El aumento de las concentraciones de gases de efecto invernadero (GEI) en la atmosfera (1) ha acelerado los procesos de cambio climático (2). Los principales GEI son dióxido de carbono (CO₂), metano (CH₄) y óxido nitroso (N₂O), los que han aumentado en un 40, 150 y 20%, respectivamente, desde 1990 (3).

En relación al CH₄, se estimó que las emisiones totales provenientes del ganado rumiante en 2014, fueron alrededor de 97.1 millones de toneladas (1), lo que constituyó el 18% del total de CH₄ vertido al medio ambiente (4).

Durante el proceso digestivo los rumiantes generan CH₄ formado por bacterias metanógenas (5), que se expulsa a través del eructo (6,7), que tiene un impacto ambiental y constituye una pérdida de energía para el animal del orden del 5 al 12% (6). Sin embargo, las emisiones de CH₄ podrían reducirse mediante el mejoras sanitarias, el manejo del rebaño, la dieta o con la inclusión de metabolitos secundarios de plantas (MSP) (5).

Existen diferentes MSP como los taninos condensados (TC), aceites esenciales (AE) y glucósidos cianogénicos (GC), con diferentes mecanismos de acción, que les permite reducir la generación de CH₄ en el rumen (8,9). Estos MSP son compuestos químicos sintetizados por la propia planta (5) y el mecanismo principal relacionado con la disminución de la metanogénesis es la modificación de la actividad antimicrobiana (7).

La acción reductora de la producción de CH₄ de los TC y AE se ha demostrado ampliamente con resultados favorables. En este sentido, cuando se incorporó un 20% de Amaranthus spinosus (planta que contiene TC) en el sustrato de un ensayo de fermentación in vitro, se obtuvo una reducción del 26% de CH₄ (10). Además, cuando se utilizaron AE de clavo de olor (Syzygium aromaticum), tomillo blanco (Thymus mastichina) y anís (Pimpinella anisum), el CH4 se redujo en 37, 76 y 32% respectivamente (8). Del mismo modo, cuando se utilizó AE de clavo de olor en dosis de 200 mg, el CH₄ se redujo 84.21, 69.49, y 80.34% respectivamente (9), cuando el sustrato era una dieta mixta, concentrado y heno, respectivamente, demostrando el efecto que tienen los MSP como reductores de CH₄.

La Linamarina es un tipo de GC, que se encuentra principalmente en la yuca (Manihot esculenta Cranz), con mayor concentración en las variedades amargas. Se ha observado que el uso de la yuca en condiciones in vitro tiene un efecto antimetanogénico (11). Al analizar las concentraciones de Linamarina en la corteza de yuca, se encontraron 28.40±3.38 g/kg de peso seco y 7.71±0.97 g/kg en peso fresco, mientras que en el parénquima de yuca se encontró 14.71±1.91 y 5.77±0.74 g/kg en forma seca y fresca respectivamente (12). El efecto de la yuca sobre la reducción de CH₄ en la fermentación in vitro, se demostró con la inclusión de 12 mg MS de raíz y hoja de yuca. La producción de CH₄ fue 70.50±1.32 y 65.70±1.32 mL/g de MS digerida de hoja y raíz de yuca respectivamente, mientras que cuando no se incluyó la yuca, la producción de CH₄ fue de 74.2±1.32 mL/g de MS digerida (13).

La Linamarina, tiene el potencial para reducir la producción de CH₄ en los rumiantes, cuando se usan las dosis adecuadas. Sin embargo, el efecto de la inclusión de diferentes dosis de Linamarina pura in vitro es poco conocido. El objetivo del estudio fue cuantificar los efectos de incluir dosis crecientes de Linamarina sobre la concentración de CH₄ a diferentes tiempos, durante la fermentación ruminal in vitro.

Manejo de animales. Se dispuso de 2 ovejas de la raza Merino Precoz, de cuatro años, a las cuales le fueron instaladas fístulas ruminales en el año 2014, de acuerdo con el protocolo del Comité de Bioética y Bienestar Animal de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile. Estas se manejaron en la sección de Rumiantes Menores y Pastizales del Secano de la Estación Experimental Germán Greve Silva, que pertenece a la Facultad de Ciencias Agronómicas de la Universidad de Chile, ubicada en la comuna de Maipú, Región Metropolitana, Chile (Lat. 33º 28’S y Long. 70º 51’W; 470 m.s.n.m.). El experimento se llevó a cabo en el Laboratorio del Departamento de Producción Animal, de la Facultad de Ciencias Agronómicas, Universidad de Chile.

Dieta. Durante el periodo del ensayo, las ovejas fueron alimentadas con 1.2 kg de heno de alfalfa y 300 g de grano de avena por animal por día, distribuido en dos raciones, una entregada en la mañana y otra en la tarde. En la tabla 1, se presenta la composición nutricional de la dieta suministrada y los insumos que fueron empleados como sustratos fermentativos (SF), para la incubación.

Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1. Composición bromatológica de la dieta suministrada y sus componentes.

	S (%)	DN (%)	FDA (%)	PC (%)	Energía (Mcal/kg MS)
Heno de Alfalfa	2.84	9.33	38.09	16.66	2.21
Grano de Avena	9.89	8.69	13.79	11.06	2.72
Dieta	1.37	9.01	25.94	13.86	2.50
MS: Materia Seca, FDN: Fibra Detergente Neutra, FDA: Fibra Detergente Acida, PC: Proteína Cruda, (Mcal/kg MS) Megacalorías por kilogramo de MS.

Recolección de líquido ruminal (LR). En cada día de incubación, la recolección de LR se realizó por la mañana, en condición prepandial. Se recolectaron dos litros durante los tres días de incubación. El LR se filtró con un paño de algodón de doble capa, se almacenó en un recipiente inserto en un termo con agua a 39ºC, con el fin de mantener una temperatura estable para ser transportado al laboratorio y llevar a cabo la inoculación.

Diseño experimental. El estudio fue de medidas repetidas con un factor y cinco niveles, donde se probó Linamarina (pureza ≥98%; Sigma-Aldrich Chemical, Darmstadt, Alemania, Cat. No. 68264-50 mg) en cinco dosis diferentes (0, 6.0, 13.0, 20.0 y 26.0 mg/L). Cada dosis representó un tratamiento. En cada tratamiento, se agregó LR y la dosis respectiva de Linamarina, se incubó in vitro en 5 tubos de ensayo (repeticiones), midiendo la concentración de CH₄ cada hora, durante 8 horas de incubación. Este protocolo se repitió en tres días consecutivos.

Inoculación. Se empleó la técnica in vitro descrita por Theodorou et al (14). Se utilizaron 25 tubos de ensayo de 100 mL, provistos de tapón de goma con válvula Bunsen. En cada tubo se colocó el SF que consistió en 0.5 g de heno de alfalfa y 0.5 g de grano de avena molidos a 1 mm, en un molino tipo Wiley. A cada tubo de ensayo se le añadió 30 mL de LR y 40 mL de solución buffer. La composición de la solución buffer fue: 238 mL de solución macromineral (5.7 g Na₂HPO₄ + 6.2 KH₂PO₄ + 0.6 g MgSO*7H₂O + agua destilada 1 L) más 238 mL de solución tampón de fosfato (35 g NaHCO₃ + 4 g NH₄HCO₃ + agua destilada 1 L, pH 7.0) en 1 L de agua destilada (15).

Incubación. Los tubos se ordenaron en gradillas y puestos en una cámara termorregulada (Memmert, modelo 854, Alemania) a 39ºC, por un periodo de ocho horas consecutivas. La temperatura se mantuvo monitoreada constantemente y los tubos se mantuvieron con movimientos rotatorios.

Mediciones de CH₄. Este procedimiento se llevó a cabo cada una hora durante ocho horas consecutivas, utilizando un monitor de gases RKI Eagle 2 (RKI instruments, California, EE. UU.). Dicho monitor es un instrumento de alta precisión, que utiliza un sensor de conductividad térmica (infrarrojo), capaz de detectar concentraciones variables de CH₄, dentro en un rango de 0 a 50.000 ppm.

Análisis estadístico. Los datos se analizaron mediante un análisis de varianza, con el programa Statgraphics 5.0. Los datos tuvieron distribución normal. No hubo diferencias al comparar los datos entre días de incubación, entonces los datos de los diferentes días se analizaron en conjunto. Los datos fueron analizados por tiempo, tratamiento y la interacción tiempo vs tratamiento. Cuando fue pertinente, las diferencias entre los grupos se analizaron mediante la prueba de Tukey. Las diferencias fueron consideradas significativas cuando p≤0.05. Los datos se presentan en promedio grupal ± SEM. Adicionalmente, se realizaron contrastes polinomiales para determinar efectos lineales o cuadráticos.

Reducción de la concentración de CH₄. La tabla 2 muestra los promedios generales de concentraciones de CH₄, de acuerdo con cada dosis de Linamarina, el efecto lineal y cuadrático, así como la significancia de los tratamientos, el tiempo de fermentación y la interacción tiempo vs tratamiento.

Tabla 2 Tabla 2 Tabla 2. Medias de la concentración de CH4 con dosis crecientes de Linamarina en la fermentación ruminal in vitro.

	Tratamiento (LIN concentración mg/L)
	0	6	13	20	26
CH4 (ppm)	2738a	2472a	2485a	2243ab	1932b
EEM1	P2			P3
	T	H	T*H	L	Q
154.2	<0.001	<0.001	<0.001	0.002	0.015
a, b Medias con diferentes letras son diferentes (p≤0.05). 1EEM, Error estándar de la media; 2Probabilidad de diferencias entre tratamientos (T), horario de muestreo (H) e interacción (T*H);3Probabilidad lineal (L) o cuadrática (Q) para la concentración de LIN..

Las reducciones de CH₄ en relación con las dosis (6, 13, 20, 26 mg/L) fueron de 9.7, 9.2, 18.1 y 29.4%, respectivamente. Al regresar los valores de la concentración de CH₄ en función de los tratamientos se obtuvo efecto lineal significativo (p=0.002) y cuadrático (p=0.015) en la reducción de CH₄ con dosis crecientes de Linamarina.

El análisis de los datos por tiempo de incubación muestra una reducción (p≤0.05) de la concentración de CH₄ (Figura 1), donde las horas 1, 2 y 3 fueron las más altas (p≤0.05), pero similares entre ellas. Una disminución significativa comenzó a partir de la hora 4 de incubación, con una concentración de CH₄ de 3.480±20 ppm; este valor fue similar al de la hora 5. Se obtuvieron concentraciones más bajas de CH₄ a la hora 6 y 7 de incubación, con valores de 1.218±20 y 1.494±20 ppm, respectivamente. La hora 8 fue la más baja en CH₄ con una concentración de 840±20 ppm. Al regresar los valores de la concentración de CH₄ en función del tiempo se obtuvo una relación decreciente lineal significativa (R²=0.843; p≤0.001).

Figura 1 Figura 1 Figura 1. Reducción de la concentración de metano durante ocho horas de fermentación in vitro con linamarina.

Se obtuvo una interacción (p≤0.005) entre el tiempo de incubación y los tratamientos. El valor más bajo de la concentración de CH₄ se obtuvo con la dosis más alta de Linamarina en la hora 1. En este tiempo, la concentración de CH₄ fue aumentando cuando las dosis de Linamarina iban disminuyendo (Figura 2), mostrando un efecto de dosis/respuesta. Sin embargo, después de 2 horas de fermentación, se observó un patrón de reducción de CH₄ similar durante el resto del tiempo de fermentación.

Figura 2 Figura 2 Figura 2. Efecto de cinco dosis de linamarina en la producción de CH4, durante ocho horas de fermentación in vitro.

No se encontraron estudios en la literatura sobre el uso y la dosificación de Linamarina pura en la reducción de CH₄. Como se mencionó anteriormente, Linamarina es un MSP presente en la yuca. Las concentraciones de Linamarina en yuca fluctúan según la variedad, el lugar, la edad de la planta, el tiempo de cosecha y la forma en que se suministra en las dietas. En un análisis reportado, se encontraron 538.4±4.91 mg de Linamarina en 100g de MS de yuca, mientras que se obtuvieron 102.3±0.93 mg de Linamarina de 100 mL de mezcla acuosa, por lo tanto, es importante considerar la forma en que se ofrece la yuca, cuando debe suministrarse una dosis específica de Linamarina (16).

Se ha demostrado que el uso de variedades amargas de yuca como aditivo alimentario reduce las concentraciones de CH₄. En este sentido, Phuong et al (11) obtuvieron una reducción del 50 % de CH₄ en un ensayo de fermentación in vitro de 24 horas cuando se incluyeron 2.16 g/MS de hojas de yuca amarga. Hemos estimado la cantidad de Linamarina incluida en el experimento descrito anteriormente, de acuerdo con Maherawati et al (16), aunque estos autores no informaron la variedad de yuca utilizada para el análisis. Por lo tanto, la inclusión de yuca amarga tuvo un equivalente a 11.62 mg de Linamarina. Luego, los resultados de Phoung et al (11) son similares a los resultados obtenidos en el presente estudio, con la dosis de 13 mg/L de Linamarina pura. Otros resultados reportados por Inthapaya y Preston (17), muestran que cuando se adicionaron 12 g/MS de harina de hoja de yuca, con un equivalente de 64 mg/Linamarina, se obtuvieron los valores más bajos de CH₄, con una reducción del 35.5% de CH₄ a las 24 Horas de fermentación in vitro. Este porcentaje de reducción es mayor que la reducción máxima obtenida en nuestro estudio. Sin embargo, la inclusión de Linamarina utilizada por Inthapaya y Preston (17) fue aproximadamente 2 veces mayor que la dosis máxima utilizada en nuestro experimento, lo que confirma el efecto dosis/respuesta de Linamarina sobre la reducción de CH₄ en la fermentación ruminal in vitro.

Los hallazgos de esta investigación muestran que las cuatro dosis de Linamarina tuvieron una respuesta lineal en la reducción de las concentraciones de CH₄. Este resultado se relaciona principalmente con la forma en que se usó Linamarina, ya que tener una pureza ≥98 % lo hace altamente disponible para los microorganismos del rumen. En este sentido, cuando Do et al (18) utilizaron hojas de yuca como sustrato, más harina de raíz de yuca como aditivo, equivalente a 10.76 mg/ Linamarina, obtuvieron CH₄ 32.2 mL/g de sustrato, mientras que cuando no incluyeron aditivo, se obtuvo CH₄ 43.5 mL/g de sustrato. Además, la adición de harina de raíz de yuca al sustrato conduce a reducir la producción total de gas de 237 mL a 197 mL.

La regresión del tiempo de incubación vs la concentración de CH₄, muestra que la adición de Linamarina en la incubación con LR de ovejas presenta una tendencia a reducir la concentración de CH₄. Los MSP tienen un período de acción que puede variar dependiendo de las dosis suministradas, la dieta del animal (principalmente) y la capacidad antimicrobiana, que conduce a la reducción de protozoos y bacterias metanogénicas, lo que se traduce en una reducción constante de CH₄ en un determinado período (19,20).

Estudios anteriores han demostrado que la fermentación está influenciada por el tipo de proceso en los sustratos utilizados como recurso la Linamarina. En este sentido, Inthapaya et al (21) evaluaron los efectos utilizando hojas frescas de yuca, ensiladas, secadas al sol o al horno sobre la producción de CH4 in vitro, observando que el porcentaje de CH₄ fue menor para las hojas frescas y ensiladas en comparación con las que fueron secadas al sol o al horno, con valores de 12, 11, 14 y 15% de CH₄, respectivamente. Las hojas frescas de yuca contienen una mayor cantidad de Linamarina, por lo tanto, la reducción de CH₄ es mayor en comparación con las hojas secas de yuca, que, debido al proceso de secado, disminuye la concentración de Linamarina (21). Estos resultados concuerdan con los del presente estudio, en el que dosis más altas de Linamarina producen menos concentración de CH₄. Sin embargo, Inthapaya et al (21) también observaron que a medida que transcurre el tiempo de fermentación, aumenta la producción total de gas, así como el porcentaje de CH₄ de 11 a 16% de 12 a 24 horas de fermentación. Se ha observado que, en largos tiempos de fermentación, la actividad reductora de CH₄ tiende a disminuir, probablemente debido a la habituación de los microorganismos a la inclusión del aditivo o a una reducción de la efectividad del aditivo (22,23).

En conclusión, este estudio demuestra que la adición de Linamarina al sustrato de fermentación del rumen reduce la producción de CH₄ de una manera dependiente de la dosis. Además, la acción reductora de la metanogénesis de Linamarina depende del tiempo de fermentación. Este estudio constituye una base para cualquier prueba futura que incluya fuentes vegetales de Linamarina, así como otras variables del rumen y tiempos de fermentación in vitro más prolongados.

Los autores declaramos que no tenemos conflicto de intereses.