o disnea, pérdida de movilidad o del habla, sensación de confusión y dolor en el pecho3.
Hasta el momento, no se conocen para cada población los marcadores asociados a susceptibilidad, resistencia y severidad de la COVID-19. Aún no está claro si son factores genéticos, sociales y / o una combinación de ambos los que contribuyen a las variaciones geográficas actuales de COVID-19. Se han iniciado trabajos a nivel internacional para estudiarlo4,5. Desde el inicio de la pandemia, se han analizado factores virales como las diversas variantes del SARS-Cov-26 y la carga viral, así como factores del hospedador, tales como diabetes y obesidad, factores genéticos y también, el grupo sanguíneo5.
La detección de la infección por SARS-Cov-2 se ha realizado, principalmente, mediante la prueba de PCR con transcripción reversa (RT-qPCR). Los resultados de tales pruebas se pueden informar como valores de ciclo umbral (Ct, del inglés, cycle threshold), que pueden proporcionar mediciones semicuantitativas o indirectas de la carga viral. En el caso del SARS-Cov-2, la cinética viral ha sido poco caracterizada y su asociación con la evolución de la enfermedad es controvertida. A pesar de ello, existen evidencias que sugieren que el período de incubación es de aproximadamente 5 días y que la carga viral máxima se produce en la fase inicial de la enfermedad, cerca del momento del inicio de los síntomas7. El tiempo que transcurre hasta la eliminación viral varía entre los estudios, pero la diseminación del virus puede persistir durante varias semanas después del inicio de los síntomas, incluso meses, en algunas personas8, y puede ser más corta en personas jóvenes y/o asintomáticas. En pacientes hospitalizados, algunos estudios sugieren una carga viral más alta en pacientes graves en comparación con pacientes leves9.
El papel de la genética del huésped en el impacto de la susceptibilidad y la gravedad de la COVID-19 no han sido estudiados en nuestra población. El coronavirus SARS-Cov-2 entra en las células a través de la unión de una proteína de su superficie, la proteína Spike, con el receptor ECA2 (enzima convertidora de angiotensina 2) de las células huésped10.
El gen que codifica a la ECA1 se localiza en el cromosoma 17 (17q23) y está compuesto por 26 exones y 25 intrones. El gen de la ECA1 presenta un polimorfismo de inserción/deleción (I/D, dbSNP rs4646994), el cual se debe a la presencia o no, en el intrón 16, de una secuencia Alu repetitiva que comprende 287 pares de bases11. La deleción de este polimorfismo del gen ECA1 se ha asociado con una menor expresión de ECA2, el receptor de SARS-Cov-2, lo cual implicaría que aquellos pacientes con el genotipo DD presentarían menor susceptibilidad a la infección12.
En diversos trabajos, se ha descripto la relación entre este polimorfismo y la severidad en pacientes con COVID-1913,14,15,16,17. Existen ciertas discrepancias acerca de la relación entre la expresión de ECA2 y la susceptibilidad a la infección por SARS-Cov-2, como propone Saadat en su publicación18, motivo por el cual resulta necesario tener en cuenta distintos factores ambientales como la frecuencia alélica de cada población, el patrón geográfico de prevalencia y mortalidad, la economía y el número de testeos para dicha infección, etc., ya que es evidente que dichos factores pueden sesgar las conclusiones de varios de los trabajos publicados.
El objetivo del presente trabajo fue evaluar si el polimorfismo rs4646994 del gen ECA1 está vinculado a la susceptibilidad a SARS-Cov-2 y si el valor de Ct influye en el desarrollo de síntomas.
Materiales y métodos
Población de estudio
Se estudiaron individuos no relacionados en los cuales la presencia o ausencia del virus SARS-Cov-2 fue determinada en muestras de hisopado nasofaríngeo mediante kit comercial de RT-qPCR. Los individuos completaron una planilla epidemiológica y, además, firmaron un consentimiento informado para la participación en el estudio, el cual cuenta con aprobación de un comité de ética local (Comité de Ética en Investigación, Instituto de Investigaciones Clínica). Se analizaron individuos no infectados que habían tenido un contacto estrecho con un caso confirmado dentro de los tres días anteriores a la toma de muestra, portadores asintomáticos e individuos sintomáticos que asistieron al laboratorio entre septiembre y diciembre de 2020. Los síntomas registrados fueron cefalea, odinofagia, tos, mialgia, diarrea, artralgia, anorexia, disnea, malestar general, fiebre y anosmia.
Toma de muestra
La muestra utilizada para la detección de SARS-Cov-2 y el estudio del polimorfismo I/D (rs4646994) del gen ECA1 por el método de PCR fue el hisopado nasofaríngeo. La toma de muestra estuvo a cargo de personal de salud capacitado para este procedimiento. Una vez realizado el hisopado nasofaríngeo, se colocó el hisopo en un tubo cónico con solución fisiológica y la muestra se conservó refrigerada en heladera a 4°C, no más de 72 h, hasta su procesamiento.
Extracción de ácidos nucleicos
La extracción de ARN y ADN de las muestras respiratorias se llevó a cabo con el Viral Nucleic Acid Extraction Kit (Genaid, New Taipei, Taiwan), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las extracciones se llevaron a cabo en cabina de seguridad biológica tipo II.
Estudio molecular de la presencia de ARN de SARS-CoV-2
La detección del SARS-Cov-2 se realizó con el kit 2019-nCoV CDC EUA, (IDT, Integrated DNA Technologies). Se utilizó la premezcla GoTaq(R) Probe 1-Step RT-qPCR System –Promega - Bosphore® novel coronavirus (2019-NCOV) Detection kit V2. Como control positivo de las reacciones, se utilizó 2019-nCoV-N-Positive Control (IDT). El kit utiliza dos juegos de primers y sondas para amplificar las regiones N1 y N2 del gende la nucleocápside viral (gen N). Un par de primers y sondas adicionales se utiliza para detectar el gen humano Rnase P como control del proceso de extracción de ARN de las muestras biológicas (control interno). Las reacciones de RT-qPCR se llevaron a cabo en un equipo Analytik Jena qTOWER.Q, siguiendo el siguiente programa: 15 minutos a 45°C, 2 minutos a 95°C con 45 ciclos de 3 segundos a 95°C y 30 segundos a 55°C. La medición de fluorescencia se realizó en el canal FAM.
Estudio del polimorfismo I/D del gen ECA1Estudio del polimorfismo I/D del gen ECA1
El análisis del polimorfismo genético I/D (rs4646994) en el intrón 16 del gen ECA1 se realizó de acuerdo con el protocolo descrito por Rigat y colaboradores11. Se realizaron amplificaciones con los oligonucleótidos ACEfw (CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT) y ACErv (GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT) con la premezcla Mytaq (Biosystems); los productos de amplificación fueron observados en gel de agarosa 1,5 %. Los pacientes homocigotas D/D presentan una banda de 190pb, los homocigotas I/I presentan una banda de 490 pb. En el caso de los heterocigotas I/D, se observan dos bandas: una de 190pb y otra de 490pb.
Se obtuvieron los perfiles genéticos de las 658 muestras, que permitieron calcular las frecuencias alélicas y genotípicas y, por ende, lograr estimar la distribución de frecuencias de estos polimorfismos en cada grupo de estudio. La frecuencia del alelo D en los individuos no infectados fue de 0,51, mientras que en el grupo de portadores asintomáticos de SARS-Cov-2 fue de 0,54 y de 0,53, en los sintomáticos (Tabla II). No se hallaron diferencias estadísticamente significativas entre los tres grupos (p=0,35) ni tampoco, al comparar los individuos con PCR detectable (sintomáticos y asintomáticos) con los no detectables (p=0,98).
Asimismo, no se encontró una relación estadísticamente significativa del genotipo del polimorfismo genético I/D (rs4646994) del gen ECA1 con el sexo ni con el valor de Ct ni con la aparición de ninguno de los síntomas evaluados. Todos los grupos de datos están en equilibrio de Hardy- Weinberg.
| Grupo | Frecuencia genotípica | Frecuencia alélica | |||
| DD | DI | II | D | I | |
| Negativos para SARS-Cov-2 | 0,26 | 0,55 | 0,19 | 0,51 | 0,49 |
| Positivos sintomáticos | 0,26 | 0,55 | 0,19 | 0,53 | 0,47 |
| Positivos asintomáticos | 0,28 | 0,54 | 0,18 | 0,54 | 0,46 |
Análisis estadístico
Con base en los resultados obtenidos mediante la genotipificación de los individuos, se calcularon las frecuencias alélicas y genotípicas del polimorfismo en estudio para los tres grupos de muestras. En los tres grupos de individuos, se evaluó su apartamiento del equilibrio de Hardy-Weinberg bajo el test de Chi-cuadrado (X2). Para evaluar el valor de Ct y la presencia de los diferentes signos y síntomas, se utilizó el test de Mann–Whitney–Wilcoxon (WMW). Todas las pruebas estadísticas se realizaron con un nivel de significancia (α) = 0,05.
Resultados
Se estudiaron 658 individuos no relacionados: 325 individuos no infectados que habían tenido contacto estrecho con un caso confirmado dentro de los tres días anteriores a la toma de muestra, 132 portadores asintomáticos y 201 individuos sintomáticos.
El promedio de edad de la población estudiada fue de 41.76 años (rango 1-95, DS 17,81), el 51 % era masculina). No se encontró relación entre la edad y el sexo con la positividad para SARS-Cov-2, con la presencia de síntomas ni con el valor de Ct. Se encontraron diferencias significativas entre la presencia de síntomas y el valor de Ct (asintomáticos: Ct = 23,84 vs. sintomáticos: Ct = 20,22, WMW, p<0,001), y los individuos con síntomas mostraron un valor de Ct menor (Figura 1).
No se encontraron diferencias entre la presencia de diarrea, artralgia, anorexia, disnea y el valor de Ct. Se encontraron diferencias significativas entre la presencia de malestar general, fiebre, cefalea, odinofagia, tos, mialgia, anosmia y el valor de Ct, (p<0,05, Tabla I). En todos los casos, excepto para anosmia, los pacientes con síntomas presentaban un valor de Ct menor (mayor carga viral) respecto de los que no los presentaban.
Figura 1.
Valores de Ct del Gen N en individuos sintomáticos y asintomáticos.
| Síntoma | Media Ct | SD | Valor P | |
| Diarrea | Presente | 20,17 | 4,58 | 0,23 |
| Ausente | 21,77 | 5,68 | ||
| Malestar general | Presente | 19,32 | 4,44 | <0,0001 |
| Ausente | 22,84 | 5,79 | ||
| Artralgia | Presente | 19,46 | 3,75 | 0,09 |
| Ausente | 21,84 | 5,72 | ||
| Fiebre | Presente | 18,61 | 3,86 | <0,0001 |
| Ausente | 22,87 | 5,76 | ||
| Cefalea | Presente | 19,99 | 4,77 | 0,0042 |
| Ausente | 22,15 | 5,78 | ||
| Odinofagia | Presente | 20,41 | 5,47 | 0,0455 |
| Ausente | 21,91 | 5,63 | ||
| Tos | Presente | 19,41 | 4,58 | <0,0001 |
| Ausente | 22,54 | 5,75 | ||
| Mialgia | Presente | 19,21 | 4,17 | 0,0030 |
| Ausente | 21,98 | 5,71 | ||
| Anorexia | Presente | 20 | 3,97 | 0,29 |
| Ausente | 21,76 | 5,69 | ||
| Disnea | Presente | 20,18 | 4,17 | 0,45 |
| Ausente | 21,71 | 5,66 | ||
| Anosmia | Presente | 22,77 | 4 | 0,03 |
| Ausente | 21,51 | 5,79 |
Discusión
Nuestros resultados sugieren que el polimorfismo rs4646994 no estaría vinculado a la susceptibilidad a la infección por SARS-Cov-2 en nuestra población y que la carga viral analizada como valor de Ct influye en la aparición de algunos síntomas.
En el presente trabajo, encontramos que los pacientes con síntomas presentaban valores de carga viral medida en valor de Ct, mayores que los de aquellos pacientes sin síntomas. Existen varios trabajos anteriores en los cuales no se ha encontrado relación entre el valor de Ct con el desarrollo de síntomas19,20,21. Por el contrario, en el caso de Salvatore y colaboradores, ellos encontraron, utilizando el mismo kit de RT-qPCR que el presente trabajo, una relación entre el valor de Ct y el desarrollo de síntomas respiratorios22. En particular, hemos encontrado relación entre el valor de Ct y el desarrollo de los siguientes síntomas: malestar general, fiebre, cefalea, odinofagia, tos, mialgia y anosmia.
Los pacientes con el síntoma de anosmia presentaron un valor de Ct mayor que aquellos que no la presentaban, lo cual podría estar relacionado con que este síntoma tiene una aparición más tardía en la infección. En trabajos anteriores, no encontraron relación entre el valor de Ct y la severidad o el tiempo de recuperación de la anosmia23.
El análisis de este estudio no mostró una relación entre el valor de Ct y las diferentes edades. En la bibliografía existen evidencias contradictorias al respecto, aunque se sugiere que el valor de Ct disminuye con la edad24,25.
El presente estudio cuenta con varias limitaciones. Los participantes fueron categorizados según sus síntomas en el momento de la toma de muestra para la prueba de RT-qPCR, lo cual no refleja la trayectoria completa de los síntomas del individuo. Adicionalmente, se incorporaron a este estudio pacientes ambulatorios con cuadros leves, por lo tanto, no se pudieron realizar correlaciones de los valores de Ct o del genotipo del polimorfismo I/D del gen ECA1 con el desarrollo de cuadros graves de COVID-19.
No se encontró una relación estadísticamente significativa entre el genotipo del polimorfismo I/D del gen ECA1 con el sexo, con el valor de Ct ni con la aparición de ninguno de los síntomas evaluados. Tampoco se hallaron diferencias en su frecuencia alélica en los tres grupos estudiados, lo cual sugiere que este polimorfismo no estaría vinculado a la susceptibilidad al SARS-Cov-2 en nuestra población. Se han descripto otros genes, así como otros polimorfismos en los genes ECA, que podrían estar involucrados en la respuesta a la infección26,27.
Este estudio aportará datos de utilidad para investigaciones que requieran el uso del polimorfismo I/D del gen ECA1 como marcador genético vinculado a la respuesta a la infección por SARS-Cov-2 en nuestra población. Probablemente, sería conveniente estudiarlo en pacientes con cuadros graves, ya que se ha encontrado que está relacionado con los mismos en diversas poblaciones28,13,14.
Asimismo, este trabajo brindó información sobre la influencia del valor de Ct con el desarrollo de algunos síntomas que no se habían descripto en nuestra población.
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