Polimorfismos de los genes calpaína y calpastatina en dos poblaciones de ovinos de pelo colombiano

Polymorphisms of the calpain and calpastatin genes in two populations of colombian creole sheep

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La mayoría de los sistemas de producción ovina en Colombia, tienen como base genética la raza ovina criolla de pelo colombiana (OPC). El OPC presenta características adaptativas importantes al clima tropical, tales como la tolerancia al calor, ectoparásitos y la capacidad de consumir pasturas de escaso valor nutricional (1). Sin embargo, se ha considerado a estos sistemas como una actividad secundaria de la ganadería que se realiza en sistemas tradicionales y/o familiares, con bajos requerimientos de insumos y en sistemas mixtos de producción con otras especies (2,3), lo que conlleva a que problemas en nutrición, reproducción, sanidad, progreso genético, bienestar animal y manejo empresarial; entre otros, sean comunes y se reflejen en una baja eficiencia productiva (1,4).

Los programas de mejoramiento genético en el OPC son escasos, se basan, en cruzamientos absorbentes con razas importadas para aprovechar el vigor híbrido (5). Sin embargo, para aumentar la competitividad del sector, se requiere de la incorporación de nuevas tecnologías o prácticas de manejo que generen ventajas competitivas mediante sistemas de gestión de conocimiento que se adapten a las condiciones de la producción primaria de un país en desarrollo como Colombia (2,4,6). Es así como las herramientas moleculares son utilizadas en los programas de mejora genética de animales a través de la selección asistida por marcadores moleculares. Esta práctica mejora la exactitud y aumenta el progreso genético a través de la identificación, mapeo y análisis del polimorfismo de los genes implicados en las principales vías metabólicas relacionadas con el crecimiento animal, la distribución de los nutrientes en los diferentes tejidos y calidad de productos (7). La calpaína (CAPN) y la calpastatina (CAST) pueden ser considerados como genes candidatos con potencial de ser usados en programas de selección, pues polimorfismos de nucleótido simple (SNPs) se han asociado con mejora en la calidad de la carne (8).

El gen CAPN está asociado con la degradación de las proteínas miofibrilares post-morten, ocasionando el ablandamiento de la carne; se encuentra ubicado en el cromosoma siete y tiene 25 exones. El SPN g.24962426T>C ubicado en el exón diez ha sido el más estudiado (9). Por otra parte, el gen CAST es el principal inhibidor de la acción de la calpaína ralentizando la velocidad y el grado de ablandamiento post-morten de la carne (8). Está ubicado en el cromosoma 5 de la oveja, el sistema de las calpaínas está conformado por los genes de µ–calpaína (CAPN1), m–calpaína (CAPN2) y calpaína 3 (CAPN3), en los cuales se han identificado numerosos SNPs correlacionados con la terneza de la carne en diferentes especies (9,10). Además, las calpainas están involucradas en el crecimiento muscular en diferentes etapas de desarrollo y en la degradación de las proteínas musculares, lo que influye en la pérdida de masa muscular (7,8,9).

Los reportes de estudios de polimorfismos en los genes antes mencionados en ovinos de Colombia son limitados. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue caracterizar el polimorfismo genético tipo SNPs en los genes calpaína y calpastatina en el ovino de pelo criollo colombiano.

Poblaciones, colecta de sangre y extracción de ADN. En la presente investigación se utilizaron 300 individuos pertenecientes a dos subpoblaciones de OPC ubicadas en los departamentos de Valle del Cauca (VC, n=150) y Sucre (SC, n=150). Las muestras de sangre se colectaron en tubos con anticoagulante (EDTA 7.2 mg) teniendo en cuenta para los procedimientos de recolección de muestras, manejo y conservación, las normas éticas, técnicas, científicas y administrativas para la investigación en animales contenidas en la Ley 84 (Congreso Nacional de Colombia, 1989). El ADN se extrajo usando el estuche comercial QIAamp ^® DNA Mini Kit de QIAGEN. Se evaluó la cantidad y calidad del ADN usando el NanoDrop 2000TM (Thermo Fisher Scientific).

Amplificación y genotipificación de los loci CAPN y CAST. Todas las reacciones de PCR fueron llevadas a cabo en un volumen final de 25 µl que contenían 20 ng de ADN, 250 nM de cada cebador y 1X del súper mix MangoMix^TM (Bioline ^© ). Los cebadores utilizados para el locus CAPN (CAPNS1, accesión: XM_027514355.1) fueron 5’-AACATTCTCAACAAAGTGGTG-3’ y 5´-ACATCCATTACAGCCACCAT-3’ (11), para el locus CAST (CAST-A, accesión: KX_722534.1) 5’-TGGGGCCCAATGACGCCATCGATG-3’ y 5’-GGTGGAGCAGCACTTCTGATCACC-3’ (12). Los perfiles térmicos constaron de una desnaturalización inicial a 95ºC durante 5 minutos. Seguido por 35 ciclos de 95ºC por 30s, 60ºC por 60s y 72ºC por 60s para CAPN y de 95ºC por 60s, 58ºC por 60s, 72ºC por 60s para CAST; seguido por una extensión final de 10 minutos a 72ºC. Las amplificaciones fueron realizadas en un termociclador MasterCycler Nexus Gradient de Eppendorf^®. La visualización de los fragmentos amplificados se realizó por electroforesis en geles de agarosa al 1.2% a 80 V durante 45 minutos teñidos con GelRed^TM (Biotium).

Los genotipos para el SNPs estudiado en el locus CAST se obtuvieron por PCR–RFLP con la endonucleasa de restricción MspI, en un volumen final de 15 μl que contenían en 5 μl del producto de PCR, 1 U de la enzima MspI y 1 X de tampón. La incubación se realizó a 37ºC durante dos horas, seguido de 80ºC durante 20 minutos. Los productos de digestión se visualizaron en geles de poliacrilamida al 9% (Acrilamida:Bis–acrilamida 37:1) a 150 V por 40 minutos y teñidos con GelRed^TM (Biotium). Los genotipos fueron identificados según lo reportado por Azari et al (11) y Santos et al (12).

Para el gen CAPN los genotipos se obtuvieron por PCR–SSCP, en geles desnaturantes de poliacrilamida al 10% (100:1, Acrilamida:Bis–acrilamida) y 3.7% de glicerol. Cada muestra fue desnaturalizada con formamida (95% formamida, 0.05% de Xilene-Cianol, 0.05% de azul bromofenol, 20 mM de EDTA pH 8.0) y sometidos a 95°C por 5 minutos y luego enfriadas a 4ºC. Los geles fueron corridos a 190 voltios durante 5.5 horas, en una cámara Multigel Biometra. La tinción se realizó con GelRed^TM (Biotium). Los genotipos fueron identificados según lo reportado por Azari et al (11).

Análisis de datos. Se calcularon las frecuencias genotípicas, alélicas, la heterocigocidad observada (Ho) y esperada (He) y el índice de fijación (F) para cada subpoblación y en total. Se estimaron los desvíos del equilibrio de Hardy-Weinberg (EHW) y se realizó un análisis de varianza molecular para estimar los valores de F_ST, F_IS y F_IT. Se compararon las frecuencias genotípicas y alélicas encontradas entre locus y subpoblación utilizando el test de Fisher con una significancia del 5%. Todos los análisis fueron realizados con los programas Arlequin ver 3.5.2.2 (13) y GENALEX ver 6.5 (14).

Los dos SNPs evaluados fueron polimórficos. Las frecuencias alélicas y genotípicas no difirieron significativamente (p>0.05) entre subpoblaciones para ambos loci.

En el locus CAST, para toda la población en estudio, el genotipo MM fue el más frecuente, seguido por los otros dos genotipos (Tabla 1). El genotipo MM fue más frecuente en la subpoblación SC que en la subpoblación VC, aunque ocurrió lo contrario en el genotipo MN. Mientras que, el genotipo NN presentó igual frecuencia en ambas subpoblaciones (6%). Respecto a las frecuencias alélicas, el alelo M superó en frecuencia al alelo N (Tabla 1). El alelo M fue más frecuente en la subpoblacion SC y el alelo N el más frecuente en la subpoblación VC.

Para el locus CAPN se encontró mayor frecuencia del genotipo heterocigoto, en toda la población (48.2±0.7%) como en las subpoblaciones SC (48.7%) y VC (47.6%). El genotipo CC presentó la menor frecuencia (Tabla 1). El alelo T del locus CAPN alcanzó una frecuencia de 68.8 ± 1.5% para toda la población, siendo más alta en la subpoblación VC, de otro lado, el alelo C presentó mayor frecuencia en la subpoblación SC (Tabla 1).

En la tabla 2 se pueden apreciar los valores de diversidad genética en la población de OPC estudiada. En el locus CAST, los valores de Ho y He promedios fueron similares con un ligero exceso de heterocigotos no significativo; de otro lado, en el locus CAPN este exceso indujo a un valor negativo de F y desvios significativos del EHW (p<0.05). Los valores de Ho y He para el locus CAST fueron más altos en la subpoblación VC y en el locus CAPN en la subpoblación SC. Solo el valor de F fue positivo en la subpoblacion SC para el locus CAST (0.004) los demás valores fueron negativos. El análisis locus a locus indicó que todos se encontraban en EHW.

El análisis de varianza molecular mostró que el 100% de la variación es debida a diferencias dentro de los individuos, con valores no significativos (p>0.05) de F_ST, F_IS y F_IT de 0.002, -0.093 y -0.095, respectivamente.

Tabla 1
Tabla 1. Frecuencias genotípicas y alélicas en los loci CAST y CAPN en la raza OPC.

Tabla 2
Tabla 2. Ho, He, F valores y desviaciones del HWE en los loci estudiados en la raza OPC.

En el locus CAST (AF016006, AF016007 y AF016008.1) los fragmentos digeridos por la enzima MspI, se encontraron entre los exones 1C y 1D, donde ocurre una sustitución de A por G (15). En ovejas Dalagh se encontraron los genotipos MM (36%), MN (38%) y NN (26%) con mayor frecuencia del alelo M (55%) (16), en ambas subpoblaciones estudiadas y para el OPC el genotipo MM y el alelo M presentaron mayor frecuencia (Tabla 1).

Lo anterior concuerda con las frecuencias encontradas por Santos et al (12) en tres de cuatro razas estudiadas en Brazil; entre ellas la Pantaneira (MM: 58%, MN: 23%, NN: 19%; M: 70%), la Sufflok (MM: 80%, MN: 16%, NN: 4%; M: 88%) y la Ile de France (MM: 82%, MN: 12%, NN: 6%; M: 88%) pero no con lo encontrado en la raza Bergamacia (MM: 28%, MN: 34%, NN: 38%; M: 45%). En ovinos Iranies de raza Afshari se reportan los alelos M y N con frecuencias de 74% y 26%, respectivamente (17) y en las frecuencias genotípicas encontradas, el homocigoto NN presentó mayor frecuencia (10%) que la aquí mostrada; los otros genotipos tuvieron frecuencias de 57 y 33% para MM y NN, respectivamente.

Por otro lado, en la raza Zel las frecuencias alélicas fueron de 85.5% para M y de 14.5% para N (16), con frecuencia para los genotipos MM (75%) y NN (4%) menor a la encontrada en el OPC. En ovejas autoctonas de Pakistan Balkhi, Kajli y Beetal las frecuencias del alelo M fueron de 88, 86 y 100%, respectivamente; con el genotipo MM más frecuente (Balkhi: 76%, Kajli: 74%, Beetal: 100%) y ausencia del genotipo NN en las razas Balkhi y Beetal y con baja frecuencia (2%) en Kajli (18). La frecuencia del alelo N en la raza Kurdi fue superior (12%) a la encontrada en los OPC con ausencia del genotipo NN y mayor frecuencia del MM (76%) (19). Es de resaltar que el alelo M de este locus se ha asociado con altos pesos al nacimiento (15).

Para el locus CAST se ha comparado las técnicas PCR-RFLP y PCR-SSCP como alternativas de genotipaje. Se logró determinar que los alelos A y C obtenidos por SSCP podrían ser digeridos con la enzima MspI, también que los genotipos AA, AC y CC eran similares al genotipo MM determinado por RFLP, igualmente, el genotipo MN es similar con los genotipos AB y BC (por SSCP) y por último, el genotipo NN concuerda con el genotipo BB (11,16). En otro locus del gen CAST (exones 10, 11 e intrón 10) en 80 animales de la raza OPC, las frecuencias alélicas encontradas fueron de 93.7% para A y de 6.3% para B, con frecuencias genotípicas de 88.75, 10 y 1.25% para AA, AB y BB respectivamente (20).

El valor de He en el locus CAST, fue menor al encontrado en las razas Dalagh (11) (49%) y Zel (16) (25%), la Pantaneira (42%), la Sufflok (21%) y la Ile de France (21%) y Bergamacia (50%) (12) Balkhi (21%) y Kajli (24%) (18) pero mayor al reportado en OPC (11%) (20) y el ovejas Kurdi (7.9%) (19). De igual forma, en la presente investigación se encontró un exceso no significativo de heterocigotos, al igual que EHW. Lo anterior indica que no se ha realizado selección a favor de alguno de los alelos de este locus, o la ausencia de programas de mejoramiento genético asistido por herramientas moleculares. Por su parte, Molano (20) en el mismo grupo racial aquí estudiado, presentó un deficit de heterocigotos no significativo y ausencia de las proporciones teóricas del EHW. Resultados contrarios se presentan en ovejas Dalagh (11) y Zel (16) la Pantaneira, Ile de France y Bergamacia (12) donde los autores encontraron déficit de heterocigotos con desviaciones significativas de EHW (Tabla 2).

Para el locus CAPN (AF309634.1) se estudió una variación, ubicada entre los exones 5 y 6, que consiste en una transición sinónima de T/C en el nucleótido 44 del gen (11,16). Variaciones en este locus ha sido asociado con características de crecimiento y calidad de canal en ovejas (21,22). Contrario a lo aquí reportado, en tres razas de ovejas de Egipto (Barki, Rahmani y Ossimi) se presenta al genotipo CC y al alelo C como el más frecuente y con ausencia del genotipo TT en las razas Barki y Ossimi (22) (Tabla 1). En otro locus (CAPN316) del gen CAPN en la raza OPC, las frecuencias alélicas encontradas fueron A: 54.4% y B: 45.6%, con mayor frecuencia del genotipo heterocigoto (38.75%) que de los homocigotos (AA: 35% y BB: 26.25%) (20).

En ovejas Merino, se reportan tres alelos para este gen siendo el alelo A1 y el genotipo A1B1 los más frecuentes con valores de 46.7 y 41.9%, respectivamente (23). Asimismo, en ovejas Baluchi se reportan tres patrones de bandas con frecuencias genotípicas de 8.2 (G1), 89 (G2) y 3% (G3) (11). En ovinos Bandur reportan dos alelos con frecuencias 82 (A) y 18% (B), y dos genotipos AA (67%) y AB (33%) (24), de forma similar, en ovejas Zel solo se encontraron los genotipoas AA (69%) y AB (31%) con frecuencias alélicas de 84.5 y 15.5 para A y B, respectivamente (16) y en ovejas Kurdi (19) las frecuencias alélicas para A y B fueron de 96 y 4% con ausencia del genotipo BB y mayor frecuencia del genotipo AA.

Las investigaciones antes citadas, así como en el presente trabajo se utilizó la metodología de genotipaje PCR-SSCP para el locus CAPN, pese a la simplicidad de la técnica, en varios reportes, los patrones de movilidad de las bandas fueron diferentes. Algunas razones que podrían explicar por qué en las cadenas de ADN monocatenario puedan observarse más de dos bandas siendo la misma secuencia, se relacionan con la estabilidad molecular de la cadena que puede verse afectada por un exceso de cebadores, un manejo lento después de la desnaturalización que ocasione un emparejamiento o re-asociación biomolecular (25) y por las condiciones de electroforesis, donde, factores como la temperatura, tiempo de corrida, concentración del buffer, composición del gel, posición del SNP en el fragmento analizado al igual que el tamaño del fragmento, pueden influenciar la sensibilidad de la tecnica (26).

La He encontrada en este estudio para el locus CAPN es superior a la reportada en las razas Bandur (29.5%) (24), Zel (26%) (16) y Kurdi (7%) (19), pero inferior a la informada por Molano (20) en OPC (49%). Por otro lado, en este locus se encontró un exceso no significativo de heterocigotos intra poblacional, pero al analizar toda la población en estudio (Tabla 2), este exceso fue significativo con desviaciones del EHW (p<0.05). Esto podría atribuirse a la falta de endogamia por la existencia de un flujo génico, así como el cruce rápido de hembras y machos migrantes con los individuos residentes en las subpoblaciones. Por el contrario, déficit de heterocigotos sin desvios de EHW se presentan en OPC (20), y en la raza Zel este déficit ocacionó desvios de EHW (p<0.05) (16). Asimismo, en las razas Kurdi y Bandur el exceso de heterocigotos encontrado no causó desvíos significativos de EHW (19,24).

El análisis de varianza molecular mostró que la variación encontrada solo es debida a diferencias dentro de los individuos, lo que es confirmado por el bajo valor de FST encontrado (0.002, p=0.653), lo que indica una baja estructura poblacional con flujo de genes entre las subpoblaciones estudiadas (5), además, los valores de F_IS y F_IT negativos y no significativos (p>0.05) contrastan con lo reportado en OPC (F_IS=0.183) (20), lo que podría explicarse por el origen diferente de los animales evaluados al igual que por diferencias en el manejo de los sistemas de producción respecto a sus sistemas o esquemas de cruzamiento.

Finalmente, los resultados del presente estudio mostraron que los loci estudiados tienen buena variabilidad que es necesario conservar. Adicionalmente, las frecuencias alélicas encontradas son considerablemente altas, por lo que, podrían usarse estos resultados en futuros planes de selección asistida por genes, en miras a aumentar la productividad de los sistemas ovinos que usan al OPC como base genética.

Los autores declaran no tener conflictos de interés

A los productores de OPC en departamentos de Valle del Cauca y Sucre que permitieron la colecta de las muestras.