La investigación experimental se realizó en los laboratorios de Química (extracción del hidrolato de O. quixos) y Biología (identificación y conteo de garrapatas) de la Universidad Estatal Amazónica [UEA], ubicada en Puyo, Pastaza. Dirección Matriz: Vía Napo km 2 ½, Paso Lateral S/N, donde se llevaron a cabo los procedimientos experimentales y las observaciones necesarias para el análisis (Figura 1).

Figura 1
Ubicación geográfica de la zoma de estudio.

Figure 1. Geographical location of the study area.

El estudio es de tipo experimental y cuantitativo, dado que manipula la concentración del hidrolato y el tiempo de inmersión para analizar su efecto sobre la mortalidad de garrapatas. Este diseño establece relaciones causa-efecto entre variables controladas y las respuestas obtenidas (Torales y Barrios, 2023). Además, tiene un enfoque exploratorio y aplicado, evaluando un extracto natural como alternativa sostenible en el manejo de ectoparásitos.

Las hojas frescas de O. quixos fueron recolectadas en los predios de la UEA. Se utilizó una cortadora de hojas para realizar la colecta, obteniendo un total de 6,5 kg. Las hojas recolectadas se colocaron en fundas entretejidas con hilo de plástico transpirables y limpias para evitar contaminación, se transportaron inmediatamente al laboratorio para procesar en el extractor de aceite por arrastre de vapor marca FIGMAY, Buenos Aires, Argentina.

El hidrolato se obtuvo mediante destilación por arrastre de vapor, siguiendo la metodología descrita por Briones-Sornoza y Guerrero-Intriago (2019), utilizando un extractor de aceites esenciales en el laboratorio de Química de la UEA. Se añadieron 2 litros de agua al extractor, asegurando las tapas para evitar fugas de vapor y se colocaron hojas frescas de O. quixos dentro del equipo. El calor aplicado generó vapor que rompió las células vegetales, liberando compuestos volátiles que se condensaron en forma líquida. Se realizaron dos ciclos de extracción. El primero de 10h30 a 12h35 y el segundo de 13h40 a 15h00, obteniendo un total de 1.387,7 g de hidrolato. El producto rotulado como "Hidrolato de Ocotea" fue sellado con papel parafilm y almacenado a 5 °C para evitar su degradación.

Las soluciones de hidrolato se prepararon siguiendo la ecuación [1] y almacenadas en vasos de precipitación de 600 ml. Las concentraciones fueron: 100% (hidrolato puro, sin dilución), 62,5% (312,5 ml de hidrolato puro más 187,5 ml de agua) y 25,0% (125 ml de hidrolato puro más 375 ml de agua).

[1]

Donde, C₁∶Concentración inicial del hidrolato (100%), V₁: Volumen del hidrolato puro utilizado, C₂: Concentración final deseada (25% o 62,5%), V₂: Volumen total (500 ml).

No se realizó la caracterización del hidrolato, se infiere su composición química por lo evidenciado en trabajos anteriores que refieren la presencia de los compuestos biactivos del aceite esencial potencialmente potentes dentro de la fracción de agua que conforma el hidrolato en diferentes especies de canela, según Arteaga-Crespo et al. (2021) en canela amazónica O. quixos y según Wang et al. (2024) en hidrolato de Cinnamomum osmophloeum Kanehira.

La recolección de garrapatas se realizó en las instalaciones ganadera de la provincia de Pastaza, tomadas de los bovinos en las regiones de la ingle, detrás de las orejas, cuello, ubres, escroto y la zona perineal, concordando con lo reportado por Cuesy León et al. (2021) en bovinos infestados. Se recolectaron 300 garrapatas, de las cuales se seleccionaron 170, que fueron distribuidas aleatoriamente en cajas Petri para los tratamientos.

La identificación de la especie de garrapata se realizó mediante el uso del estereoscopio trinocular EUROMEX NZ1903-P, para observar los caracteres morfológicos y con la ayuda de las claves taxonómicas señaladas por Acevedo-Gutiérrez et al. (2020). Se determinó que las garrapatas para este estudio correspondían a la especie Rhipicephalus (Bhoophilus) microplus, especie muy común en la zona, las mismas que se hallaron en diferentes estadios de desarrollo, con predominio de ninfa y adulto.

Las garrapatas se distribuyeron aleatoriamente en cajas Petri de plástico (96 x 16 mm) perforadas para permitir ventilación, con 10 garrapatas por caja, sumando un total de 170 garrapatas. Las cajas fueron etiquetadas según los tratamientos correspondientes, especificando la dosis y el tiempo de exposición dentro de cada concentración del hidrolato, según el diseño planteado y, según los tratamientos indicados en la Tabla 1. Las garrapatas se sumergieron en las soluciones correspondientes, controlando el tiempo de inmersión con un cronómetro. Posteriormente, fueron retiradas y devueltas a sus respectivas cajas Petri.

La evaluación de la mortalidad se realizó a partir de las 08h00 cada 4 h; para verificar que estuvieran muertas y no simplemente inmóviles, se utilizó un pincel fino para estimular su movilidad mediante contacto mecánico suave. Durante toda la fase de laboratorio se mantuvo las condiciones controladas de temperatura 28±2 °C y humedad relativa 80-90%. Para los cálculos de mortalidad se utilizó la ecuación [2].

[2]

Los tratamientos se dispusieron en un diseño experimental completamente aleatorizado [DCA], siguiendo un enfoque similar al utilizado por Valenzuela Loor et al. (2024). Se consideraron tres concentraciones de hidrolato (25,0%; 62,5%; y, 100%), con tres tiempos de inmersión (1,0; 3,5; y, 6,0 minutos) y dos controles (positivo y negativo). A los controles se les aplicó el mismo tiempo de inmersión que a los tratamientos, es decir, 6 minutos, para asegurar condiciones experimentales homogéneas (Tabla 1). Se empleó agua destilada como control negativo, y como control positivo la aplicación del garrapaticida comercial Biorboss-Farbiovet, compuesto por cipermetrina 95%, diclorvos (inhibidor de la acetilcolinesterasa) y fipronil (bloqueador de los canales de cloruro regulados por GABA), el cual fue diluido un 1 ml L^-1 de agua (según dosis recomendada por el fabricante, y utilizada en la producción ganadera). Transcurrido el tiempo de inmersión (6 minutos) se procedió a colocar las garrapatas nuevamente en cajas Petri, donde se midió la mortalidad durante 7 días, cada 4 horas. La mortalidad fue la única variable de respuesta considerada para evaluar el efecto de los tratamientos.

Tabla 1
Diseño experimental con las concentraciones de hidrolato y tiempos de inmersión.

Table 1. Experimental design with hydrolate concentrations and immersion times.

El análisis se realizó en el software Design-Expert® 12, donde se calcularon los valores de suma de cuadrados, grados de libertad, medias cuadráticas, valores F y p. La adecuación del modelo fue evaluada mediante los coeficientes de determinación R² y R² ajustado, así como por el cálculo del error puro y la prueba de falta de ajuste (Lack of Fit). Se generaron las ecuaciones finales en términos de factores codificados y reales para la predicción de la respuesta según los niveles de cada variable.

Se aplicó un Análisis de Varianza [ANOVA] factorial considerando dos factores: la concentración del hidrolato de O. quixos (Factor A) y el tiempo de inmersión (Factor B), evaluados en tres niveles cada uno. El diseño incluyó también el término de interacción entre factores (A×B), permitiendo identificar posibles efectos combinados entre concentración y tiempo. Se empleó un nivel de significancia del 5% (p < 0,05) para evaluar la influencia estadística de cada término sobre la variable de respuesta.

El ANOVA factorial evidenció que la concentración del hidrolato (p < 0,0001) y la interacción concentración-tiempo (p < 0,0001) influyeron significativamente en la mortalidad de R. microplus. El factor concentración presentó el mayor impacto (SC = 39,24), seguido de la interacción entre los factores (SC = 0,70). El tiempo de inmersión no mostró un efecto significativo por sí solo (p = 0,1182). La baja magnitud del error puro (SC = 0,1067) permitió una adecuada estimación del modelo, cuyos resultados explican la variabilidad observada (Tabla 2). Estos datos demuestran que la efectividad del hidrolato depende principalmente de su concentración y su interacción con el tiempo de exposición.

Tabla 2
ANOVA factorial para la mortalidad de garrapatas.

Table 2. Factorial ANOVA for tick mortality.

Los resultados muestran que la mortalidad de R. microplus varió en función de la concentración del hidrolato y el tiempo de inmersión. El tratamiento con 100% de hidrolato durante 6 minutos presentó una mortalidad de 87,00%, valor cercano al control positivo (C+), que alcanzó el 99,10% (Figura 2). La aplicación de la misma concentración durante 1 minuto resultó en una mortalidad del 81,00%, indica una alta eficacia incluso con tiempos cortos de exposición. Estos datos permiten confirmar la presencia de una respuesta dosis-tiempo.

Los tratamientos de 62,5% aplicado durante 3,5 minutos, registraron una mortalidad del 67,00%, mientras que las concentraciones más bajas mostraron una eficacia reducida. El tratamiento con 25% de hidrolato durante 1 minuto alcanzó una mortalidad del 49,67 % y con 6 minutos descendió a 46,00%. Estos resultados muestran que, a menor concentración, la acción garrapaticida disminuye, incluso con tiempos de inmersión prolongados, lo cual reafirma la relación directa entre la dosis y el efecto biológico observado.

Figura 2
Mortalidad observada (%) de R. microplus bajo diferentes concentraciones y tiempos de inmersión del hidrolato.

Figure 2. Observed mortality of R. microplus under different concentrations and immersion times of the hydrolate.

El control negativo (C−) tratado con agua destilada registró la menor mortalidad (0,04%), confirmando que el efecto letal en los tratamientos experimentales puede atribuirse al hidrolato. Estos hallazgos coinciden con investigaciones realizadas por Miranda Reyes et al. (2023), quienes emplearon aceite esencial de Cinnamomum zeylanicum con una eficacia del 100% contra larvas de R. microplus. Complementariamente, en Ecuador, estudios realizados en los cantones Quilanga y Loja con extractos de Melinis minutiflora y Lantana camara también reportaron mortalidades significativas en larvas y adultos del mismo género (Vacacela-Ajila et al., 2023).

La actividad biológica observada puede explicarse por la presencia de compuestos como el (E)-cinnamaldehído (27,03 %) y el (E)-acetato de cinamilo (36,44 %) (Arteaga-Crespo et al., 2021), conocidos por sus propiedades insecticidas y antifúngicas (Alvarado Aguilar et al., 2019). Su toxicidad ha sido asociada a la alteración de la permeabilidad celular y la inhibición de enzimas para la homeostasis de los artrópodos. Además, Scalvenzi et al. (2019) señalaron que aceites esenciales con 1,8-cineol, sabineno y α-pineno, también presentes en O. quixos, exhiben efectos larvicidas y acaricidas relevantes frente a insectos hematófagos.

El Half-Normal Plot muestra que la concentración del hidrolato fue el factor con mayor efecto estandarizado sobre la mortalidad de R. microplus, con un valor aproximado de 3,6. La interacción entre concentración y tiempo (AB) mostró un efecto menor pero aún significativo, mientras que el tiempo de exposición (B) se ubicó próximo a los límites del error estimado (Figura 3). Estos resultados confirman que la concentración es el factor principal en la eficacia acaricida del tratamiento, seguida de su interacción con el tiempo de inmersión.

Figura 3
Half-Normal Plot de los efectos de los factores en la mortalidad.

Figure 3. Half-Normal plot of the effects of factors on mortality.

Según Arteaga-Crespo et al. (2021), este comportamiento puede explicarse por la acción de compuestos como el (E)-cinnamaldehído y el (E)-acetato de cinamilo, los cuales interfieren en rutas metabólicas vitales de los ectoparásitos y alteran la estabilidad de sus membranas celulares.

El Diagrama de Pareto muestra que la concentración del hidrolato es el factor con mayor impacto sobre la mortalidad de R. microplus con un valor t aproximado de 54,25. La interacción concentración-tiempo (AB) también presentó un efecto significativo, mientras que el tiempo de exposición (B) no superó el límite de Bonferroni, por lo que se considera estadísticamente no significativo (Figura 4). Esta jerarquización reafirma que la eficacia del tratamiento depende principalmente de la concentración del hidrolato, mientras que el tiempo actúa en combinación, pero no de forma aislada. Según Durán Aguirre et al. (2020), la toxicidad de los aceites esenciales varía en función de la dosis y la interacción entre sus compuestos activos y la fisiología del artrópodo objetivo.

Figura 4
Diagrama de Pareto sobre los efectos de los factores en la mortalidad.

Figure 4. Pareto diagram of the effects of factors on mortality.

La interacción entre los factores indica que la concentración del hidrolato y el tiempo de inmersión influyen en la mortalidad. La línea roja (6 minutos) y la línea negra (1 minuto) muestran un ascenso progresivo en la mortalidad a medida que aumenta la concentración, confirmando que el efecto más relevante corresponde a la cantidad de compuesto aplicado (Figura 5). A altas concentraciones (100%), se observa una mortalidad elevada con independencia del tiempo, mientras que a concentraciones bajas (25%) el tiempo de exposición mejora ligeramente la respuesta, aunque sin alcanzar niveles letales comparables.

Figura 5
Trama de interacción entre concentración y tiempo en la mortalidad.

Figure 5. Interaction plot between concentration and time on mortality.

Estos resultados muestran que el efecto del tiempo adquiere mayor relevancia únicamente cuando la dosis es reducida, debido a la necesidad de mayor absorción para lograr un efecto tóxico suficiente. En estos casos, otros factores como la resistencia individual, la presencia de oviposición o la variabilidad biológica pueden influir sobre la mortalidad observada. Estos hallazgos coinciden con los reportados por González Puetate et al. (2023), quienes indicaron que los aceites esenciales afectan la fisiología de los artrópodos, interfiriendo en procesos metabólicos esenciales y reduciendo su viabilidad, lo cual respalda el uso de extractos vegetales como alternativas viables frente a acaricidas sintéticos.

En las figuras de contorno (Figura 6A) y de superficie de respuesta (Figura 6B), se observa que la mayor mortalidad de R. microplus se alcanzó con concentraciones superiores al 85% y tiempos de exposición cercanos a los 6 minutos. Los valores más bajos de ambos factores se asociaron con una disminución progresiva en la eficacia del tratamiento, reflejando una relación directa entre el aumento de concentración y la mortalidad del ectoparásito. La zona azul del gráfico representa la menor respuesta biológica, mientras que la zona roja muestra el punto óptimo de acción del hidrolato.

Figura 6
Superficie de respuesta (A) y contorno de los efectos sobre la mortalidad de las garrapatas R. microplus (B).

Figure 6. Response surface (A) and contour plot of the effects on the mortality of R. microplus ticks (B).

La superficie de respuesta muestra una distribución suave, continua y ascendente. Este comportamiento indica que la mortalidad puede predecirse de manera confiable en función de los niveles de concentración y tiempo aplicados. Estos resultados coinciden con los observados en pruebas con extractos de Nicotiana tabacum y Couroupita guianensis, donde se documentó una relación directamente proporcional entre concentración y mortalidad, así como entre tiempo de exposición y mortalidad en larvas de R. microplus (Molina et al., 2025).

El bajo impacto de los valores de Leverage (0,333) y de la Distancia de Cook (< 0,391) indica que ninguna observación influye de manera significativa en el ajuste del modelo de regresión (Tabla 3). En estudios similares, Castillo-Garit et al. (2021) señalaron que la implementación de modelos matemáticos robustos permite minimizar la dispersión y mejorar la confiabilidad de la predicción en toxicología computacional y farmacocinética.

Los hallazgos de este estudio refuerzan la aplicabilidad del modelo predictivo para estimar la mortalidad de R. microplus con alta precisión. Esto permite proyectar con mayor seguridad los resultados esperados ante variaciones en la concentración del tratamiento y el tiempo de exposición, representando una herramienta útil para la toma de decisiones en estrategias de control biológico.

Los datos muestran que las observaciones con valores reales de mortalidad cercanos al 50% presentan las mayores desviaciones (orden 3), mientras que los tratamientos con valores superiores al 80% muestran predicciones más ajustadas. Esto indica que el modelo tiene mayor precisión en condiciones de alta concentración y exposición prolongada. Estos resultados coinciden con los reportes de Lagunes-Quintanilla et al. (2024), quienes afirmaron que la efectividad de tratamientos acaricidas se ve influida por la dosis y el tiempo de acción sobre R. microplus.

La constante de mortalidad natural estimada (4,06 %) en ausencia del hidrolato es baja, lo que indica una mejora en el ajuste del modelo predictivo (ecuación [3]). Este valor es coherente con estudios como el de De Marchi et al. (2023), donde la mortalidad en el control negativo no superó el 10%. La baja intercepción indica una menor influencia de covariables externas, como el estrés por manipulación o condiciones microambientales dentro de las cajas Petri, las cuales han sido asociadas con incrementos en la mortalidad sin intervención acaricida (Ojeda-Chi et al., 2010). La consistencia entre el modelo y los datos experimentales respalda la confiabilidad del ajuste y refuerza su utilidad como herramienta para la optimización del uso del hidrolato en el control biológico de Rhipicephalus microplus.

[3]

El modelo presentó un coeficiente de determinación (R²) de 0,9973, indicando que el 99,73% de la variabilidad en la mortalidad puede explicarse por los factores evaluados. Además, el R² ajustado (0,9963) y el R² predicho (0,9940) evidencian una alta capacidad de generalización del modelo, con una diferencia menor a 0,2, lo que valida su fiabilidad estadística. El coeficiente de determinación obtenido es considerado óptimo para la predicción de procesos biológicos, de acuerdo con los criterios establecidos por Li et al. (2021).

Tabla 3
Reporte de valores observados y predichos de mortalidad en el modelo.

Table 3. Report of observed and predicted mortality values in the model.

* RIE: Residuo Internamente Estandarizado, REE: Residuo Externamente Estandarizado, DC: Distancia de Cook, INF: Influencia en el Valor Ajustado.

RIE: Internally Standardized Residual, REE: Externally Standardized Residual, DC: Cook's Distance, INF: Effect on Adjusted Value..