Los animales fueron anestesiados con ketamina (80 mg/kg, Pisa®) y xilazina (15 mg/kg, Pisa®) por vía intraperitoneal. Se implantó por una cánula guía unilateral en la SGP-D (AP: –7.3 mm, ML: 0.5 mm y DV: 4.0 mm) de acuerdo con el Atlas del cerebro de la Rata (Paxinos & Watson, 2014) utilizando un aparato estereotáxico (mod: 502,650, World Precision Instruments® Sarasota,FL) (figura 1). La cánula guía se sujetó al cráneo con dos tornillos de acero inoxidable quirúrgico y acrílico dental. Se permitió la recuperación postquirúrgica de los animales por un periodo mínimo de 10 días antes de cualquier manipulación experimental.

Tanto NPY (humano) como (R)-N-(diphenylacetyl)-N-[(4-hydroxy-phenyl)methyl]-D-arginina amida (BIBP-3226) fueron obtenidos de la empresa Sigma-Aldrich® y disueltos en solución salina fisiológica. Las dosis empleadas (ie. 2.34 nmol NPY y 0.5 nmol BIBP-3226) se seleccionaron a priori con base en resultados previos de nuestro grupo (Vázquez-León et al., 2020)y se administraron como tratamientos agudos en administraciones únicas.

Luego del periodo de recuperación postquirúrgico (ver sección anterior)se administró el respectivo tratamiento farmacológico en la región SGP-D a través de un inyector conectado a una cánula (calibre 31 × 10 mm), que se extendía 1 mm más allá de la punta de la cánula guía. La cánula de inyección se conectó a una jeringa de 1 μL (Hamilton Co., Reno, NV, EE. UU.) con un tubo de polietileno 20 lleno de solución salina isotónica estéril (SSI). Las microinyecciones a través de la cánula se realizaron durante un período de 60 segundos y luego la cánula de inyección se dejó sin tocar durante 60 segundos para evitar el reflujo del fármaco. Mientras tanto, cualquier movimiento de lucha de la rata se restringió suavementemediante inmovilización (figura 2).

Las ratas recibieron alimento estándar para roedores de laboratorio durante todo el estudio (Propecua™, México) en un recipiente de acero inoxidable ubicado en la parte delantera, con los cuatro tubos dispensadores de dieta líquida. Para la medición de la ingesta de alimento se colocaron 50 g de alimento en cada contenedor y se pesó el sobrante 24 horas después para determinar la cantidad diaria (g/día) ingerida. Se recuperó cualquier sobra macroscópica de alimento dentro de las jaulas para considerarla en la medición evitando sobreestimaciones.

Se midió la ingesta voluntaria de sacarosa y alcohol en todas las ratas. Con este propósito se instalaron en las jaulas individuales cuatro tubos de vidrio estándar (70 ml, 25 × 200 mm) equipados con una boquilla de vidrio y un orificio terminal (diámetro= 1 mm) para permitir la ingesta de líquidos. Cada tubo se llenó con diferentes soluciones: agua, sacarosa 10%,así como alcohol etílico 5% y 10%. Las concentraciones de etanol se eligieron con base en reportes previos (Mendoza-Ruiz, Vázquez-León, Martínez-Mota, Ramírez, & Miranda-Páez, 2018)y Vázquez-León y colaboradores (Vázquez-León, Miranda-Páez, Calvillo-Robledo, & Marichal-Cancino, 2021a; Vázquez-León et al., 2020). Cada tubo de vidrio se pesó antes y después de 24 horas para cuantificar la cantidad de sacarosa o alcohol consumido. La ingesta de sacarosa se expresó en g/día. La ingesta de alcohol se calculó en gramos de alcohol absoluto por kg de peso corporal (g/kg)/día.

Figura 1.
Diseño experimental.
Elaboración propia con BioRender con licencia

Una vez concluidos los experimentos conductuales se procedió a la eutanasia de los animales mediante una sobredosis con anestésico (pentobarbital sódico, 60 mg/kg ip). Se sometieron a perfusión intracardiaca con solución salina isotónica seguida de formaldehído a 4%. Posteriormente se procedió a disecar el cerebro desde bulbos olfatorios hasta bulbo raquídeo, conservándolos en una solución de formaldehído a 10% por al menos una semana. Se montaron las piezas anatómicas en un vibratomo para realizar los cortes histológicos (100 μm de espesor) en un baño de solución de sacarosa 6%, tinción correspondiente de los cortes con violeta de cresilo y verificación de los sitios de implantación de la cánula a nivel de la SGP-D. Por último, se realizó una revisión de los cortes con microscopio estereoscópico. Solamente se incluyeron en los resultados los datos de los animales con las cánulas correctamente instaladasen el sitio objetivo (figura 1).

Figura 2.
Fotografía ilustrativa del proceso de microinyeccióni.c.v. en la rata.
Fotografía del laboratorio de Neurofarmacología y Terapéutica Experimental.

Los datos fueron analizados usando el programa Sigma Plot 12.0 (Systat Software Inc. San Jose California, EE. UU.). Los datos se analizaron mediante análisis de varianza de dos vías para cada una de las variables, seguido por la prueba de Bonferronien caso de encontrarse diferencia significativa. Para todas las variables medidas la significancia estadística fue p< 0.05.

En la figura 3se muestra el efecto de los tratamientos sobre la ingesta de alimento. Tanto en hembras como en machos el NPY aumentó la ingesta de alimento (p< 0.05) en comparación con el vehículo; mientras que los animales tratados con BIBP-3226 mostraron un menor consumo de alimento comparado con vehículo o NPY. Adicionalmente, cuando comparamos los efectos por sexo no encontramos diferencias (p> 0.05).

Figura 3.
Efecto agudo de los tratamientos intra-SGP-D sobre la ingesta de alimento en ratas hembra y macho. Los datos están expresados como la media ± error estándar de la media (SEM) y se analizaron mediante ANOVA de dos vías (n=9).*, p< 0.05 vs. vehículo (DMSO 10%); B, p< 0.05 vs. BIBP-3226 (0.5 nmol).
Elaboración propia

En la figura 4 se muestra el efecto de los tratamientos sobre la ingesta de sacarosa a 10%. Tanto en machos como en hembras los grupos que recibieron NPY (intra-SGP-D) consumieron mayor cantidad de sacarosa en comparación con el vehículo y con BIBP-3226 (p< 0.05).A su vez, los animales tratados con BIBP-3226 consumieron menor cantidad de sacarosa en comparación con el vehículo (p< 0.05). No existió interacción entre tratamientos y sexo biológico (p> 0.05).

Figura 4.
Efecto agudo de los tratamientos intra-SGP-D sobre la ingesta de sacarosa a 10% en ratas hembra y macho. Los datos se expresan como la media ± error estándar de la media (SEM) y se analizaron mediante ANOVA de dos vías (n=9). *, p< 0.05 vs. vehículo (DMSO 10%); B, p< 0.05 vs. BIBP-3226(0.5 nmol).
Elaboración propia.

En la figura 5 se muestra el efecto de los tratamientos sobre el consumo total de alcohol. Los animales que recibieron BIBP-3226 (0.05 nmol) intra-SGP-D consumieron una mayor cantidad de alcohol con respecto al vehículo y a los que recibieron NPY (p<0.05), sin interacción entre tratamientos y sexo biológico (p> 0.05).

Figura 5.
Efecto de los tratamientos intra-SGP-D sobre la ingesta total de alcohol en ratas hembra y macho. Los datos se expresan como la media ± error estándar de la media (SEM) y se analizaron mediante ANOVA de dos vías (n=9). *, p< 0.05 vs. vehículo (DMSO 10%); N, p< 0.05 vs. NPY (2.34 nmol).
Elaboración propia

La ingesta de alimento involucra fenómenos hedónicos (i.e.se consume por placer) y homeostáticos (i.e. se consume por necesidad energética) (Rossi & Stuber, 2018). En este trabajo la ingesta de alimento no puede diferenciar el rasgo hedónico del homeostático. Sin embargo, al ser un alimento estándar (y el único conocido por los roedores a lo largo de sus vidas en laboratorio) es probable que su consumo obedezca predominantemente un rasgo homeostático. Por otro lado, los azúcares en general poseen la capacidad de activar los sistemas de recompensa del cerebro (Rada, Avena, & Hoebel, 2005), por tanto, su consumo denota un rasgo predominantemente hedónico. Este trabajo empleó el consumo de alimento como indicador de consumo predominantemente homeostático y la ingesta de sacarosa como uno hedónico (figuras 3 y 4).

Las áreas cerebrales que median la ingesta de alimentos incluyen estructuras como lo son la corteza prefrontal, hipotálamo, amígdala, área tegmental ventral y núcleo paraventricular; pero recientemente se ha reportado una función clave de las neuronas en la SGP, participando la ejecución de la conducta de ingesta de alimentos (Tryon & Mizumori, 2018). Nuestro grupo ha propuesto a la SGP como una región clave en los mecanismos que subyacen en la adicción a sustancias generadoras de síndrome de abstinencia (e.g. nicotina, cocaína, alcohol, cannabinoides, opioides, etc.), como puede encontrarse en Vázquez-Leónet al.(2021b); mientras que otros grupos de investigación internacional han postulado que la SGP-D puede estar involucrada en todas las conductas motivadas por estímulos, tanto apetitivos como aversivos (Silva & McNaughton, 2019). En nuestros resultados mostramos que el NPY genera un aumento tanto en el consumo de alimento como en la ingesta de sacarosa; mientras que el bloqueo de NPY-Y1 se asocia con inhibición del consumo de alimento (figura 3), pero una inhibición muy elevada de la ingesta de sacarosa (figura 4). Por tanto, podemos proponer que el control de NPY-Y1 de la SGP-Des más importante y significativo sobre las conductas hedónicas que sobre las homeostáticas. Tal aseveración va en el mismo sentido de lo reportado previamente (Silva & McNaughton, 2019; Tryon & Mizumori, 2018; Vázquez-Leónet al., 2021b; Vázquez-León et al., 2020).

Otros estudios han reportado que la administración de NPY en el ventrículo lateral de ratas seleccionadas por su alto consumo alcohólico genera una disminución en la ingesta de alcohol (Badia-Elder, Stewart, Powrozek, Murphy, & Li, 2003). Es importante destacar que la administración de compuestos en el ventrículo lateral puede alcanzar fácilmente áreas como la SGP-D, debido a la ágil difusión de substancias desde el sistema ventricular y la proximidad del acueducto mesencefálico con la SGP (Paxinos & Watson, 2014). Nuestros datos sugieren que el NPY per seno disminuye la ingesta alcohólica en animales normales (i.e. con un bajo-normal consumo alcohólico; figura 5). Sin embargo, el bloqueo del receptor NPY-Y1 en la SGP-D con BIBP-3226(0.5 nmol) generó un aumento significativo en la ingesta de alcohol cuando se evaluaron sus efectos sin distinción de sexos biológicos (figura 5). Lo anterior sugiere que dicho receptor regula de manera negativa la conducta de ingesta alcohólica. Esta observación ya había sido reportada previamente por nuestro grupo de estudio en un modelo de alcoholismo forzado (Vázquez-León et al., 2020), por lo que podemos destacar que se trata de un efecto altamente reproducible.

Admitimos que entender la función de las hormonas femeninas en las conductas de ingesta homeostática y hedónica de sustancias necesitaría de la implementación de un estudio con diseño experimental distinto al empleado en este trabajo. No obstante, ese conocimiento cae fuera de los objetivos y/o alcances de la presente investigación. El hecho de que no existieron diferencias significativas (p> 0.05)entre hembras y machos en los efectos producidos por el NPY y el BIBP-3226sugiere que se trata de un importante sistema de control delos rasgos apetitosos de la conducta de ingesta de sustanciasen roedores y probablemente en el resto de mamíferos (Yi et al., 2018). Para apoyar esta propuesta modelos de inducción del apetito se relacionan con aumentos en el receptor NPY-Y1 en sistema nervioso central (Xu, Kalra, Moldawer, & Kalra, 1998) y el receptor NPY-Y1 está involucrado en los mecanismos que regulan el consumo de sustancias de abusos como la metanfetamina y diversos rasgos hedónicos de la alimentación en ratas (Hsieh, Chen, Yu, Liao, & Kuo, 2013).

La actividad de los receptores NPY-Y1en la SGP-D, de manera equiparable en ambos sexos biológicos, modula: (i) positivamente y de manera moderada la conducta de ingesta de alimentos(conducta predominantemente homeostática); (ii) positivamente y de manera marcada la ingestadesacarosa; y (iii) negativamente el consumo alcohólico.

bruno.marichal@edu.uaa.mx