La brucelosis es una zoonosis infectocontagiosa de distribución mundial, conocida desde hace muchos años, sin embargo, continúa siendo un problema sanitario y económico de envergadura ^{2 por las grandes pérdidas que genera, ya que afecta a varias especies de mamíferos, principalmente, animales domésticos (perro), ganado (vacas, cerdos, ovejas, cabras), además de fauna silvestre y marina. El hombre es considerado un huésped accidental. Es causada por bacterias del género Brucella, que incluye distintas especies. B. abortus, B. melitensis, B. suis y B. canis son las principales especies que provocan enfermedad en humanos. En nuestro país, la brucelosis es endémica. En el ser humano, puede presentarse de manera aguda o gradual y evolucionar a la cronicidad o bien, pasar clínicamente inadvertida. El diagnóstico tradicional comienza con la sospecha clínica de la enfermedad, pero muchas veces la sintomatología de la misma es inespecífica, lo que dificulta el diagnóstico clínico, y por eso , la realización de pruebas de laboratorio es de suma importancia. El diagnóstico de laboratorio puede realizarse a través de métodos directos aislando el microorganismo en cultivo de sangre, médula ósea o tejidos o por métodos indirectos (serológicos), a través de la detección de anticuerpos en suero. 3 Si bien el aislamiento del microorganismo es el método de referencia, la mayoría de los pacientes son diagnosticados por métodos indirectos, que son de uso masivo por su mayor simpleza y accesibilidad 2 , ya que no siempre es posible aislar el microorganismo. Existen pruebas serológicas de tamizaje y confirmatorias.}

La brucelosis presenta dos patrones epidemiológicos: el urbano - alimentario por consumo de alimentos contaminados como lácteos no pasteurizados o carnes mal cocidas y el rural - laboral por inhalación de aerosoles con alto inóculo bacteriano o contacto con secreciones de animales enfermos; además, en algunos países como el nuestro, también se considera como un agente de riesgo de transmisión la vía transfusional ^{4,5,6, 7} . En Argentina, por medio de la Ley Nacional 22990 / 83, es obligatorio el tamizaje para detección de brucelosis como infección transmisible por transfusión para B. melitensis, B. abortus y B. suis , pero no, para B. ovis y B. canis, las cuales no están contempladas en la legislación. En nuestro país, la prevalencia estimada de test reactivos para brucelosis en bancos de Sangre osciló entre 0.39% y 1.09% en el período 2009 – 2019 ⁸ . Un resultado reactivo puede corresponder a infección activa, pasada o reacción cruzada (falso positivo). Para los bancos de sangre, actualmente, se utilizan pruebas serológicas de tamizaje. Las características que estas deberían idealmente presentar son: alta sensibilidad y adecuada especificidad, para poder detectar a todos los individuos que podrían estar infectados. El resultado reactivo implica el descarte de la unidad (bolsa de sangre). Dentro de las pruebas de tamizaje, se encuentran las clásicas (Huddleson, Wright, fijación de complemento) y las más modernas (técnica de aglutinación con antígeno tamponado (BPA), prueba de aglutinación con Rosa de Bengala (RB), prueba de microaglutinación rápida en portaobjetos (RSAT)). Actualmente, en los bancos de sangre, las pruebas serológicas más comúnmente utilizadas son los ensayos de aglutinación, donde se emplean suspensiones de bacterias muertas y, de estar presentes los anticuerpos, se produce la reacción visible macroscópicamente como una aglutinación. El valor predictivo negativo de estas pruebas es elevado. La valoración adecuada de sus resultados requiere la utilización de un antígeno de calidad y bien estandarizado, ya que lo contrario es causa frecuente de títulos poco fiables y confusiones diagnósticas ⁹ .

Las cepas recomendadas por los organismos internacionales en la elaboración de las suspensiones antigénicas son B. abortus 1119-3 o 99 S. Estos antígenos permiten detectar anticuerpos anti - B. abortus, suis y melitensis ¹⁵ .

Por su rapidez, gran difusión, practicidad, bajo costo y alta sensibilidad, RB y BPA son las recomendadas para tamizaje en bancos de sangre. Ambas, debido a su bajo pH, privilegian la aglutinación de anticuerpos de isotipo IgG, dado que favorecen la expresión del componente aglutinante de los mismos, lo que las hace más específicas ¹ . BPA es ligeramente más sensible que RB ¹ .

RB es una prueba de aglutinación rápida, muy eficaz, que se utilizó inicialmente como prueba de cribado al permitir una aproximación diagnóstica en pocos minutos. No obstante, la experiencia práctica acumulada le ha concedido un protagonismo que va más allá del correspondiente a una simple prueba de cribado. El medio ácido en el que se efectúa la prueba favorece considerablemente la expresión del componente aglutinante de los anticuerpos que refleja infección actual. Su sensibilidad y especificidad para identificar anticuerpos aglutinantes anti-Brucella es muy elevada, de forma tal que solo excepcionalmente resulta negativa en la fase aguda de la infección y, con muy poca frecuencia, en las fases evolucionadas o crónicas de la enfermedad ^{9 .}

El test de antígenos febriles (AF) de Wiener Lab es otro ensayo de aglutinación disponible comercialmente en nuestro país.

En primer lugar, evaluar la concordancia del observador para la técnica de Rosa de Bengala (RB), que fue implementada en reemplazo de la técnica de antígenos febriles (AF) para el tamizaje de brucelosis en donantes del Banco de Sangre en agosto del año 2020. En segundo lugar, evaluar la concordancia en el ensayo entre la técnica de AF y RB, a la vez que estimar y comparar proporciones de muestras reactivas para brucelosis entre dos períodos durante los cuales se utilizó la técnica AF o la técnica RB y, finalmente, analizar esta diferencia en términos de unidades de sangre descartada.

Se seleccionaron prospectivamente 107 muestras de suero de donantes del Banco de Sangre que concurrieron al Servicio de Hemoterapia del Hospital Nacional Profesor Alejandro Posadas. La selección fue previa a la implementación del test RB, en el período comprendido entre los meses de marzo y agosto de 2020. Estas muestras presentaban resultados reactivos y no reactivos por la técnica AF. Para la realización de la técnica de AF, se utilizó el reactivo de antígenos febriles de Wiener Lab (Santa Fe, Argentina). Las muestras con resultados reactivos fueron tituladas en placa de vidrio, según las especificaciones del fabricante, considerando reactivos aquellos títulos iguales a o mayores de 1/40. A su vez, dichas muestras fueron ensayadas para el test RB utilizando el reactivo de Rosa de Bengala de Monlab Test (Barcelona, España) y observadas a doble ciego por dos observadores entrenados. Las muestras con resultado reactivo fueron tituladas siguiendo las especificaciones del fabricante, quien considera reactivas aquellas muestras con título igual a o mayor de 25 UI/ml.

De esta forma, se evaluó la concordancia entre los observadores para la técnica RB con el coeficiente kappa de Cohen y se aceptó un coeficiente igual o superior a 0,70 (70 %) para considerar una concordancia cualitativa entre ambos.

Evaluación de la concordancia en el ensayo

Se procedió a evaluar la concordancia en el ensayo para las técnicas de AF y RB utilizando 105 muestras de suero de donantes del Banco de Sangre que concurrieron al Servicio de Hemoterapia del Hospital Nacional Profesor Alejandro Posadas en el período comprendido entre los meses de marzo y agosto de 2020; dichas muestras fueron ensayadas en simultáneo para ambas técnicas. Aquellas con resultado reactivo fueron tituladas en cada caso siguiendo las especificaciones del fabricante. Se evaluó la concordancia en el ensayo a través de la utilización del coeficiente kappa de y se aceptó un coeficiente igual o superior a 0,50 (50 %) para considerar una concordancia cualitativa aceptable entre ambas técnicas.

Se realizó un estudio retrospectivo utilizando los resultados obtenidos mediante el sistema de gestión de laboratorio Infinity (Laboratorio Roche SA^®) para las pruebas de AF (Wiener Lab^®) y RB (Monlab Test ^® ) utilizadas durante dos períodos distintos, respectivamente. Para el ensayo AF, se tuvieron en consideración los resultados obtenidos entre el 1/11/2019 y el 31/07/2020 (período AF), mientras que, para el ensayo de RB, se tuvieron en cuenta los resultados entre el 15/8/2020 y el 18/8/2021 (período RB). La población en estudio incluyó individuos de ambos sexos, entre 18 y 65 años, que concurrieron como donantes de sangre al Servicio de Hemoterapia del Hospital Nacional Profesor Alejandro Posadas.

Los resultados fueron extraídos del sistema Infinity (Laboratorio Roche SA^Ⓡ) y analizados mediante el uso del programa estadístico Epidat.

Para cada período, AF y RB, se analizaron la cantidad total de registros, la distribución de resultados para el total de muestras analizadas (equivalente a unidades de sangre donadas) y la proporción de muestras reactivas. Asimismo, se analizó la distribución de resultados según el número de donantes que acudieron al servicio y la proporción de donantes reactivos.

Para calcular el total de los donantes, se tuvieron en cuenta los registros replicados de las muestras analizadas asumiendo de este modo la donación por reposición y seleccionando de cada caso replicado el último de los registros con relación a las fechas. Este criterio se basó sobre el supuesto de que si en la última donación el resultado había sido no reactivo, en donaciones previas también lo había sido; ya que en caso de ser reactivo el individuo es retirado del circuito de donación.

Posteriormente, se efectuó un análisis de comparación de proporciones entre muestras reactivas de cada período y entre población de donantes reactivos de cada período. Se estimó un intervalo de confianza del 95 % para la diferencia de proporciones y se consideró significativa una diferencia superior al 5 %. Se compararon los datos demográficos de sexo y edad de cada período. La distribución por sexo se analizó por comparación de proporciones, mientras que la distribución por edad se analizó a través de gráfico de cajas y se realizó contraste con el test de Mann-Whitney.

Luego de realizar la concordancia entre observadores para la técnica de RB, se pudo observar un índice kappa de Cohen de 0,78 (EE 0,0863), con IC95% (0,61 - 0,95) y valor p: 0,00001. En la Tabla I, se pueden observar seis resultados discordantes (reactivo/no reactivo) entre los dos observadores.

Tabla I. Tabla I. Concordancia entre dos observadores con dos categorías para la técnica RB.

Observador 2	Reactivo	13	3
	No reactivo	3	88

Se pueden observar seis resultados discordantes (reactivo/no reactivo) entre los dos observadores.

La concordancia en el ensayo arroja un índice kappa de Cohen de 0,29 (EE 0,0695), con IC95% (0,15 - 0,43), con un valor p: 0,0001. Si se observan los datos de la Tabla II, se pone de manifiesto el hallazgo de 37 pares de resultados discordantes (reactivo/no reactivo) entre ambos métodos.

Tabla II. Tabla II. Concordancia en el ensayo de antígenos febriles vs, Rosa de Bengala.

Rosa de Bengala	Reactivo	16	1
	No reactivo	36	52

Se pueden observar 37 pares de resultados discordantes (reactivo/no reactivo) entre ambos métodos.

Se obtuvieron mediante el sistema de gestión de laboratorio Infinity (Laboratorio Roche SA^®) 14044 registros, con 14000 registros válidos. Se eliminaron resultados como NM (nueva muestra), NRM (no remite muestra), etc. Del total de 14000 registros, se analizó la distribución por servicio para seleccionar a los donantes de sangre del Servicio de Hemoterapia y resultó un total de 13840 donantes, de los cuales 5913 (42,7%) corresponden al test AF y 7927 (57,3 %), al test RB.

En el período AF, obtuvimos 5908 registros válidos, ya que se eliminaron de la casuística aquellos que no aportaban a los objetivos propuestos; de esta manera, se obtuvo un porcentaje de reactividad de 3,6 % (212 muestras entre 5908 resultados totales). La mayoría de los resultados reactivos obtenidos (178 reactivos de 212) se hallan en el valor de corte de la prueba (1/40).

Al tener en cuenta la donación por reposición, el total de muestras analizadas corresponde a una población menor de donantes. De esta manera, los 5908 registros corresponden a 4998 donantes, ya que 910 muestras fueron analizadas al menos dos veces. La proporción de donantes reactivos para el período AF fue de 4,0 % (198 reactivos de 4998). De la misma forma, podemos observar que la mayor proporción de reactividad se encuentra en el valor de corte de la prueba (1/40), dado que se hallan en este título 164 de los 198 donantes reactivos.

Por otro lado, el período RB comprende 7927 registros, de los cuales 5 fueron eliminados por no aportar resultado significativo a la casuística (por ejemplo, aquellos con resultado como MMR (muestra mal remitida), entre otros). Así, de los 7922 registros válidos, resultaron reactivos 129, de modo que el porcentaje de reactividad para el período RB fue de 1,6 %.

Del mismo modo que para el período AF, se procedió a cuantificar los casos de donantes duplicados para el período RB, es decir, aquellos pacientes que en el período analizado concurrieron dos o más veces a donar al Servicio de Hemoterapia. Así, los 7922 registros corresponden a 7147 donantes; en cada caso duplicado, se seleccionó el último de los registros con relación con las fechas ya citadas. El porcentaje de donantes reactivos para el período RB fue entonces de 1,6 %: 114 de los 7147 donantes. La mayoría de las muestras reactivas (119 de las 129 mencionadas) arrojaron resultados cercanos al valor de corte de la prueba, entre 25 UI/ml y 50 UI/ml. Lo mismo sucedió en el caso de los donantes reactivos testeados por RB: 105 de 114 donantes reactivos evidenciaron títulos bajos de reactividad.

Se procedió al análisis de comparación de proporciones de muestras reactivas de cada período, AF y RB; teniendo en cuenta el IC 95%, el resultado obtenido fue de 1,4 - 2,5 %, con un valor p: 0,00001, lo que demuestra que la diferencia es altamente significativa. Estos resultados pueden observarse en la Tabla III. De este análisis, se desprende que, utilizando el test RB como prueba de tamizaje, cada 200 donaciones se descartan entre 3 y 5 unidades de sangre menos respecto del uso del test AF. .

Si realizamos el mismo análisis de comparación de proporciones, pero teniendo en cuenta la proporción de donantes reactivos en los períodos AF y RB, el IC 95% arroja un resultado de 1,7 - 3,0 %, con un valor p: 0,00001. De igual manera que para el caso anterior, la diferencia es altamente significativa y puede observarse en la Tabla IV.

Además, se realizó la comparación de las proporciones de muestras reactivas en ambos períodos, AF y RB, según el sexo, y no se encontró una diferencia significativa en los resultados entre ambas poblaciones de donantes (ver Figura 1).

El test de Mann - Whitney se utilizó para contrastar la distribución por edades de los donantes reactivos en ambos períodos, y se obtuvo un p: 0,347, lo que indica que no existe una diferencia significativa en la distribución de la variable edad entre ambos grupos (ver Figura 2).

En la Figura 3 se pone de manifiesto que no se observa diferencia significativa en el porcentaje de reactividad entre el número de muestras y donantes para un mismo test (3,6 % muestras y 4,0 % donantes reactivos por AF) (1,6 % muestras y 1,6 % donantes reactivos por RB); pero por el contrario se observa una diferencia significativa en el porcentaje de reactividad entre ambos períodos AF/RB.

Tabla III. Tabla III. Proporción de muestras reactivas para test AF y RB.

	Antígenos febriles	Rosa de Bengala
N° muestras reactivas	212	129
Tamaño muestral	5908	7922
Proporción (%)	3,6	1,6

Se observa una diferencia altamente significativa en la proporción de casos reactivos en ambos períodos.

Figura 1. Figura 1. Distribución por sexo para los test antígenos febriles y Rosa de Bengala. Figura 1. Distribución por sexo para los test antígenos febriles y Rosa de Bengala. No se observan diferencias significativas por sexo entre ambos métodos.

Figura 2. Figura 2. Distribución por edad para los test antígenos febriles y Rosa de Bengala. Figura 2. Distribución por edad para los test antígenos febriles y Rosa de Bengala. No se observan diferencias significativas por rango etario entre ambos métodos.

Figura 3. Figura 3. Proporción de reactividad en dos períodos los test antígenos febriles y Rosa de Bengala. Figura 3. Proporción de reactividad en dos períodos los test antígenos febriles y Rosa de Bengala.