INTRODUCCIÓN

Uno de los problemas fitosanitarios más importante en el cultivo de la papa lo representan las enfermedades causadas por hongos tales como: Phytophthora infestans, Fusarium spp., Alternaria solani y Rhizoctonia solani (Guchi, 2015). R. solani tiene una distribución mundial y ocasiona pérdidas en hortalizas, plantas ornamentales y perennes. Es uno de los principales patógenos en el cultivo de la papa, provoca cáncer de tallo y estolón, así como costras sobre los tubérculos (Bienkowski et al., 2010), reduce la emergencia de los brotes, el vigor de la planta y los tubérculos infectados se agrietan o deforman (Tsror et al., 2001). Las hifas de este hongo tienen la particularidad de anastomosarse, condición que se ha tomado en cuenta para clasificarlo en grupos de anastomosis (GA) (Montero Tavera et al., 2013). Los aislados de R. solani obtenidos de papa generalmente se han identificado como miembros del grupo de anastomosis 3 (GA3) (Chavarro, 2011).

El GA3 se caracteriza porque en la superficie de los tubérculos forma esclerocios (masas compactas de micelio, cuyas células han reducido su tamaño y adquirido el color negro por la presencia del pigmento melanina), soporta temperaturas bajas y afecta especialmente a la papa y a las raíces de la cebada (Anguiz y Martin, 1990). En la mayoría de las regiones productoras de papa en México, el uso de fungicidas constituye la practica más común para el control de este patógeno; sin embargo, los resultados han sido muy variables posiblemente porque los grupos de anastomosis de R. solani muestran diferente sensibilidad a fungicidas (Chávez Barragán et al., 2011). El uso indiscriminado de agroquímicos ha tenido grandes consecuencias, ya que se han detectado aislados de hongos resistentes a Pencycuron sobre R. solani (Hernández Castillo et al., 2005).

Diversos hongos de los géneros de Penicillium, Trichoderma, Gliocladium y Aspergillus han sido identificados como potenciales agentes de control biológico contra varios fitopatógenos del suelo (Reyes Ibarguen y Torres González, 2011). Trichoderma spp. y Gliocladium spp. han mostrado los mejores resultados, ya que ambos hongos ejercen su acción mediante diferentes mecanismos, entre los que juegan un rol importante el parasitismo, la competencia, la antibiosis y los compuestos volátiles (Osorio Hernández et al., 2014). Especies de Trichoderma han sido estudiadas como antagonistas de los patógenos Rhizoctonia solani (Kühn), Pythium ultimum (Trow) y Sclerotinia trifoliorum (Eriks) (Kandula et al., 2015). En otros modelos de biocontrol se están empleando especies de Trichoderma y Rhizoctonia no patogénica consideradas como hipovirulentas (binucleadas) (Carling et al., 2002), para reducir la severidad de la costa negra (R. solani). Por lo anterior, el objetivo fue evaluar a nivel in vitro diferentes aislados de Trichoderma spp. contra tres cepas de R. solani.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se evaluaron 31 cepas de Trichoderma aisladas de suelo, semilla y plantas colectadas en el noreste de México, de las cuales 14 fueron identificadas previamente a nivel molecular (Osorio Hernández et al., 2011). Se evaluaron tres cepas de R. solani (TJ53 de Tlapalpa, Jalisco; ACH42 de Aldama, Chihuahua y HSO56 de Huatabampo, Sonora) aisladas de tubérculos de papa (Solanum tuberosum) con síntomas de la enfermedad, las cuales fueron identificados por Chávez Barragán et al. (2011). Todos los antagonistas y patógenos se mantuvieron en tubo con medio de cultivo PDA inclinado a 4 ºC. Los microorganismos fueron incrementados en cajas Petri con medio de cultivo PDA, por resiembra de una porción (5 mm de diámetro) de micelio, tanto de Trichoderma spp., como del fitopatógeno. Se incubaron a 28 ºC durante dos días para Trichoderma spp. y tres días para R. solani, cepas TJ53, ACH43 y HSO56 (resistente a Pencycuron).

Evaluación en cultivos duales de Trichoderma contra R. solani

En la evaluación del antagonismo de Trichoderma spp. contra R. solani se utilizaron cultivos duales, para esto se utilizó la metodología de Cherif y Benhamou (1990). En esta etapa se determinó cuantitativamente la zona de intersección o traslape entre el hongo antagonista y el fitopatógeno. En cajas Petri con PDA se depositó en un extremo un disco de 5 mm de diámetro con micelio activo (previamente crecido en PDA) de colonias del fitopatógeno de 5 días de edad y en el otro extremo se colocó un disco de micelio y PDA de 5 mm de diámetro con Trichoderma spp.

Las cajas se incubaron a 28 ºC y se observaron cada 24 h para registrar el número de días al primer contacto entre el antagonista y el fitopatógeno, se midió el crecimiento de ambas colonias (cm) y el diámetro de intersección y/o traslape (cm). El antagonismo se clasificó según la escala propuesta por Bell et al. (1982). El número de tratamientos para esta prueba correspondió a las 31 cepas de Trichoderma spp. (las que se tenía en ese momento) distribuidos bajo un diseño completamente al azar con cuatro repeticiones.

Efecto de metabolitos volátiles de Trichoderma contra R. solani

En la prueba de metabolitos volátiles de Trichoderma spp. contra R. solani (HSO56) se utilizaron cajas Petri con medio PDA, donde se depositó un explante de 5 mm de diámetro de Trichoderma spp. y se incubó a 28 ºC por 1 día. Con un sacabocados de 1.5 cm de diámetro y en condiciones asépticas se perforó la tapa de las cajas Petri con Trichoderma spp. y se unió a la caja de Petri de R. solani (la caja Petri en la cual se depositó el hongo fitopatógeno se colocó sin tapa) y enseguida se selló con kleen pack. La caja Petri que contenía el patógeno se colocó en la parte inferior las primeras 24 h para que el disco de 5 mm se adhiriera al medio de cultivo con su micelio y evitar así que el explante cayera por el orifico de la caja Petri inoculada con Trichoderma spp. Se invirtieron las placas, para que de esta forma los compuestos volátiles producidos por las cepas de Trichoderma circularan por el orificio de la caja donde se depositó el disco del fitopatógeno.

Los tratamientos se mantuvieron en observación hasta que el testigo (fitopatógeno sin Trichoderma) cubrió la caja Petri y se reportó en centímetros (cm) el crecimiento micelial de R. solani. El número de tratamientos correspondió a las 31 cepas de Trichoderma spp., distribuidas bajo un diseño completamente al azar con cuatro repeticiones. La variable evaluada fue el porcentaje de inhibición del crecimiento micelial de R. solani, que se determinó con la fórmula: % de inhibición micelial= [((D1-D2)/D1)*100]; donde D1= diámetro de la colonia de R. solani en cajas con PDA libre de Trichoderma y D2= diámetro de la colonia de R. solani creciendo con Trichoderma.

Efecto de metabolitos no volátiles de Trichoderma contra R. solani

En el ensayo del efecto de sustancias tóxicas de Trichoderma spp. sobre R. solani (HSO56) se probaron tres especies de Trichoderma: T. asperellum (T2, T3, T4, T8, T10, T14, T18, T30 y T31), T. rossicum (T1), T. hamatum (T25) y T15 sin identificar a nivel especie; se utilizaron matraces Erlenmeyer (250 ml) previamente esterilizados, con medio de cultivo líquido a base de papa fresca-dextrosa. Los matraces con 50 ml de medio se inocularon con tres discos de micelio y PDA de 5 mm de diámetro de Trichoderma spp., de cultivos vigorosos de cinco días de edad. Los matraces se mantuvieron en agitación constante a 100 r.p.m. a 28 ºC durante 12 días. El sobrenadante de crecimiento se filtró dos veces a vacío en papel Whatman no. 44; se filtró en membrana Millipore de 0.22 µm para obtener el extracto de cada cepa de Trichoderma.

El extracto obtenido se mantuvo a 4 ºC hasta su utilización en la evaluación de los metabolitos secundarios no volátiles de Trichoderma contra R. solani (HSO56); para esto, en la superficie del medio de PDA en cajas Petri se agregó 200 µL de los metabolitos obtenidos de Trichoderma spp., en seguida en el centro de la caja Petri se depositó un disco de micelio de 5 mm de R. solani. Se incubó a 28 ºC hasta que el testigo llenó la caja Petri (5 días), transcurrido este tiempo se determinó el porcentaje de inhibición de R. solani con la fórmula descrita en la prueba anterior.

Análisis de resultados

Se utilizó un diseño completamente al azar con 14 tra-tamientos y cuatro repeticiones. Los datos obtenidos de cada uno de los ensayos se sometieron a un análisis de varianza (ANOVA) que permitió detectar diferencias entre tratamientos; para la comparación múltiple de medias se utilizó la prueba de Tukey (P≤0.05) y se analizó con el programa estadístico SAS. En el caso de los datos en porcentajes, antes de someterlos al ANOVA se les realizó la transformación angular de ar-coseno √x+1 (Steel y Torrie, 1986) con el propósito de ajustar los datos.

RESULTADOS

El sobrecrecimiento de las cepas de Trichoderma spp. sobre R. solani (TJ53) (traslape) varió de 6 a 3.32 cm (Tabla 1). El análisis de varianza mostró diferencia significativa (P<0.0001) entre los tratamientos. De las mismas, 14 aislados de Trichoderma mostraron el máximo efecto antagónico según la escala de Bell et al. (1982), estas cepas se ubicaron en la clase 1; sin embargo, en la comparación de medias (Tabla 1), 14 de las 31 cepas se comportaron de manera similar.

Por otro lado, en el tratamiento de R. solani (ACH42) con las 31 cepas de Trichoderma, mostraron diferencia significativa entre los tratamientos (P≤0.0001). El sobrecrecimiento (traslape) de 31 cepas de Trichoderma sobre R. solani (ACH42) fluctuó de 6 a 2.97 cm (Tabla 1), de los cuales 6 aislados mostraron el máximo efecto antagónico y de estos, 5 pertenecen a T. asperellum (T2, T8, T16, T18 y 31) y uno a T. hamatum (T25). Es importante destacar que en los aislados de Trichoderma que cubrieron totalmente la superficie del medio en caja Petri se observó abundante esporulación.

La evaluación de R. solani (HSO56) en el sobrecrecimiento (traslape) con las 31 cepas de Trichoderma fluctuó de 5.27 a 2.97 cm (Tabla 1), además el análisis de varianza mostró diferencia significativa entre los tratamientos (P≤0.0001). Según la escala de Bell et al. (1982), T. asperellum (T1, T4, T16, T17, T18) y T19 (sin identificar especie) fueron los más sobresalientes, ya que estos se ubicaron en la clase 1. Por otra parte, R. solani (HSO56) manifestó mayor crecimiento en comparación con las demás cepas (TJ53 A y ACH42 A), lo anterior se atribuye a la resistencia que ha mostrado al fungicida de Pencycuron (Chávez et al., 2011).

Es importante mencionar que Trichoderma spp. presentaron capacidad antagónica; ya que cuatro cepas (T2, T8, T16, T31) coinciden en el sobrecrecimiento sobre R. solani (TJ53 A y ACH42 A) y tres mostraron sobrecrecimiento sobre el mismo patógeno (TJ53 y HSO56) (Figura 1); cabe destacar que T. asperellum (T18) mostró traslape con los tres aislados de R. solani (TJ53, ACH42 y HSO) (Tabla 1), además estos aislados de Trichoderma se ubicaron en la clase 1 de la escala de Bell et al. (1982).

La inhibición del crecimiento micelial de R. solani (HSO56 A) inducida por los metabolitos volátiles producidos por las 31 cepas de Trichoderma osciló de 7.81 a 51.56% (Tabla 1), de las cuales 23 manifestaron cierta inhibición micelial sobre R. solani, además el patógeno mostró crecimiento irregular; sin embargo, no expresaron diferencia significativa (P≤0.0009) entre los tratamientos. Los metabolitos secundarios no volátiles producidos por Trichoderma spp. mostraron efecto inhibitorio contra R. solani (HSO56), la cual varió de 9.4 a 2.3% (Figura 2); se observó que T. rossicum (T1) y T. asperellum (T14, T16) expresaron mayor efecto inhibitorio (P≤0.0001) en comparación con las cepas T8 y T18 de T. asperellum; mientras que T. hamatum (T25) y otras cepas de T. asperellum (T2, T3, T4, T10, T17, T30 y T31) no mostraron actividad inhibitoria de R. solani, la cual indica que la especie no es determinante en la mayor o menor proporción y/o tipos de metabolitos secundarios no volátiles (Figura 2). Además de lo anterior, se observó un atípico y con poco crecimiento R. solani con todas las cepas evaluadas.

DISCUSIÓN

En los ensayos realizados en esta investigación se observó que no todas las cepas evaluadas de Trichoderma tienen la misma capacidad de inhibir el crecimiento micelial de R. solani. Es decir, la capacidad antagónica de Trichoderma spp. es variable debido a que cada especie puede tener diferente mecanismo de acción, además de capacidad de esporulación y crecimiento (Osorio Hernández et al., 2011). En el mismo sentido Küçük y Kivanç (2003) mencionaron que T. harzianum mostró

una inhibición de 88% sobre R. solani en cultivos duales, además observaron que no todas las cepas de Trichoderma pertenecientes a la misma especie tienen la misma efectividad de inhibición; resultados que coinciden con esta investigación. Por otro lado, se observó que el tiempo de contacto entre Trichoderma spp. y R. solani (TJ53, ACH42, HSO56) fue de dos días, similar a lo obtenido por Michel Aceves et al. (2005) con T. harzianum contra S. rolfsii; pero que difiere para F. oxysporum f. sp. lycopersici, debido a que fue de 5 días. Lo anterior también coincide a lo descrito por Reyes Rondón et al. (2007), quienes reportaron que T. harzianum presentó una elevada actividad antagónica e hiperparasítica contra R. solani y Pyriculariagrisea, añaden que no todas las cepas de Trichoderma tienen el mismo nivel de competencia contra estos patógenos. Por otro lado, De Marco et al. (2004) y González et al. (2012) evidenciaron que Trichoderma spp. producen diversas enzimas, tales como glucanasas, quitinasas, celulasas, proteasas y amilasas, que les confiere la capacidad para destruir la pared celular del fitopatógeno. Otros estudios indican que especies de Trichoderma producen sustancias volátiles; sin embargo, en este estudio no se encontró efecto inhibitorio de R. solani por compuestos volátiles, lo que difiere de lo reportado por Küçük y Kivanç (2003), quienes aseveran que T. harzianum mostró efecto inhibitorio por compuestos volátiles sobre R. solani, R. cereales, Dreshelera sorokiniana, F. culmorum, F. moniliforme, Gaeumnnomyces graminis var. tritici y Sclerotium rolfsii. Otros estudios mencionan que Trichoderma produce compuestos volátiles que provocan un desarrollo micelial menos denso y reducen el tamaño de la colonia de P. nicotianae (Stefanova et al., 1999), lo anterior concuerda con lo obtenido en este estudio.

En la prueba de la actividad de metabolitos secundarios no volátiles de Trichoderma spp. contra R. solani se observó un crecimiento atípico y poco abundante de R. solani en todas las cepas evaluadas. Por otra parte, Küçük y Kivanç (2003), mencionaron que una de las siete cepas que ensayaron de T. harzianum mostró 100% de inhibición por sustancias no volátiles sobre R. solani y S. rolfsii, así como que no todas las cepas de Trichoderma pertenecientes a la misma especie tienen el mismo porcentaje de inhibición, lo cual coincide con los resultados de esta investigación. LeLay et al. (2007) reportaron que Trichoderma spp. mostraron de 14 a 27% de inhibición en el crecimiento micelial de Rosellinia necatrix, mencionaron también que algunas cepas de Trichoderma estimularon el crecimiento del patógeno. Esto se atribuye a la poca concentración de meta-bolitos en el sobrenadante como gliotoxina, viridina, pacibasina, trichodermina, furanona, trichorziamina y 6-pentil-α-pirona.

CONCLUSIONES

T. asperellum (T18 y T16) fue la cepa que mostró efecto antagónico sobre R. solani (TJ53, ACH42 y HSO56) con los tres ensayos realizados en este estudio. T. rossicum (T1) demostró efecto inhibitorio en las pruebas de cultivos duales y metabolitos secundarios no volátiles contra R. solani (HSO56). Si se toma como base esta investigación, se sugiere realizar pruebas en invernadero y campo con T. asperellum (T18 y T16) y T. rossicum (T1) contra R. solani.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) y a la empresa GreenCorp por el apoyo brindado para el desarrollo de esta investigación.

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Notas de autor

fdanielhc@hotmail.com