La hidroxiapatita es una apatita de fosfato cálcico similar al mineral del tejido óseo (Barry et al., 2013). Está formada por átomos de calcio, fósforo (P) e hidrógeno (H); de acuerdo con la fórmula Ca₁₀(PO₄)₆(HO)₂ con una relación calcio/fósforo de 1.6. Constituyen al hueso humano y están compuestos por una matriz con células dispersas, consistente en 69% de hidroxiapatita, 9% de agua y 22% de materia orgánica que en su mayoría corresponde a colágeno. Se depositan por cristalización en la trama formada por las fibras de colágeno, durante el proceso de calcificación o mineralización, y la estructura entre la Hap y los sustratos orgánicos determinan las propiedades elásticas y mecánicas de los tejidos (Wang & Yeung, 2017).

Figura 1.
Estructura cristalina hidroxiapatita hexagonal.
Imagen tomada de Esteban-Gómez et al. (2017).

Se conocen dos estructuras cristalinas para Hap sintética: la fase hexagonal (grupo espacial p6₃/m) con parámetros de celda a= 9.4302 Å, c= 6.8911Å, γ= 120° y la estructura monoclínica (grupo espacial P2₁/b) con parámetros de celda a= 9.8421 Å, b= 2a, c= 6.8814 Å y γ= 120°; como se observa en la figura 1, la cual representa la fase hexagonal simulada con datos reales de sHap sintetizada por el método hidrotermal. En general, ambas estructuras se describen por la interacción de aniones tetraédricos (PO₄^_3) que están ordenados a lo largo del eje con cationes de Ca²⁺ en los sitios intersticiales y la diferencia entre ambas es la orientación del ion OH (Das & Pamu, 2019; Ferraz, Monteiro, & Manuel, 2004; Fihri, Len, Varma, & Solhy, 2017; Pai et al., 2020; Tõnsuaadu, Gross, Pluduma, & Veiderma, 2012).

Métodos de síntesis de hidroxiapatita. Durante la última década se han desarrollado diversas rutas sintéticas para la producción de nanopartículas de sHap con el fin de garantizar su viabilidad y eficiencia en aplicaciones específicas; a estos métodos se les conoce como rutas de síntesis química, como se indica en la figura 2.

Figura 2.
Clasificación de métodos para la obtención de hidroxiapatita.
Imagen tomada de Sadat-Shojai et al. (2013).

Por mencionar algunos ejemplos de síntesis, los métodos secos en general no utilizan un disolvente, las características del polvo obtenido no están influenciadas por parámetros de funcionamiento; por tanto, no se requieren condiciones muy controladas sobre la precisión, haciéndolos más adecuados para la producción en masa de Hap. Este tipo de método es relativamente simple; se calcinan a elevadas temperaturas los precursores de calcio y fosfato (por ejemplo 1000 °C), ocasionando con esto una estructura bien cristalizada (Ferraz et al., 2004).

Por otra parte, el método húmedo consiste en la separación de un componente en una mezcla de compuestos, ya sea por reactividad o bien por distinta solubilidad en un determinado disolvente. Posteriormente se utiliza la decantación o la filtración para el aislamiento, y se aplican técnicas de purificación, cromatografía por columna, hasta obtener el compuesto puro (Paz, González, López, Becquer, & Parodi, 2010; Uskoković & Uskoković, 2011).

Se emplean diferentes precursores como fuentes de calcio y fósforo, tales como óxido de calcio, beta fosfato tricálcico, nitrato de calcio (Othman, Mustafa, Loon, & Noor, 2016; Sadat-Shojai, Khorasani, & Jamshidi, 2015); nitrato de calcio tetrahidratado (Sadat-Shojai, Atai, & Nodehi, 2011); fosfato de calcio dibásico, óxido fosfórico (Salimi, Bridson, Grover, & Leeke, 2012); entre otros; asimismo, se trabaja con diferentes condiciones de síntesis; tales como tiempo y temperatura de reacción, concentración de precursores, variación del pH, por mencionar algunos parámetros (Jin, Zhuang, Zhang, Guo, & Tan, 2015; Mori & Aizawa, 2017).

Aplicaciones. La sHap tiene una gran cantidad de aplicaciones, tales como la separación y la purificación de proteínas e implantes de hueso. Sin embargo, para cada aplicación se deben modificar las características físicas y químicas tales como forma de partícula, tamaño del poro, dureza, pureza y cristalinidad del material (Zhong et al., 2017). Ha sido ampliamente usada como sustituto de hueso debido a su biocompatibilidad, ya que sus componentes minerales son similares a los huesos y dientes del cuerpo humano (Zhu, Xu, Liu, Zhang, & Wu, 2018). Existen productos en venta principalmente por Internet, como describe la tabla 1. Productos como pastas para dientes, suplementos alimenticios o cosméticos inyectables que hacen mención de hidroxiapatita como su activo principal y aporta beneficios para combatir la sensibilidad en los dientes y mantener huesos saludables. También como material de relleno y apoyo en la migración celular con creación de nuevo sistema óseo.

Tabla 1
Productos de venta por internet con activo principal de Hap

Nota: Elaboración propia.

Actualmente la Hap se vende a nivel internacional, principalmente como reactivo químico para realizar síntesis de materiales, como fertilizante y uso cosmetológico; sin embargo, como se observa en la tabla 2 se hace una comparación entre ellas; destacan las que publicitan como hidroxiapatita; pero en su composición química, especificaciones y no poseer estudios de toxicología, pone en duda si realmente es el material mencionado. Por otra parte, se hace mención de otras, que por cuyas especificaciones y fichas de seguridad se comprueba la veracidad del producto y sugieren su uso como precursor de síntesis o empleo en el área biomédica. El continente asiático corresponde a la industria que más la distribuye, seguido de América del Norte y a nivel nacional no se reporta la producción o síntesis de este material a gran escala.

Tabla 2
Comparativo y costos de hidroxiapatita

Nota: Elaboración propia

El Se es un elemento ampliamente distribuido en todo el mundo. Comúnmente se encuentra en rocas y el suelo, combinado con sulfuros o minerales de plata (Ag), cobre (Cu), plomo (Pb) o níquel (Ni). Tiene una apariencia desde gris metálica hasta cristales negros y se conoce como selenio elemental o polvo de selenio. También es producido de forma comercial, principalmente como producto secundario en la refinación del cobre. Se usa en artículos fotográficos, líquidos para limpiar partes metálicas de armas de fuego, plásticos, pinturas, shampoo para caspa, vitaminas y suplementos nutricionales, fungicidas y preparación de medicamentos.

El Se es un microelemento esencial que determina el buen funcionamiento del cuerpo humano, posee efectos antioxidantes y protege al organismo contra la acción de radicales libres y factores cancerígenos (forma redox) (Wei, Pang, He, & Deng, 2017). Algunas investigaciones han demostrado que el suministro adecuado de Se mejora la resistencia a las fracturas y retrasa el envejecimiento óseo; disminuye las enfermedades cardiovasculares, tipos de cáncer, tiroideas, cerebrales, óseas e infecciones virales; sin embargo, la deficiencia de este elemento incrementa el desarrollo de ataques epilépticos y de enfermedades de Parkinson. Provoca problemas de coordinación sobre la fertilidad masculina; ya que participa en la biosíntesis de la testosterona; así como en la formación y desarrollo de los espermatozoides, retraso del crecimiento y afectación en el metabolismo del tejido óseo (Wei et al., 2017).

El Se afecta diversos procesos celulares y vías moleculares que pueden estar involucradas en su efecto anticancerígeno e incluyen (Zeng, Cao, & Combs, 2013):

-Selenoenzimas que implican la reducción del daño en el ADN, el estrés oxidativo y la inflamación.

-Inducción de enzimas de conjugación de fase II que implica la desintoxicación de carcinógenos y la reducción de la formación de aductos de ADN.

-Mejora de la respuesta inmunitaria, incluidos los linfocitos citotóxicos y la actividad de las células asesinas naturales.

Figura 3.
Algunas de las selenoproteínas con una función identificada.
Elaboración propia.

Por ejemplo, se conocen 25 genes que codifican las selenoproteínas identificadas en los humanos (Mariotti et al., 2012). Como se menciona en la figura 3, una de ellas es el glutatión peroxidasa, se compone de cinco enzimas GPx1-4 y GPx6. Las isoenzimas GPx son catalizadores antioxidantes que reducen a las especies reactivas de oxígeno potencialmente dañinas, como el peróxido de hidrógeno y los hidroperóxidos lipídicos en productos inocuos como el agua y los alcoholes.

La enzima GPx4 se encarga de la espermatogénesis y la fertilidad masculina y depende de la selenoproteína P (SEPP1) para reducir los hidroperóxidos y fosfolípidos, protegiendo a los espermatozoides inmaduros contra el estrés oxidativo y la incorporación de la espiral mitocondrial del espermatozoide maduro (motricidad)(Boitani & Puglisi, 2008). La SEPPI se produce principalmente en el hígado, sitio principal de almacenamiento para el Se y constituye la principal forma de transporte de Se a los tejidos periféricos (Hill et al., 2012). Existen modelos con animales carentes de este gen que se vuelven infértiles debido a la biodisponibilidad pobre de Se en los tejidos, a la síntesis defectuosa de GPx4 y a la maduración deteriorada del esperma. Lo anterior es un ejemplo de cómo el cuerpo necesita y procesa dicho elemento, dándole importancia su uso y consumo (Mangiapane, Pessione, & Pessione, 2014; Mariotti et al., 2012).

La ingesta diaria recomendada por el Instituto de Medicina de EE. UU. y la Federación Europea de Asociaciones de Dietistas (EFAD) es de 50 a 60 mg para adolescentes y adultos. Puede obtenerse de alimentos con mayor presencia de Se; tales como cereales integrales, pescados y mariscos, algunos tipos de verdura (cebolla, espárragos), semillas como las de girasol, frutos secos como la nuez de Brasil o también tomando suplementos alimenticios. El selenito y el selenito de sodio son formas inorgánicas del Se que pueden ser metabolizadas por el cuerpo y ser incorporadas en las selenoenzimas (Higdon, Drake, Delage, & Tsuji, 2017).

Como se mencionó anteriormente la estructura química de la sHap ofrece la posibilidad para el intercambio iónico en sus sitios aniónicos (PO₄, OH) y catiónicos (Ca). Esta característica hace fácil la incorporación de iones (Fe²⁺, Gd³⁺, Se²⁺, etc.), la creación de defectos estructurales durante su proceso de síntesis; tiene como objetivo cambiar/modificar las propiedades fisicoquímicas; tales como brecha de banda, carga superficial, área superficial; así como la liberación /captación de iones y, por tanto, mejorar su comportamiento biológico (c. ej. mejorar la osteogénesis).

Incorporación estructural de Hap/Se. La Hap dopada con iones Se, principalmente, se obtiene a través de la síntesis; durante la cual los iones se incorporan a la estructura, como lo menciona Varun Prasath Padmanabhan et al. (2020) usaron los métodos de precipitación química y por sonicación, sintetizaron compuestos de Hap sustituidos por Se. Los análisis espectroscópicos FTIR y Raman confirmaron el dopaje exitoso de Se en la matriz de Hap y con el análisis de DRX indicaron su alta cristalinidad; el análisis morfológico indicó que por el método sonoquímico se produjeron partículas en forma de bastoncillos; mientras que por el de precipitación se presentaron partículas con estructuras aglomeradas (Padmanabhan et al., 2020). En la tabla 3 se resumen algunos trabajos recientes sobre la síntesis de Hap/Se y las pruebas biológicas realizadas en este material.

Tabla 3
Comparativa de trabajos realizados para la síntesis de Hap y tipo de evaluación célula

Nota: Elaboración propia.

En el trabajo realizado por Alkan y Durucan (2022) se sintetizaron partículas de Hap incorporando Se mediante el método de precipitación acuosa usando sales de calcio y fosfato, obteniendo partículas aglomeradas. Observaron en micrografías obtenidas por TEM cristales en forma de aguja que se pronuncian al incrementar la cantidad de dopante, lo que sugiere un crecimiento preferencial en relación con la incorporación del Se. La estructura química de los polvos de Hap pura y dopados se investigó mediante FTIR, indicando la obtención de las bandas correspondientes a fosfatos y grupo hidroxilo características de la fase de Hap y otros modos vibracionales se atribuyen al Se.

Los investigadores Li et al. (2019) sintetizaron nanovarillas de Hap dopadas con Se altamente cristalinas con el método térmico en alcohol. Primero se formó una apatita amorfa de 30 nm, después de una reacción térmica en alcohol aparecieron nanovarillas que posteriormente se transformaron en nanovarillas monocristalinas a través de la cristalización. Los resultados por DRX corresponden a hidroxiapatita, esto significa que no hay otras impurezas. El dopaje de Se, en forma de SeO32− no tiene influencia significativa sobre la fase principal de los cristales de hidroxiapatita. Los resultados por FTIR las bandas características de la Hap y los correspondientes la selenita. Por la técnica de TEM se observaron morfología de nanovarillas de 2µm de longitud y determinan que al incrementar el porcentaje de Se se tiene una relación con el ancho de las partículas; es decir, entre mayor es el dopante de Se más ancha se vuelve la nanovarilla (Li et al., 2019).

Zakhireh, Adibkia, Beygi-Khosrowshahi y Barzegar-Jalali (2021) introdujeron iones de Se en la estructura de HA utilizando el método de aleación mecanoquímica (MCA). Extrajeron HA de la espina de pescado, posteriormente la doparon con Se (Se-Hap). Se analizaron los polvos utilizando espectros de difracción de rayos X mostrando un cambio nulo en la estructura cristalográfica por el dopaje de Se. Calcularon el tamaño de cristal, obtuvieron tamaños de 87 y 78 nm para polvos HA y Se-HA, respectivamente. El cambio en las constantes de red de Hap se debió a la sustitución de átomos de fósforo por Se, así como a la formación de tensiones en la matriz. Con el aumento de la tensión, aumentan los defectos de los cristales en la matriz, lo que conduce a una disminución del tamaño de los cristalitos y de la intensidad de los picos, microscopio electrónico de barrido (MEB), determinaron morfología de esferas con tamaños aproximados de 200 nm, sin presentar algún defecto a consecuencia del dopaje con Se. Por espectroscopia infrarroja transformada de Fourier determinaron las bandas características a A y al Se (Zakhireh et al., 2021).

Evaluación biológica Hap/Se. Barbanente et al. (2021) realizaron prueba HEPES, ajustando a dos pH (7.4, 6.5), en diferentes tiempos (1, 24, 48 y 72 horas y 7, 14 y 30 días). Recolectando alícuotas de 10 ml de sobrenadante para determinar las concentraciones de Se, P y Ca. Sin importar el pH, los tres primeros días las muestras liberaron Se más rápido y posteriormente una etapa de liberación lenta y constante (3-30 días). Sugieren que en la primera etapa se liberaron iones de selenita de la capa superficial hidratada de los nanocristales seguida de la disolución gradual de las NPHap, liberando iones de SeO32-, influenciadas primeramente por el pH de la solución (6.5). Los resultados de viabilidad celular (ensayo CCK-8 después de 24 h y 72 h de tiempo de exposición) mencionan que el tratamiento con selenito de sodio 10 μM (después de 24 h) redujo la viabilidad de las células MDA-MB-231eGFP de manera más efectiva que las células PC3 (células cáncer de próstata), mientras que el selenita redujo la viabilidad de hBMSc (células sanas) a una concentración de 5 μM. Curiosamente, después de 72 h, el selenito de sodio muestra un efecto sustancial en las células PC3 a 5 μM. Por tanto, podría afirmarse que las células MDA son más sensibles al selenito de sodio, en comparación con PC3 después de 24h de tiempo de exposición, pero después de 72 h se observa una tendencia opuesta. Concluyen que las pruebas celulares in vitro mostraron que suspensiones de HASe NP con una baja concentración de Se presentan buena compatibilidad con las células, mientras que las HASe con una alta concentración de Se ejercen una fuerte actividad citotóxica sobre las células cancerosas; pero provocan un aumento en los niveles de toxicidad de hBMSc (Barbanente et al., 2021). En la evaluación de la actividad citotóxica utilizando células cancerosas de próstata, mama y células saludables de medula ósea encontraron que existe buena citocompatibilidad a bajas concentraciones de Se y ejerce buena citotoxicidad en el cáncer, pero también en las células sanas (Barbanente et al., 2021).

Zakhireh et al. (2021) observaron buen comportamiento de adhesión celular y forma de osteoblastos en el andamio Se-HA. Los resultados de la diferenciación osteogénica demostraron una actividad fosfatasa alcalina (ALP) sinérgicamente mejorada. Además, los resultados de la prueba de Western blot mostraron que la diferenciación de hAD-MSC hacia tejido óseo aumentó hasta en 50% mientras se dopaba con Se. En el análisis de ensayo de viabilidad celular (actividad metabólica por reducción del compuesto MTT) utilizaron la línea celular de osteosarcoma óseo humano (KHOS-240S) y como resultados de la prueba después de 3, 5 y 7 días de cultivo comprobaron que la presencia de Se en la estructura de Hap tuvo un efecto aditivo sobre la proliferación de células madre mesenquimales (MSC). Además, hubo un aumento de casi 30% en la expansión celular en las muestras de Se-HA después de siete días en comparación con las muestras de HA pura.

El Se ejerce un efecto proliferativo sinérgico en la Hap células a través de iones Ca²⁺ mejorados en el andamio Se-Hap. El dopante Se tiene un efecto citotóxico selectivo sobre las hAD-MSC y la línea celular de osteosarcoma óseo humano (KHOS-240S). Esta doble actividad hace que el andamio Se-Hap sea un candidato potencial para su uso en defectos de osteosarcoma, reveló la actividad antiproliferativa del andamio Se-Hap contra las células cancerosas óseas. La calcificación la evaluaron en tinción para determinar la cantidad de depósito de calcio en hAD-MSC. Presentaron imágenes microscópicas de las MSC después de colorear con ARS en los medios de cultivo celular que incluyen Hap, Se-Hap y muestras de control.

El ARS, como compuesto orgánico, hace que la matriz inorgánica de calcio cambie a rojo. Si la superficie está roja después de usar ARS significa que la superficie está llena de calcio. En cuanto a las imágenes, la intensidad del color rojo se elevó por el dopaje de Se en la Hap, lo que fue motivo de mayor existencia de calcio compuestos en la superficie. Los autores de esta investigación, basados en sus resultados, concluyen que la línea celular de osteosarcoma óseo (KHOS-240S) reveló la propiedad anticáncer óseo del dopante Se; lo que indica su utilidad potencial como andamio bifuncional para la terapia tumoral y la regeneración ósea simultáneas (Zakhireh et al., 2021).

Se prevé que en un futuro continúe la investigación y estudio de la interacción entre partículas de Hap-Se y el efecto que tiene sobre células cancerígenas. Sin embargo, debemos puntualizar su importancia sobre el efecto que presenta sobre el cáncer, tipos y mecanismos para que en un futuro se logre innovar con un material que tenga la capacidad suficiente de erradicar esta enfermedad sin modificar o influir en las células sanas.

daniela.salado@uaslp.mx