Introducción

En diciembre de 2019, un nuevo virus respiratorio emerge e impacta en todo el mundo. En marzo de 2020, se declara la situación de pandemia por este nuevo coronavirus, SARS-CoV-2, con la necesidad de tomar medidas sanitarias, entre ellas, aumentar masivamente los testeos en población sintomática, así como en asintomática, para evitar lo más eficientemente posible la propagación de este virus.

El método recomendado por la OMS para el diagnóstico de SARS-COV-2, considerado el gold standard es la PCR en tiempo real (rt PCR) en hisopado nasofaríngeo. La rt PCR consta de 3 pasos principales: inactivación de la muestra, extracción y purificación de ácidos nucleicos y, por último, la PCR propiamente dicha y detección del producto amplificado. Cada uno de estos pasos requiere diferentes insumos y reactivos, cuya demanda aumentó en forma abrupta en el contexto de pandemia ocasionando la falta generalizada de estos recursos.

Esta situación se convirtió en la principal dificultad para responder a las exigencias del diagnóstico y modificó los tiempos de entrega de resultados. Con el objeto de enfrentar la falta de recursos y disminuir los costos, se estudiaron nuevas alternativas y algoritmos diagnósticos a fin de lograr dar respuestas a las exigencias creadas por la pandemia.

La realización de pruebas en grupo ha sido ampliamente utilizada en serología y banco de sangre; adaptarlas a las PCR para diagnóstico de SARS-CoV-2 permitiría disminuir los tiempos de respuesta junto con un ahorro en el consumo de reactivos.

Objetivo: Comparar la extracción de ácidos nucleicos por el método tradicional versus la inactivación con calor (boiling) y el procesamiento individual versus la realización de mezclas de muestras (pooling), en el diagnóstico de SARS-CoV-2, de manera tal de poder prescindir de algunos reactivos y optimizar la utilización de otros para afrontar la gran demanda provocada por la pandemia.

Materiales y métodos

Recolección de muestras: se recolectaron hisopados nasofaríngeos en tubo estéril con 2 mL de medio de transporte para virus universal o en 2 mL de agua libre de RNasas.

Extracción y purificación de ácidos nucleicos: se realizó a través de método manual con columnas Quick-RNA Viral Kit de ZYMO RESEARCH.

Inactivación por calentamiento (boiling): se llevó a cabo el calentamiento durante 5 minutos a 95°C en termobloque. Se tomaron 18 muestras (8 detectables y 10 no detectables) recolectadas en agua libre de RNasas, previamente extraídas y testeadas por el protocolo convencional, se inactivaron por el método de boiling y luego, se les realizó la PCR eliminando el paso de extracción.

Mezcla de muestras (pooling): se realizaron mezclas de acuerdo con una estrategia de pool en matriz. Cada matriz comprende 25 muestras dispuestas en un esquema de 5 filas por 5 columnas, como se puede observar en la Figura 1. Con cada fila y con cada columna se realizó un pool conformado por 5 muestras, tomando alícuotas iguales de cada una hasta llegar a un volumen final de 200 uL. De esta manera, por cada matriz se hicieron 10 extracciones y 10 PCR. Cada muestra se realizó por duplicado porque se encontraba formando parte de 2 pools en simultáneo: el de su fila y el de su columna.

Se elaboraron 10 matrices en total utilizando 250 muestras testeadas previamente, 240 negativas y 10 positivas con distintos valores de Ct. Se colocó una muestra positiva en cada matriz, en una posición al azar. La muestra positiva fue detectada mediante la intersección de la fila y columna positivas en la matriz.

Detección por rt PCR: se utilizó el kit AltoStar Sars-CoV-2 1.5 RUO de altona, que detecta específicamente los genes de las proteínas E y S de Sars-CoV-2. Se consideraron detectables aquellas muestras con un cycle threshold (Ct) < 38, para ambos genes. Por otro lado, a aquellas muestras con Ct < 38 para solo uno de los dos genes, se las consideró indeterminadas. Por último, se consideraron no detectables aquellas muestras que no presentaron curva de fluorescencia o que tuvieron un Ct > 38 ya fuera para uno o ambos genes.

Para las rt PCR se utilizó el termociclador z480 de Roche.

Resultados

Detección de SARS-CoV-2 en HNF sin extracción

Los resultados obtenidos se pueden observar en la Tabla I. En la Figura 2, se pueden visualizar las diferencias halladas entre los Ct.

Para analizar la diferencia entre las muestras con y sin extracción de ácidos nucleicos, se calculó, en las muestras positivas, la diferencia de Ct para cada uno de los genes detectados, y a ese valor se lo llamó ΔCt. La medida de los ΔCt para cada uno de los genes estudiados fue de 1,70 para el gen E y de 2,20 para el gen S, con desvíos estándar de 0,66 y 0,53, respectivamente.

Se utilizaron 10 muestras negativas, que resultaron no detectables independientemente del paso de extracción/inactivación utilizado. Se obtuvo total concordancia en la interpretación clínica de las muestras estudiadas.

Detección de SARS-CoV-2 en mezclas de muestras (pooling)

Los valores de Ct de las muestras individuales y de los pools realizados (de fila y columna de cada matriz) se encuentran en las Tabla II y Tabla III. En los gráficos (Figura 3 y Figura 4), se pueden observar para cada gen estudiado las diferencias de Ct entre las muestras individuales y los pools.

También se calculó la media de los ∆Ct para cada uno de los genes con respecto a los pools. Para el gen E, se obtuvieron medias de ∆Ct de 0,32 y 0,63 para los respectivos pools de fila y columna, con desvíos estándar de 2,14 y 1,87. Para el gen S, se realizaron los mismos cálculos y se obtuvieron medias de ∆Ct de 0,16 y 0,41, con desvíos estándar de 2,38 y 2,04. El procedimiento por el cual se realizaron las matrices y la forma de detección de los positivos se esquematiza abajo (Figura 1).

Discusión

En primer lugar, se probó sustituir la extracción por boiling en las muestras obtenidas con agua. Se sabe que esta técnica se utilizó en otros trabajos^1,2,3 y también se utiliza como parte del protocolo de amplificación isotérmica desarrollado en nuestro país, Neokit. En concordancia con estos trabajos, se obtuvieron buenos resultados. Las diferencias de Ct (de aproximadamente 2) se consideraron no significativas, y en este trabajo, se puede ver una concordancia total de la interpretación clínica de las muestras. Con estos resultados se podría pensar que sería un método útil ante una prevalencia alta de la infección, donde los Ct suelen ser bajos, y una diferencia como la hallada no sería entonces significativa. Con esta sustitución, se podrían ahorrar recursos de extracción y purificación. Como beneficio colateral, también se optimizan los tiempos de proceso de las muestras asegurando un resultado con mayor rapidez. Queda pendiente evaluar con muestras obtenidas con otros medios.

En cuanto a las pruebas de pooling en matriz, se pudo apreciar que realizar mezclas no afecta de forma significativa el Ct obtenido por la rt PCR. Las diferencias de Ct son bajas, y se mantiene la interpretación clínica de las muestras. En este caso, se probaron matrices de 25 muestras dispuestas en 5 filas por 5 columnas, realizando 10 extracciones y 10 rt PCR en lugar de las 25 que corresponden a la forma tradicional del proceso, por lo que se ahorran 15 kits de extracción y de rt PCR por cada 25 muestras procesadas. Lo destacable de esta forma de agrupar las muestras, en comparación con el método de pooling tradicional, es la capacidad de detectar la muestra positiva dentro de la matriz mediante la intersección de filas y columnas positivas, sin necesidad de recurrir a realizar en un segundo paso las pruebas individuales; en esto se conserva la agilidad del proceso. Además, como cada muestra se encuentra formando parte de 2 pools en simultáneo, se testean 2 veces en pools diferentes por lo que se eleva el valor predictivo negativo de las muestras no detectables.

Como desventaja se puede considerar que esta técnica es más trabajosa que el flujo tradicional de procesamiento de muestras individuales y, por lo tanto, requiere de personal entrenado, pero, dadas las circunstancias de escasez de reactivos, el beneficio aportado se consideró mayor. Además, su más importante limitación sería la prevalencia de la infección. Ben Ami et al⁴, quienes aplican esta técnica, desarrollaron un programa estadístico para evaluar la forma más eficiente de realizar pooling, y determinaron que es conveniente emplearlo cuando la prevalencia no es mayor que el 10 %, a diferencia del boiling, que es preferible en prevalencias más altas. Su limitación se debe a la forma de detección de los positivos, por intersección de filas y columnas positivas dentro de la matriz, ya que, ante una prevalencia mayor de la infección, con varias muestras positivas por matriz, las intersecciones de filas y columnas positivas serían demasiadas, y, en ese caso, se deberían testear algunas muestras de forma individual, agregando pasos al proceso y perdiendo agilidad. Por este motivo, se considera que es un método que podría potencialmente aplicarse a poblaciones puntuales de pacientes donde la prevalencia se mantiene baja como en la población asintomática. Lohse et al. y Shental et al.^5,6 también demuestran que en estas poblaciones la realización de pools no altera el resultado de las muestras individuales. Dentro de este grupo, se podrían considerar como casos a individuos con contacto estrecho con pacientes positivos confirmados, viajeros, y como controles, a personal de salud asintomático dentro del lugar de trabajo, pacientes prequirúrgicos y muestras recibidas en etapas de pospandemia, con prevalencia de la infección baja.

La evaluación de los métodos estudiados presentó resultados que se consideraron aceptables y abrieron la posibilidad entonces de ahorrar en recursos tanto de extracción como de rt PCR, lo cual responde a las necesidades que surgieron durante la época de pandemia.

Agradecimientos

Agradecemos al personal del laboratorio de Virología por su colaboración en la realización de este trabajo.

Referencias bibliográficas

1. Merindol N, Pépin G, Marchand C, Rheault M, Peterson C, Poirier A et al. SARS-CoV-2 detection by direct rRT-PCR without RNA extraction. J Clin Virol 2020;128:104423.

2. Morecchiato F, Coppi M, Baccani I, Maggini N, Ciccone N, Antonelli A, et al Evaluation of extraction-free RT-PCR methods for faster and cheaper detection of SARS-CoV-2 using two commercial systems. El sevier 2021;112:264-268.

3. Perez V, Blohem Pessoa W, Andrade Galvão B, Soares Sousa E, Dejani N, Campana E, et al Evaluation of alternative RNA extraction methods for detection of SARS-CoV-2 in nasopharyngeal samples using the recommended CDC primer-probe set. Elsevier 2021;1(3):100032.

4. Ben Ami R, Klochendler A, Seidel M, Sido T, Gurel-Gurevich O, Yassour M et al Large scale implementation of pooled RNA extraction and RT-PCR for SARS-CoV-2. Clin Microbiol Infect 2020;26(9):1248-1253.

5. Lohse S, Pfulhl T, Berkó-Göttel B, Geibler T, Gartner B, Smola S et al. Pooling of samples for testing for SARS-CoV-2 in asymptomatic people. Lancet Infect Dis 2020;20(11):1231-1232.

6. Shental N, Levy S, Wuvshet V, Skorniakov S, Shalem B, Ottolengui A et al. Efficient high-throughput SARS-CoV-2 testing to detect asymptomatic carriers. Sci Adv 2020;6(37):eabc5961.

Notas de autor

amartelli@cemic.edu.ar

Información adicional

Conflicto de intereses: Los autores declaran no poseer conflictos de interés público.

Información adicional

redalyc-journal-id: 651