El nicho primario de M. tuberculosis son los macrófagos, aunque otros tipos de células pueden ser infectadas. Los macrófagos producen especies reactivas de oxígeno (ERO) y especies reactivas del nitrógeno (ERN) como mecanismo de defensa antibacteriano. La interacción de ERO y ERN con el ADN tiene consecuencias mutagénicas, porque una vez producida la conversión de óxido nítrico en anhídrido nitroso y/o peroxinitrito puede provocar la desaminación de bases de ADN como la guanina y la citosina (Burney, Caulfield, Niles, Wishnok, & Tannenbaum, 1999; Dartois 2014). Sin embargo, M. tuberculosis expresa genes de detoxificación (AhpC, KatG, el regulon DosR), produce micotiol (agente reductor de bajo peso molecular); algunos de los mecanismos que le permiten la desintoxicación de EOR y ERN y que le son esenciales para la supervivencia en el hospedero (Dartois, 2014; Newton, Buchmeier, & Fahey, 2008; Warner & Mizrahi, 2006).

Experimentos in vitro han determinado que la tasa de mutación (frecuencia en la que se producen nuevas mutaciones en un gen o secuencia del genoma de un organismo en cada generación) de M. tuberculosis no es elevada en comparación con otras bacterias (Cohen, Manson, Desjardins, Abeel, & Earl, 2019). Por esta razón se espera que las cepas de M. tuberculosis resistentes surjan como consecuencia de errores espontáneos en la replicación del ADN que posteriormente se seleccionan bajo la presión del antibiótico aplicado (McGrath et al., 2014). A pesar de esta baja tasa de mutación, el número de casos de TB resistente a los antibióticos, especialmente TB-MDR y TB-XDR, aumenta de manera constante en todo el mundo. En el último informe de la OMS se reportaron 450,000 casos de MDR-TB y 23,038 casos de XDR-TB (OMS, 2022).

La secuenciación del genoma completo de cepas de M. tuberculosis ha permitido la identificación de casos de reciente transmisión, reinfección, la generación de datos sobre la evolución de la farmacorresistencia en pacientes, diferenciación de la adquisición de resistencia de novo (mutaciones de resistencia dentro de un hospedero), así como de la transmisión de farmacorresistencia (Cohen et al., 2019). Esta tecnología fue usada para detectar polimorfismos de nucleótido únicos (PNU) de M. tuberculosis en muestras de esputo (figura 1) obtenidas en una serie de tres pacientes durante el tratamiento antituberculosis (Sun et al., 2012). Este estudio determinó el desarrollo entre 8 y 41 PNU durante el tratamiento en cada muestra, y hasta 34 PNU fueron exclusivos de una sola muestra.

La mayoría de los PNU se detectaron en frecuencias inferiores a 20% en cada muestra, lo que indica que la población bacilar de las muestras de esputo se caracterizó por una alta microheterogeneidad. En otro estudio se detectaron mutaciones en los genes rpsL y rrs de cepas aisladas en muestras obtenidas en serie de un paciente. El estudio también determinó la coexistencia transitoria de algunas mutaciones, así como sucesivos barridos clonales de otras mutaciones, lo que sugiere una interacción dinámica entre la variabilidad genética de las cepas de M. tuberculosis y las presiones selectivas asociadas del hospedero (Mariam, Werngren, Aronsson, Hoffner, & Andersson, 2011).

Figura 1.
Imagen proporcionada por el equipo de investigación.
Imagen proporcionada por el equipo de investigación.

Los niveles de diversidad genética asociados a genes de resistencia identificados en los estudios anteriormente descritos implican que M. tuberculosis podría tener una tasa de mutación elevada dentro del hospedero en comparación con la calculada in vitro (Mariam et al., 2011; Sun et al., 2012). Sin embargo, es importante recordar que la fijación de mutaciones espontáneas ocurre durante la replicación, lo que supone que la tasa de mutación depende de la tasa de replicación. Esto plantea la posibilidad de que la tasa de replicación puede ser mayor en el hospedero de lo que se pensaba anteriormente, lo que también implica un continuo crecimiento de las micobacterias en la fase latente de la infección (McGrath et al., 2014).

La infección por M. tuberculosis es inicialmente contenida dentro del hospedero en estructuras organizadas llamadas granulomas, que son el sello patológico de la TB. La estructura clásica del granuloma consiste en un núcleo necrótico llamado cáseum (del latín caseum debido a su apariencia de queso) rodeado principalmente de macrófagos, neutrófilos, células T y B, neutrófilos, fibroblastos, entre otras células (figura 2 inciso a). El núcleo necrótico es el resultado de la lisis bacteriana y de la acción de las células del hospedero. A medida que las lesiones pulmonares evolucionan los granulomas celulares se convierten en granulomas necrotizantes y se pueden observar varias capas de fibroblastos, que funcionan para contener la infección. La formación de los granulomas es dinámica y esta heterogeneidad podría considerarse amigo-enemigo; ya que funciona para contener al patógeno, pero también hace que la erradicación quimioterapéutica sea extremadamente difícil debido al secuestro de bacilos dentro de compartimientos de lesiones remotas y protegidas con poca penetración de los fármacos (Lenaerts, Barry, & Dartois, 2015); lo que puede observarse en la figura 2 inciso a.

Figura 2.
Granulomas y distribución de los fármacos antituberculosis. a) El granuloma es una estructura importante para la contención de la infección por M. tuberculosis. La estructura clásica del granuloma consiste en un núcleo necrótico, el cáseum, rodeado por macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, células T y B, fibroblastos y otras células. b) La composición y heterogeneidad de los granulomas influye en la penetración y localización de los fármacos antituberculosis. La isoniacida, la pirazinamida y la rifampicina penetran y se localizan en el cáseum necrótico; mientras que la amoxicilina suele concentrarse en el anillo del granuloma y la bedaquilina es concentrada en macrófagos espumosos.
Imagen adaptada de Cadena et al. (2017).

Estudios han demostrado que existe una considerable variabilidad en la penetración del fármaco en los granulomas, lo que genera una variación espacial en las concentraciones del fármaco dentro de la lesión infectada. Experimentalmente se ha demostrado que la isoniacida (Lavin & Tan, 2022), pirazinamida y la rifampicina (Prideaux et al., 2015; Santucci et al., 2022) pueden difundirse y acumularse en el cáseum necrótico; mientras que otros antibióticos no penetran esta estructura, como la moxifloxacina, que se concentra en el anillo del granuloma (Blanc et al., 2018) y la bedaquilina, que se acumula en macrófagos espumosos; denominados así por su alto contenido de colesterol y triglicéridos (Fearns, Greenwood, Rodgers, Jiang, & Gutierrez, 2020; Santucci et al., 2021); esto puede observarse en la figura 2 inciso b. Es probable que estos procesos generen variaciones espaciales y temporales en las concentraciones de los antibióticos, lo que facilita la evolución de la farmacorresistencia.

El régimen de dosificación actual para el tratamiento de la TB no genera concentraciones esterilizantes de ciertos fármacos antituberculosis en todos los pacientes, lo cual puede contribuir al fracaso del tratamiento, así como facilitar la evolución de la farmacorresistencia. Poco se sabe acerca de los factores que influyen en la distribución del fármaco desde el plasma a la variedad de tejidos, nódulos y cavidades que están habitadas por M. tuberculosis (Lenaerts et al., 2015). Por ejemplo, las concentraciones de isoniacida, rifampicina y pirazinamida en los granulomas celulares son más bajas que en el plasma, aunque la rifampicina parece acumularse en el tejido pulmonar no afectado (Ordonez et al., 2020).

La resistencia intrínseca de M. tuberculosis se ha atribuido tradicionalmente a su pared celular compleja, formada por ácidos micólicos y diversas familias de lípidos, que le proporciona baja permeabilidad para la mayoría de los antibióticos (Dulberger, Rubin, & Boutte, 2020; Vilchèze, 2020). Otro mecanismo de resistencia innata son las bombas de eflujo de drogas (proteínas transmembranales responsables de mover los compuestos fuera de las células) que también contribuye a la resistencia a los antibióticos bacterianos (Laws, Jin, & Rahman, 2022; Poulton & Rock, 2022). M. tuberculosis posee cinco superfamilias de estas bombas, lo cual indica que el bacilo puede mantener concentraciones subinhibitorias de diversos antibióticos y como consecuencia podrían ayudar en la generación de mutaciones en la bacteria (Laws et al., 2022).

Un mecanismo adicional es la modificación del antibiótico o de su blanco molecular debido a la acción de enzimas. Estas enzimas a menudo permiten la acetilación o la metilación del fármaco o de su objetivo molecular para evitar el reconocimiento y su interacción. M. tuberculosis y M. bovis contienen en su genoma el gen erm37 que codifica una metil-transferasa de ARNr que bloquea las interacciones entre los macrólidos y el ribosoma (Al-Saeedi, Mashael, & Al-Hajoj, 2017). Recientemente, se ha descrito que el producto del gene cinA promueve tolerancia a isoniacida, etionamida, delamanida y pretomanida (Kreutzfeldt et al., 2022).

Cuanto más grande es la población de M. tuberculosis más eventos de división celular experimenta y, por tanto, mayor probabilidad de que surja una mutación con resistencia a los antibióticos. Además, si una mutación que confiere resistencia evoluciona temprano durante la expansión de la población, la gran mayoría de la población será resistente a un medicamento determinado, incluso antes del inicio del tratamiento. Se desconoce el número de células de M. tuberculosis presentes en los pulmones de humanos durante la infección. Las mejores estimaciones de células viables de M. tuberculosis se han obtenido de los pulmones de un modelo animal, el macaco cangrejero (Macaca fasicularis), en el que se ha determinado aproximadamente entre 10⁵ y 5 × 10⁸ células de M. tuberculosis por pulmón (Gygli, Borrell, Trauner, & Gagneux, 2017).

M. tuberculosis puede formar subpoblaciones aisladas (heterogeneidad poblacional) dentro del hospedero; la cual está relacionada con el estado clínico de la enfermedad (latente, incipiente, subclínica o activa), sitio de lesión, diversidad genética y tasa metabólica del bacilo, entre otros factores. Esta heterogeneidad poblacional puede dar origen a la farmacorresistencia (Mitchison, 1980; Ordonez et al., 2020). Durante el tratamiento antituberculosis pueden existir subpoblaciones de bacilos que pueden tolerar fenotípicamente mayores concentraciones de drogas: son los denominados bacilos persistentes (Mariam et al., 2011). Las subpoblaciones de bacilos que se encuentran en un estado de crecimiento lento o sin crecimiento (la acción de los fármacos requiere que los bacilos se estén replicando) son persistentes a la muerte por la mayoría de los antibióticos contra la TB, un fenómeno conocido como tolerancia fenotípica (Castro, Borrell, & Gagneux, 2021).

Sin embargo, no son genéticamente resistentes (es decir, la resistencia a los antibióticos no será heredada a las células hijas). La resistencia requiere una diferenciación fenotípica en células persistentes y a menudo está vinculada a un estado de crecimiento lento o de latencia. Este proceso puede ser desencadenado por varios factores, como la escasez de recursos, percepción de cuórum (quorum sensing), las señales intracelulares y el tratamiento con antibióticos, que en conjunto define la tasa metabólica de M. tuberculosis. Por ejemplo, se ha demostrado que poblaciones de M. tuberculosis que no se replican son resistentes a la isoniacida; mientras que los bacilos en división son susceptibles a la misma (Müller, Borrell, Rose, & Gagneux, 2013). Aunque los mecanismos de persistencia se han estudiado ampliamente in vitro, cuantificar el alcance de este fenómeno en las lesiones y dilucidar su efecto in vivo es un desafío. Esta heterogeneidad poblacional también esta mediada in vivo. En un estudio se examinaron siete cepas aisladas de tres pacientes distintos (Sun et al., 2012).

El primer paciente estaba infectado con cepas de M. tuberculosis libres de resistencia a los medicamentos, pero después de 19 meses de tratamiento se detectaron cuatro mutaciones independientes: tres mutaciones en katG y una mutación en la región reguladora del gen inhA. Después de cinco meses la mayoría de las mutaciones se revirtieron y solo se detectó una mutación en el katG. El segundo paciente albergaba una cepa de M. tuberculosis con una mutación en rpoB (L533P), pero aún era sensible a rifampicina. Después de 18 meses la mutación L533P fue reemplazada por una segunda mutación en rpoB (H526Y), lo que condujo a la cepa inicial a desarrollar resistencia a rifampicina. El tercer paciente fue un caso de recaída de TB con dos mutaciones no fijadas de ethA (L35R y A341E) después de 11 meses de tratamiento que no mostraron cambios en el estado de resistencia a etambutol (Sun et al., 2012). Estos estudios indican que la selección in vivo de mutaciones puede ocurrir a través de la competencia entre diferentes poblaciones con distintas mutaciones resistentes a los medicamentos.

El tipo de mutación se ha correlacionado con los antecedentes genéticos de los linajes de M. tuberculosis. Actualmente se reconocen nueve linajes. Por ejemplo, la mutación katG S315T (tabla 1) prevalece en el linaje 2; por el contrario, la mutación inhA-15 está asociada principalmente con el linaje 1. La mutación S531L en el gen rpoB se observa principalmente en el linaje 2, mientras que la mutación rpoB D516V es más frecuente en el linaje 4 (familia LAM) (Nguyen et al., 2018). Estas diferencias podrían atribuirse a una alta tasa de mutaciones espontáneas acumuladas durante la replicación. Estudios epidemiológicos han determinado que las cepas del linaje 2 tienen mayor tasa de resistencia que varía entre 1.6 X 10^-5 a 5.4 X 10-3 en comparación con el linaje 1 (Al-Saeedi et al., 2017).

Las polimerasas de ADN pueden tener una fidelidad reducida durante la replicación y producir mutaciones en un gen y/o secuencia en el genoma de M. tuberculosis en cada división celular. La frecuencia de las mutaciones nuevas y la tasa de mutación, por tanto, dependen principalmente de la actividad de las polimerasas de ADN. La tasa de mutación asociada a la resistencia a los antibióticos se define como la frecuencia in vitro a la que surgen mutantes detectables en una población bacteriana en presencia de una concentración específica de un antibiótico (Warner, Rock, Fortune, & Mizrahi, 2017).

Las mutaciones en los genes que codifican las proteínas metabólicas del ADN pueden conducir a la aparición de cepas mutantes que tienen una ventaja selectiva a corto plazo, debido a su capacidad para producir un mayor número de mutaciones adaptativas (hipermutante). En algunos casos estos mutantes se mantienen debido a su asociación con otras mutaciones benéficas, pero sólo mientras esta particularidad contrarresta (o excede) el costo inherente al mayor riesgo de generar mutaciones perjudiciales. Por ejemplo, se ha planteado la hipótesis de que las cepas Beijing podrían exhibir hipermutación porque esta familia de cepas alberga varias sustituciones no sinónimas en diversos genes.

Experimentos in vitro determinaron que las cepas Beijing se asociaron con frecuencias de mutación significativamente más altas en comparación con las cepas aisladas de las Indias del Este de África (EAI) cuando se cultivaron en presencia de rifampicina. Sin embargo, la posible asociación de las cepas Beijing con la resistencia adquirida a los antibióticos podría atribuirse a otros factores distintos de la tasa de mutación. También podría depender de factores específicos in vivo, dentro del hospedero (aumento del estrés oxidativo y/o la exposición a fármacos antituberculosis) y de la bacteria (cinco familias de proteínas que actúan como bombas de eflujo, una mayor tasa de replicación o una mayor capacidad de adaptación), que en conjunto podrían inducir una tasa de mutación elevada (Laws et al., 2022; McGrath et al., 2014).

Por otro lado, algunas mutaciones son transitorias (fenotipo mutante transitorio), lo que podría aumentar su tasa de mutación con el tiempo. En este sentido, debe señalarse que la evolución de la resistencia a los medicamentos dentro de un hospedero no siempre es lineal y, en cambio, puede implicar una interacción compleja de poblaciones heterogéneas de M. tuberculosis. En particular, la diversidad genética transitoria puede existir antes de que emerja un clon dominante. Por ejemplo, en un estudio en el que siguió a un paciente con TB-XDR durante 3.5 años y realizó la secuenciación del genoma de nueve cepas distintas de M. tuberculosis aisladas del mismo paciente. Los autores observaron un alto nivel de heterogeneidad en las poblaciones aisladas: se identificaron 35 mutaciones, incluidas 20 mutaciones transitorias y 15 fijas.

Finalmente, el estudio determinó que 12 mutaciones estaban relacionadas con la resistencia a los medicamentos, aunque sólo siete de estas mutaciones alcanzaron la etapa de fijación (Eldholm et al., 2014). Estas observaciones sugieren que la competencia entre mutantes puede ser una característica común en poblaciones de M. tuberculosis que adquieren farmacorresistencia in vivo. Aunque múltiples mutantes transitorios coexisten en el mismo espacio y tiempo, en última instancia, sólo se seleccionará un tipo de mutante.

La epistasis describe el fenómeno en el que la interacción de dos o más genes/alelos produce un efecto sobre el fenotipo; es decir, cuando la expresión de uno o más genes dependen de la expresión de otro gen (Jones, Adams, Eldesouky, & Sherman, 2022). El tratamiento estándar contra la TB es una combinación de cuatro antibióticos, por tanto, podría existir una gran presión selectiva de cepas de M. tuberculosis que podrían adquirir resistencia a varios fármacos utilizados durante este tratamiento (Castro et al., 2021). El efecto de múltiples mutaciones de resistencia a los medicamentos en el fenotipo de M. tuberculosis depende de las interacciones epistáticas de las diferentes mutaciones de resistencia entre sí y de la diversidad genética de la cepa. Este mecanismo puede generar la combinación de un conjunto de alelos en diferentes loci, también llamado desequilibrio del ligamiento (propiedad de algunos genes de las poblaciones de no segregar de forma independiente). La propagación de estos conjuntos de alelos coadaptados en la población se ve favorecida por el modo reproductivo clonal de M. tuberculosis (Gygli et al., 2017).

Los antibióticos contra M. tuberculosis tienen sus blancos moleculares sobre procesos celulares importantes, que van desde de la transferencia de información del ADN al ARNm a las proteínas, al inhibir las enzimas clave involucradas en estos procesos. Las mutaciones en enzimas individuales o en combinación tienen efectos pleiotrópicos sobre la aptitud de M. tuberculosis. Por ejemplo, las micobacterias que llevan una mutación en la subunidad β de ARN polimerasa dirigida por ADN (RpoB), que causa resistencia a la rifampicina, y una mutación que confiere resistencia a la fluoroquinolona en la subunidad A de la girasa A (GyrA) de ADN, pueden tener una mayor aptitud competitiva que las cepas que sólo tienen una de estas mutaciones (Gagneux, 2018). Las infecciones con cepas de TB-MDR se tratan con regímenes farmacológicos que contienen fluoroquinolonas. Las mutaciones de resistencia a fluoroquinolona evolucionarán principalmente en cepas de M. tuberculosis resistentes a rifampicina. La epistasis, por tanto, puede conducir a la competencia con otras cepas, transmisión, nivel y amplificación de resistencia, con resultados clínicos diversos (Gygli et al., 2017).

anaximandro.gomez@cinvestav.mx