Se emplearon ratas macho de la cepa Wistar de destete (21-23 días de edad) provenientes del Bioterio Central de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad de Buenos Aires. Los animales se mantuvieron en condiciones estándares de luz, temperatura y humedad y se alimentaron con una dieta balanceada para roedores, presentada bajo la forma de cilindros prensados con la siguiente composición (g/100 g): proteínas, 22,7; lípidos, 7,09; fibra, 6; Ca, 1,3; P, 0,8; cenizas, 6,5; agua, 7,96; dextrina, hasta 100g. Todos los experimentos se realizaron siguiendo las normas de la Guía para el cuidado y uso de los animales de experimentación, de acuerdo con el NIH (Res. 8023).

1- Modelo experimental de desnutrición crónica (DC)

Al momento del destete, las ratas fueron distribuidas aleatoriamente en 2 grupos según el consumo de alimento: control (C) y desnutrido crónico (DC). El grupo C recibió una dieta estándar en condiciones de libre demanda, mientras que el grupo DC recibió un 80 % de la dieta consumida por C, durante 4 semanas.

La cantidad de comida fue corregida por el peso corporal (ingesta de alimentos en gramos, por 100g/peso corporal por día). El peso corporal y la longitud fueron registrados a lo largo de todo el experimento.

2- Recolección y caracterización de material particulado

Las cenizas residuales de la combustión del petróleo (ROFA) se recolectaron en la planta industrial petrolífera de Mystic River, Everett, MA, USA y fueron donadas por el Dr. J. Godleski, de la Escuela de Salud Pública de Harvard, Boston, MA, USA. Estas partículas son ampliamente utilizadas en toxicología ambiental como sucedáneo de la contaminación ambiental aérea. ^22,23,24,25

ROFA fue previamente caracterizada morfológica y químicamente por microscopía electrónica de barrido y espectroscopía dispersiva de rayos. ^{25 , 26} Las partículas de ROFA son morfológicamente heterogéneas, con trazas de metales (hierro, vanadio y níquel) en su composición.

3- Exposición animal a ROFA: protocolo experimental

Después de 4 semanas de tratamiento dietario, los animales fueron instilados intranasalmente ^27,28 con ROFA (1 mg/kg de peso corporal) o con buffer fostato salino estéril (PBS-vehículo), y se generaron 4 subgrupos (n = 15 por grupo): control, ROFA, DC, DC + ROFA. La dosis de ROFA fue seleccionada sobre la base de trabajos previos. ^{21,22,23,24,26,29} La eutanasia se realizó 24 horas después de la instilación intranasal con una sobredosis de ketamina/xilazina. Inmediatamente, se realizó 1) el lavado bronquioalveolar (LBA) a fin de obtener cultivos primarios de macrófagos alveolares (MA) como modelo para los estudios in vitro y 2) se resecó la aorta torácica para los estudios funcionales y bioquímicos.

4- Estudios en Macrófagos Alveolares (MA)

4.1 Aislamiento de MA y cultivo celular

Los MA de animales de los cuatro grupos experimentales (C, ROFA, DC y DC + ROFA) se obtuvieron mediante el BAL, según Tasat y del Rey. ³⁰ Brevemente, las tráqueas se canularon y perfundieron con 1 ml de PBS frío (libre de Ca²⁺ y Mg²⁺, pH 7,2–7,4). Con el fin de obtener una cantidad óptima de células, el lavado con PBS 1X se repitió 12 veces. La suspensión celular se centrifugó durante 10 minutos a 800xg a 4°C y el precipitado celular se volvió a suspender en PBS. El recuento de células totales se realizó en cámara de Neubauer, bajo microscopio de contraste de fases. De acuerdo con criterios morfológicos, se determinó que más del 95 % de las células del LBA correspondió a MA. Las células se sembraron en placas de 24 pocillos en medio RPMI-1640 (Gibco, Thermo Fisher Scientific Inc.) con 10 % de SFB, penicilina (100UI/ml) y estreptomicina (10 µg/ml) en una densidad de 0,125 x10⁶ células/ml. Luego de 20 - 30 minutos, las células no adheridas fueron removidas y se adicionó medio fresco. Los cultivos se mantuvieron por 24 h en estufa a 37°C y atmósfera de 5 % de CO₂.

4.2 Viabilidad celular

El metabolismo celular se evaluó mediante el ensayo colorimétrico del 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-bromuro de tetrazolio (MTT). Luego de 24 h de la siembra, el medio de cultivo de los MA fue removido y se adicionó 0,5 ml de medio fresco, suplementado con 50 µl de MTT (4 mg/ml). Las células se incubaron por 3 h y los cristales de formazan se solubilizaron con SDS 10 %. La absorbancia correspondiente a cada muestra se midió a 570 nm.

4.3 Ensayo de fagocitosis

La capacidad fagocítica de los MA provenientes de los animales C, ROFA, DC y DC + ROFA se midió empleando esferas de látex de 2,2 μm de diámetro. Brevemente, luego de 24 h de incubación, se agregaron al medio de cultivo esferas de látex opsonizadas con suero fetal bovino en una relación 1:10, durante 1 h a 37°C. Después, se lavó para remover las esferas no fagocitadas y las células fueron fijadas con paraformaldehído al 4 %. La capacidad fagocítica fue evaluada bajo microscopía óptica (Leica DM500) y se cuantificó el porcentaje de fagocitosis. Se contó un mínimo de 100 células por pocillo y al menos tres pocillos por grupo.

4.4 Producción del factor de necrosis tumoral α (TNFα) e interleuquina-6 (IL-6)

La secreción de las citoquinas proinflamatorias TNFα e IL 6 por MA fue evaluada en el medio de cultivo utilizando un ensayo inmunoabsorbente, ligado a enzimas (ELISA), siguiendo las instrucciones del fabricante. La absorbancia fue medida a 450 nm (longitud de onda de corrección 660 nm) en un lector de placa (BioRad, Benchmark).

4.5 Determinación inmunocitoquímica de la activación del sistema de defensa antioxidante

La activación del sistema de defensa antioxidante se evaluó con una prueba inmunocitoquímica, utilizando un anticuerpo contra el factor nuclear eritroide similar al factor 2 (Nrf2) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX). Las células fueron fijadas con paraformaldehído al 4 %, permeabilizadas con Tritón ^® X-100 (0,1 %) y se incubaron durante 12 - 14 h con el anticuerpo Nrf2 (1:250) diluido en seroalbúmina bovina (BSA 1%) y 0,03 % de Tritón ^® X-100 en PBS 1X. Luego, las células se lavaron 2 veces con PBS 1X y se incubaron con un anticuerpo secundario durante 1 h (Anti-rabbit- FITC Thermo Fisher Scientific Inc.). Para observar el núcleo de las células, se realizó una contratinción con TO-PRO™-3 Iodide (Thermo Fisher Scientific Inc.) por 10 min. Las células fueron observadas bajo microscopía confocal (Leica SP5 AOBS). Para cuantificar el nivel y localización de Nrf2, la fluorescencia celular total corregida (FCTC), la fluorescencia total nuclear corregida (FNTC) y la relación fluorescencia nuclear/fluorescencia celular total fueron analizadas según McCloy et al. ^31,32 El análisis se llevó a cabo utilizando el programa Image J version 1.53e. Las células y el núcleo fueron manualmente delimitados y el área, la intensidad integrada y el valor medio de gris fueron determinados. Para obtener la FCTC y la FNTC, los valores fueron corregidos por la fluorescencia de fondo, midiendo la misma área y fluorescencia de sectores sin células, adyacentes a las células evaluadas, y este valor fue sustraído de la densidad integrada de la fluorescencia celular total y la fluorescencia nuclear.

5- Estudios en aorta

5.1 Parámetros moleculares

Luego de 24 h de exposición a ROFA se resecó la aorta torácica y se determinaron los siguientes parámetros bioquímicos: citoquinas (IL-6, IL-10 y TNFα) por ELISA; citocromo P450 familia 1 subfamilia1 A miembro 1 (CYP1A1); factor de crecimiento transformante β1 (TGFβ1) y óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) por Western Blot y canal de calcio tipo L por RT-PCR.

5.1.1 Producción de citoquinas

La producción de las citoquinas IL-6, IL-10 y TNFα se evaluó en los sobrenadantes de los homogenatos de aorta de los cuatro grupos experimentales utilizando el ensayo de ELISA, como se describe en el ítem 4.4.

5.1.2 Determinación de CYP1A1, TGFβ1 y eNOS

CYP1A1, TGFβ1 y eNOS fueron evaluados por Western Blot. Las proteínas totales de una alícuota de homogenato de aorta se separaron en un gel de acrilamida 10 - 12 % (SDS-PAGE), en un equipo Mini - Protean III (BioRad). Una vez efectuada la electroforesis, las proteínas fueron transferidas a membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon durante 1 h a 4 °C con leche descremada en polvo al 5 % en buffer TTBS (10 mM Tris–HCl, pH 8,0, 0,5% Tween 20, 150 mMNaCl) y se incubaron durante 10 -12 h a 4° C con el anticuerpo primario específico anti-β-actina (1:500, Sigma-Aldrich Co), anti-TGF-β1, CYP1A1 o eNOs (1:500 Abcam Inc). Luego se las lavó 3 veces con TTBS y se incubaron con un anticuerpo secundario asociado a la enzima peroxidasa (1:1000 Sigma-Aldrich Co). Las membranas nuevamente se lavaron 3 veces y se reveló el resultado con el método de quimioluminiscencia (ECL- Amersham Biosciences Inc., UK). Las bandas fueron cuantificadas usando el programa Image J (1.50i, Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA).

5.1.3 Determinación del canal de calcio tipo L (CCTL)

La expresión del CCTL fue evaluada por RT-PCR. El ARN total de las aortas fue extraído con TRIzol (Life Technologies, Inc.-BRL, Grand Island, NY). El ADN copia (ADNc) se sintetizó incubando 2 μg del ARN extraído de las aortas, con cebadores de hexámeros al azar (Invitrogen), cada uno de los 4 dNTP (Invitrogen) y 200 unidades de la transcriptasa reversa MMLV (Promega, Buenos Aires, Argentina). El ADNc (2μl) se utilizó para llevar a cabo la amplificación (PCR) empleando Taq Polimerasa (GoTaq Polymerase, Promega) y cebadores específicos para CCTL: sentido: 5’-CCTTCAAGACTGTGTTCAAAGC-3’ y antisentido: 5’-TCCTTCCACATACCC GT-3’. La gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GPDH) se usó como control interno y se utilizaron los siguientes cebadores: sentido: 5'-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3' y antisentido: 5’-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3’. Los productos de la amplificación fueron separados en un gel de agarosa al 1 % y teñidos con bromuro de etidio. La densidad de las bandas fue cuantificada utilizando un analizador de imágenes (Image Quant 5.2) y normalizada a GPDH.

5.2. Ensayo de contractibilidad. Medición de la tensión isométrica

Se resecaron las aortas, se sumergieron en solución de Krebs (4,7 mM KCl, 1,17 mM Na₂HPO₄, 130 mM NaCl, 1,16 mM MgSO₄, 24,0 mM HCO₃Na, 2,5 mM CaCl₂ y6 mM glucosa) y se cortaron en anillos de 3 - 4 mm. Para el montaje, tres anillos de aorta se fijaron en sus extremos con alambres de plata y fueron puestos en un baño de órganos con solución de Krebs-Henseleit (20 ml) a 37^o C continuamente suplementado con carbógeno. El alambre inferior estaba unido a una varilla vertical sumergida en el baño de órganos; el otro, a un transductor isométrico de 50 g (TSD125, BIOPACTM) conectado a un equipo de adquisición de datos (MP-100, BIOPACTM) y este, a la computadora donde se registró la señal. Se aplicó una fuerza pasiva de 2 g y la preparación se estabilizó durante 1 h, lavando cada 15 min, antes de iniciar las mediciones. Las mediciones se analizaron con el programa Labtech Notebook Pro (Laboratory Technology, Wilmington, MA, EE. UU.).

Para evaluar la respuesta contráctil de la aorta, se agregaron secuencialmente dosis acumulativas (4x10^-8 a 4x10^-4) de noradrenalina (NA) al baño de órganos. Para normalizar las medidas de los diferentes segmentos aórticos, se utilizó el peso del tejido aórtico húmedo, en gramos.

Para comenzar la prueba, una vez que se colocaron y estabilizaron los segmentos aórticos, se utilizó una solución de KCL (80 mM) para generar contracciones máximas, cuando se despolarizaron las células del músculo liso vascular (VSMC). Posteriormente, se evaluó la relajación aórtica antes de la liberación de acetilcolina (Ach) de la aorta precontraída con NA. Al llegar a la meseta de contracción, se analizaron las concentraciones acumuladas de Ach (10^-8 -10^-4 M). La máxima relajación se expresó como porcentaje de la máxima contracción obtenida con NA.

6- Análisis estadístico

Todos los ensayos fueron realizados por triplicado para cada condición experimental y en tres experimentos independientes. Los datos de cada grupo fueron comparados utilizando ANOVA de dos factores y postest de Bonferroni. Los histogramas muestran la media ± error estándar. La significancia estadística está indicada por un p < 0,05.

Se estudió la respuesta funcional de MA obtenidos por medio de LBA para los cuatro grupos estudiados. Se determinaron los siguientes parámetros: viabilidad celular, capacidad fagocítica, producción de citoquinas proinflamatorias y activación del sistema de defensa antioxidante.

1.1. Viabilidad celular

La exposición a ROFA no alteró la viabilidad de los MA de ninguno de los grupos (Control, ROFA, DC y DC + ROFA) de animales estudiados (Figura 1).

1.2. Actividad fagocítica

Para determinar la capacidad funcional de los MA obtenidos de los grupos control, ROFA, DC y DC + ROFA, se evaluó su actividad fagocítica. Como se evidencia en la Figura 2, la exposición a ROFA produjo una disminución en la actividad fagocítica tanto en los animales C como DC (p < 0.05).

1.3. Producción de citoquinas proinflamatorias

La secreción de citoquinas proinflamatorias de los cultivos de MA obtenidos de los grupos control, ROFA, DC y DC + ROFA se observa en la Figura 3. ROFA indujo un incremento significativo de los niveles de TNFα para C y DC (p < 0.05). Cabe notar que el incremento de los niveles de TNFα fue menor en el grupo DC + ROFA en comparación con C + ROFA (p<0.05, Figura 3A). Asimismo, el tratamiento con ROFA indujo un incremento significativo de los niveles de IL-6. Esta respuesta siguió un patrón similar al evidenciado por TNFα (p < 0.05, Figura 3B).

1.4. Activación del factor nuclear antioxidante Nrf2

En respuesta al estrés oxidativo, la vía del Nrf2 se activa y desencadena una respuesta antioxidante que permite mantener la homeostasis redox celular. Es por ello que evaluamos el nivel de expresión del factor de transcripción Nrf2 e identificamos imunocitoquímicamente su localización celular. Las Figuras 4A y 4B muestran imágenes representativas de la localización de Nrf2 y la cuantificación de su fluorescencia, respectivamente.

Al comparar MA-C y MA-DC no expuestos, se observa un incremento significativo en la inmunomarcación de Nrf2 para MA-DC (Figura 4A-a vs. c), que presenta un aumento de la expresión tanto en el nivel celular como en el nivel nuclear (p < 0.05, Figura 4B). Sin embargo, la relación de fluorescencia núcleo/célula total en MA-DC muestra que la activación antioxidante de Nrf2 fue menor que en los MA-C (Figura 4B).

La exposición a ROFA en los MA-C ocasionó una clara inducción de Nrf2, tanto en el nivel celular total como nuclear (Figuras 4A-b y 4B) con respecto a los MA-C no expuestos a ROFA (Figuras 4A-a y 4B). No se observaron cambios significativos en la expresión o en la localización celular de Nrf2 entre MA-DC y DC + ROFA (Figuras 4A-c y d, y Figura 4B).

2. Efectos de la exposición a ROFA en la vasculatura de animales DC

2.1 Parámetros moleculares vasculares

2.1.1 Citocromo P450 1A1 (CYP1A1)

Como se muestra en la Figura 5, en las ratas control, ROFA aumentó los niveles de CYP1A1 con respecto a las ratas no expuestas (283 %, p < 0,001), mientras que los animales desnutridos expuestos no mostraron cambios en la expresión de CYP1A1.

2.1.2 Perfil de citoquinas

La Figura 6 muestra el perfil de citoquinas en homogenatos de aorta, en donde se observó que la exposición a ROFA, en las ratas C, indujo aumento significativo de IL-6 e IL-10 (35 % y 30 %, respectivamente, p < 0,05), sin observarse cambios en los niveles de TNFα. Los animales DC expuestos a ROFA no mostraron variaciones en los niveles de ninguna de las citoquinas evaluadas.

2.1.3 Factor de crecimiento transformante β1 (TGF-β1)

Como se muestra en la Figura 7, los animales DC presentan mayores niveles de los TGFβ en aorta que los animales de C (p < 0,001). La instilación con ROFA indujo un aumento significativo en la expresión de TGF 1β en ambos grupos de animales. Sin embargo, cabe destacar que la inducción de TGF-β1 en los animales expuestos a ROFA fue menor en el grupo DC en comparación con el grupo C (41 % p < 0,05 vs. 216 % p < 0,001, respectivamente).

2.1.4 Óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS)

Se evaluó la expresión de la eNOS en las aortas de los cuatro grupos experimentales y se observó que la expresión de esta enzima está disminuida en aortas de animales DC con respecto a C (Figura 8 p < 0,001). La instilación de ROFA provocó una reducción significativa de la eNOS tanto para el grupo C como para el DC, y fue mayor en el grupo control (Figura 8, p < 0,001).

2.1.5 Canales de calcio tipo L (CCTL)

Al analizar los niveles de expresión de CCTL, se encontró un patrón similar a la expresión de eNOS (Figura 9). La expresión de CCTL en aortas de animales DC fue menor que en grupo C (p < 0,005). Asimismo, la exposición a ROFA indujo una reducción en los grupos C y DC (p < 0,001).

2.2 Parámetros funcionales: contractibilidad aórtica

Con el objetivo de analizar la función arterial, se evaluó el tono vascular de los anillos de aorta (endotelio y musculo liso) en respuesta a la NA y Ach. Los animales DC presentaron una respuesta contráctil a la NA menor respecto de los animales controles. La exposición a ROFA provocó una disminución de la contractibilidad de la aorta en el grupo control, sin embargo, este efecto no se evidenció en los animales DC (Figura 10 A). Respecto de la relajación vascular, la instilación de ROFA provocó una reducción en la capacidad de relajación en respuesta a la Ach tanto en el grupo C como en el DC. En el grupo de animales DC + ROFA, se observó una marcada desaceleración de la relajación y se alcanzó un porcentaje final de relajación menor respecto del grupo control expuesto a ROFA (Figura10 B).

Tabla 1. Tabla 1. Análisis de parámetros zoométricos en animales controles (C) y animales con desnutrición crónica (DC).

Parámetro	Control (media ± EE)	DC (media ± EE)
Peso corporal (g)	253,4 ± 7,2	144,0 ± 2,9***
Longitud corporal (cm)	21,3 ± 0,2	18,8 ± 0,1***
Peso del fémur (g)	0,648 ± 0,023	0,440 ± 0,015***
Longitud del fémur (mm)	27,05 ± 0,15	23,73 ± 12,00***
Peso de la tibia (g)	0,420 ± 0,015	0,273 ± 0,013***
Longitud de la tibia (mm)	28,70 ± 0,14	25,52 ± 0,13***

Los datos se expresan como media ± error estándar (EE); ***p < 0,001.

Figura 1. Figura 1. Viabilidad celular de macrófagos alveolares. Figura 1. Viabilidad celular de macrófagos alveolares. Los histogramas representan la viabilidad celular evaluada por MTT de los grupos experimentales. C, controles; DC, con desnutrición crónica; ROFA, expuestos al material particulado; DC + ROFA, con desnutrición crónica y expuestos al material particulado. Los datos representan la media ± error estándar.

Figura 2. Figura 2. Actividad fagocítica de macrófagos alveolares. Figura 2. Actividad fagocítica de macrófagos alveolares. Los histogramas representan el porcentaje de fagocitosis de los grupos experimentales. C, controles; DC, con desnutrición crónica; ROFA, expuestos al material particulado; DC + ROFA, con desnutrición crónica y expuestos al material particulado. Los datos representan la media ± error estándar, *p < 0,05.

Figura 3. Figura 3. Producción de citoquinas proinflamatorias por macrófagos alveolares. Figura 3. Producción de citoquinas proinflamatorias por macrófagos alveolares. Los histogramas representan los niveles del (A) factor de necrosis tumoral (TNF-α)y (B) interleuquina 6 (IL-6), dosados en sobrenadantes de cultivo de macrófagos alveolares de los grupos experimentales. C, controles; DC, con desnutrición crónica; ROFA, expuestos al material particulado; DC + ROFA, con desnutrición crónica y expuestos al material particulado. Los histogramas muestran la media ± error estándar, *p < 0,05.

Figura 4. Figura 4. Expresión y localización celular del factor nuclear eritroide 2 (Nrf2) en macrófagos alveolares. Figura 4. Expresión y localización celular del factor nuclear eritroide 2 (Nrf2) en macrófagos alveolares. A) Microfotografías representativas de la localización inmunocitoquímica de Nrf2 en animales controles (a), con desnutrición crónica (b) y expuestos al material particulado, ROFA (c y d, respectivamente). Se observan las células marcadas con anticuerpo Nrf2-FITC (verde) y tinción nuclear de contraste empleando ToPro™ (rojo). B) Cuantificación de la fluorescencia para Nrf2 en la totalidad de la célula, en el núcleo y su relación núcleo/célula total de animales. C, controles; DC, con desnutrición crónica; ROFA, expuestos al material particulado; DC + ROFA, con desnutrición crónica y expuestos al material particulado. Los histogramas muestran la media ± error estándar, *p < 0,05.

Figura 5. Figura 5. Expresión del citocromo P450 1A1 (CYP1A1) en aorta. Figura 5. Expresión del citocromo P450 1A1 (CYP1A1) en aorta. La fotografía del Western Blot (A) y el gráfico de barras (B) representan los niveles de CYP1A1 de los grupos experimentales. C, controles; DC, con desnutrición crónica; ROFA, expuestos al material particulado; ROFA y DC + ROFA, con desnutrición crónica y expuestos al material particulado. Los histogramas muestran la media ± error estándar, ***p < 0,001, n = 5 - 7 animales por grupo.

Figura 6. Figura 6. Perfil de citoquinas inflamatorias en aorta. Figura 6. Perfil de citoquinas inflamatorias en aorta. A-B-C) muestra los niveles de interleuquina 6 (IL-6), interleuquina10 (IL-10) y factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) de los grupos experimentales. C, controles; DC, con desnutrición crónica; ROFA, expuestos al material particulado; ROFA y DC + ROFA, con desnutrición crónica y expuestos al material particulado. Los histogramas muestran la media ± error estándar, ***p < 0,001, n = 5 - 7 animales por grupo.

Figura 7. Figura 7. Expresión del factor de crecimiento transformante 1β (TGF-1β) en aorta. Figura 7. Expresión del factor de crecimiento transformante 1β (TGF-1β) en aorta. El gráfico de barras representa los niveles de TGF-1β de los grupos experimentales. C, controles; DC, con desnutrición crónica; ROFA, expuestos al material particulado; ROFA y DC + ROFA, con desnutrición crónica y expuestos al material particulado. Los histogramas muestran la media ± error estándar, *p < 0,05, ***p < 0,001, n = 5 - 7 animales por grupo.

Figura 8. Figura 8. Expresión la enzima óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) en aorta. Figura 8. Expresión la enzima óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) en aorta. El gráfico de barras representa los niveles de eNOS de los grupos experimentales. C, controles; DC, con desnutrición crónica; ROFA, expuestos al material particulado; ROFA y DC + ROFA, con desnutrición crónica y expuestos al material particulado. Los histogramas muestran la media ± error estándar, ***p < 0,001, n = 5 - 7 animales por grupo.

Figura 9. Figura 9. Expresión del canal de calcio tipo L (CCTL) en aorta. Figura 9. Expresión del canal de calcio tipo L (CCTL) en aorta. El gráfico de barras representa los niveles de CCTL de los grupos experimentales. C, controles; DC, con desnutrición crónica; ROFA, expuestos al material particulado; ROFA y DC + ROFA, con desnutrición crónica y expuestos al material particulado. Los histogramas muestran la media ± error estándar, *** p < 0,001, n = 5-7 animales por grupo.

Figura 10. Figura 10. Evaluación de contractibilidad aortica. Figura 10. Evaluación de contractibilidad aortica. El tono vascular se evaluó en anillos de aorta de los grupos experimentales C, controles; DC, con desnutrición crónica; ROFA, expuestos al material particulado; ROFA y DC + ROFA, con desnutrición crónica y expuestos al material particulado. Se determinó la capacidad de contracción en respuesta a noradrenalina –NA (A) y la relajación en respuesta a acetilcolina- Ach (B). La línea celeste corresponde al grupo C; la verde, a ROFA; la lila, a DC y la roja, a DC + ROFA. **p < 0,01, *p < 0,05. N = 3 - 4 animales por grupo