1. INTRODUCCIÓN

La antropología biológica, o antropología física, como se le conocía inicialmente, es la disciplina encargada de estudiar al ser humano desde las perspectivas fenotípicas y genotípicas, valiéndose de métodos de las ciencias llamadas “exactas” tales como la biología, la química y la física. No solo se emplea su sistematicidad y el método científico, además de ello, la utilización de tecnología, reactivos y procedimientos que permiten dilucidar aspectos más profundos sobre los orígenes de la humanidad.

El uso de la biología molecular no solo en muestras ar- queológicas humanas, sino en muestras vivas ha significado un avance constante en investigaciones de corte genético, estudiando el comportamiento de microorganismos y su capacidad patogénica, estableciendo y recreando cadenas completas de ADN con fines de identificación y/o patrones migratorios de poblaciones antiguas e incluso contemporáneas, características evolutivas, entre otros. Entre las investigaciones desarrolladas en este ámbito destaca el proyecto Genoma Humano y sus contribuciones han permitido una mejor comprensión del ser humano y sus procesos de salud y enfermedad. Las aplicaciones de la antropología biológica la convierten prácticamente en un eje transversal que tiene cabida en otras ciencias, entre ellas, las ciencias de la salud.

Por su parte, la ciencia odontológica siempre ha ido de la mano con la tecnología; la innovación e incorporación de técnicas, materiales e instrumental es lo que hace posible el mejoramiento de la odontología, tanto para los pacientes (mayor esperanza de vida de sus piezas dentarias y tejidos bucales), como para los clínicos (procedimientos menos invasivos, predecibles y con mejores resultados). La incorporación de las herramientas de la antropología biológica ha contribuido enormemente en el estudio del sistema estomatognático, donde se observa con otra perspectiva a las piezas dentarias y demás tejidos duros y blandos de la cavidad bucal. Ya no solo se estudian los procesos patológicos más comunes (periodontitis y caries) desde una perspectiva clínica, ahora también, con el uso de técnicas genéticas y de observación podemos ampliar más el objeto de estudio, determinando el comportamiento genético de los microorganismos y del mismo individuo que posee afecciones bucales.

El presente trabajo tiene como finalidad describir los aspectos básicos que relacionan a la antropología biológica con la odontología genómica, lo que permitirá a los profesionales de la odontología ampliar su conocimiento y dar a conocer la aplicabilidad que tiene esta disciplina calificada como “odontología del siglo XXI” por algunos autores y a los antropólogos conocer que existen herramientas fundamentales desde la odontología que permiten dilucidar procesos bioantropológicos.

2. CONCEPTOS BÁSICOS SOBRE EL GENOMA HUMANO Y LA ODONTOLOGÍA

2.1. Reacción en cadena de la polimerasa.

PCR (Polymerase Chain Reaction) por sus siglas en inglés, fue desarrollada por Kary Mullis en el año 1986 (Mullis y otros, 1986). Es considerado un proceso in vitro, efectivo para amplificar segmentos específicos de la cadena de ADN, la PCR consiste en la mezcla de oligonucleótidos o primers que inician la transcripción y flanquean el tamaño del fragmento a amplificar, dinucleótidos (dNTPs) que contiene las 4 bases nitrogenadas componentes básicos del ADN, ADN molde, diana o blanco, la enzima termoestable Taq DNA polimerasa encargada de la síntesis de la nueva cadena de ADN, acoplando los desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTP) con los desoxirribonucleótidos complementarios correspondientes del ADN diana, el equipo de terminociclado y las condiciones necesarias para que la enzima trabaje adecuadamente (cierto pH, MgCl2, KCl).

La taq Polimerasa es la encargada de la síntesis de ADN (en dirección 5´ a 3´, siendo el extremo 5´ un carbono del grupo fosfato libre al final de la cadena y 3´ el final de la cadena con un grupo hidroxilo) a partir de sustratos desoxirribunocléicos que, posteriormente, actúan sobre un ADN monocatenario. Durante el proceso, al agregar nucleótidos en el extremo 3´ de un oligoelemento creado por la misma reacción, éste puede unirse con otra plantilla monocatenaria, lo cual permite el alargamiento de la cadena de ADN (Watson, 2006).

Los procesos involucrados en la PCR son la desnaturalización, alineamiento y extensión lo que hace un ciclo que se repite varias veces para lograr la síntesis del ADN que se quiere copiar –amplificar-. En un primer momento, la plantilla de ADN molde se desnaturaliza por medio de los estímulos térmicos (aumento de la temperatura a 96°C), rompiendo los puentes de hidrogeno y separando las cadenas complementarias. En lo subsiguiente, los fragmentos de la cadena se unen a cebadores oligonucleótidos sintéticos (dos fragmentos cortos de cadenas sencillas, compuesto por aproximadamente 20 nucleótidos cada uno que limitan, la secuencia de ADN que se desea amplificar). Es en este momento donde se realiza la hibridación (nivelación de la temperatura a 55°C-65°C). Finalmente, ocurre la extensión (72°C), es cuando la enzima ADN polimerasa replica la plantilla monocatenaria con la incorporación de los nucleótidos valiéndose de la complementariedad de las bases nitrogenadas. Un nuevo ciclo comienza y vuelve a desnaturalizar que se utiliza como plantilla para una nueva síntesis de ADN (Watson, 2006).

En una reacción típica, este proceso se repite entre 25 y 35 veces, y puede durar entre 2 y 4 horas, de acuerdo a la longitud de la región del ADN que se quiera replicar y de otros factores incluido el equipo de termociclado. La verificación del éxito del proceso se realiza por medio de un proceso de electroforesis en geles de agarosa -separación de ácidos nucleicos a través de una matriz sólida, la cual funciona como filtro en un campo eléctrico de acuerdo a su tamaño y carga eléctrica- (Tamay de Dios, Ibarra y Velasquillo, 2013).

La aplicación de la PCR ha tenido una gran repercusión en el mundo científico. La biotecnología y la biología molecular aplican esta técnica prácticamente como punta de lanza en sus diferentes ramas. Por citar algunos ejemplos, en la producción de alimentos y su control de calidad, asegurándose de que se corresponda la calidad del producto con lo que se observa en las etiquetas, en la identificación de bacterias en el yogurt (Pérez, Aguilar, Tapia y otros, 2012), entre otros.

En el caso de la biomedicina, la PCR se ha utilizado en innumerables ocasiones para la detección de diferentes bacterias. Su aplicación tiene cabida en la veterinaria, por ejemplo, en la identificación de bacterias en sangre y leche canina (Olivera, Giraldo, Di-Lorenzo; 2011), pasando por la medicina en la tipificación de enfermedades, como, por ejemplo, la Leishmaniasis (Montalvo y otros, 2006) y más específicamente, en la Odontología (Romero-Salazar, Hernández-Solís, Rueda-Gordillo, 2013).

Otras aplicaciones de la PCR en ciencias médicas se encuentran en la identificación de polimorfismos (SNP), de los cuales se han revelado aproximadamente 10 millones, pueden determinar la resistencia individual a ciertas enfermedades y mutaciones, grandes cambios cromosómicos que pueden provocar, además de enfermedades, malformaciones y trastornos sistémicos (Checa, 2007).

2.2. ADN mitocondrial (mtADN).

La secuencia total del mtADN comprende unos 16.500 pares de bases, una cantidad mucho menor al número de bases que posee el ADN celular, fue identificada por Anderson y colaboradores en 1981. Es una molécula circular cerrada, y comprende 37 genes que codifican para proteínas que son utilizadas en la fosforilación oxidativa. Su importancia radica en que este tipo de ADN es heredado exclusivamente de la madre a sus hijos varones y hembras, pero solo las hembras las trasmiten a las siguientes generaciones; esto permite hacer una reconstrucción genética por vía materna y rastrear los orígenes de un individuo mediante los haplogrupos (mutaciones que se repiten en un grupo poblacional determinado) que contenga dicha muestra, hasta incluso a la llamada “Eva Mitocondrial” (Watson, 2006).

35.00 Teniendo esto en cuenta, la ingeniería genética, la arqueología y la antropología biológica han dedicado todos sus esfuerzos en dar respuesta al origen de las poblaciones humanas, intentando determinar los movimientos de grandes grupos humanos alrededor del planeta y sus asentamientos. A partir de la década de los 80’s y gracias a los avances tecnológicos, empezaron a surgir teorías, con bases moleculares, sobre el poblamiento de América. Turner, en el año 1984 (Citado en Moraga y otros, 2001), establecían que se registraron movimientos migratorios desde el noreste de Asia a través de Beringia (El estrecho de Bering), hace unos 35.00 años, hecho que pudo corroborarse a través de hallazgos arqueológicos. Otras teorías han sido parte del debate, sin dejar una respuesta certera.

Sin embargo, el uso del mtADN ha sido una fuente de información invaluable para determinar la genética de poblaciones y se considera entre los primeros marcadores moleculares de elección (Crespo, Dejean, Postillone y otros, 2010). Estudios como el de Stone y Stonekening (1993) fueron los pioneros en el análisis de los 4 marcadores mitocondriales en una población precolombina de 700 años de antigüedad.

La literatura confirma que los huesos y piezas dentales de restos antiguos son buenos reservorios de ADN y, por lo tanto, de mtADN. Sin embargo, hay que tener en cuenta que las condicio- nes ambientales del sitio arqueológico donde se encontraron los restos puede contaminar y degradar el ADN. Dado que luego de la muerte, los ácidos nucleicos se vuelven inestables (por oxidación e hidrólisis), mucho material genético se pierde, estudios en el área han determinado una disciplina denominando ADN antiguo, al estudio de las variantes genéticas en el ADN obtenido a partir de restos antiguos. Por otro lado, por las características del mtADN y su vasta presencia en las células, es posible secuenciar exitosamente fragmentos cortos, pero informativos del ADN mitocondrias y poder descifrar e inferir grandes dilemas de los movimientos poblaciones en el mundo (Crespo, Dejean, Postillone y otros, 2010)

2.3. Antígenos Leucocitarios Humanos (HLA).

El sistema de antígenos leucocitarios humanos es el en-cargado que el sistema inmunológico diferencie a las células propias del organismo de otras células y/o sustancias extrañas y dañinas. Son proteínas propias las células blancas de la sangre o los leucocitos (como su nombre lo indica). Es el sistema genético polimórfico más descrito, según lo establecen Al Sami y otros (2017) y Rey (2015).

El HLA fue descubierto en 1958 por Jean Dausset, y posteriormente fue incorporado al complejo mayor de histocompatibilidad, es parte del ADN nuclear, está ubicado en el brazo corto del cromosoma 6 humanos y se clasifica en tres clases (I, II y III), es una zona del genoma humano muy variable y contiene numerosos genes funcionales, caracterizados por un gran polimorfismo que permiten reconocer lo propio de lo extraño, por ejemplo, en casos de trasplantes, aunque también se emplea a nivel de determinación de fisiopatología y bioantropología (Thorsby, 2011 y Barzuna, 2003).

Las moléculas clase I son de origen intracelular y estimulan a los linfocitos T CD8, mientras que las moléculas clase II son de origen extracelular y estimulan a los linfocitos T CD4 (Rey, 2015). Ambos tipos de moléculas se relacionan con la respuesta inmunitaria del huésped. Las moléculas clase III están mayormente involucradas en el procesamiento de antígenos (Barzuna, 2003). Dentro de sus características principales, se mencionan:

• Es poligénico (constituido por varios genes organizados en 3 regiones).

• Es dialéctico (cada gen presenta dos variantes en el individuo y su expresión es codominante, siendo heterocigotos la mayor parte de los individuos de una población).

• Es polimórfico (múltiples variantes alélicas en cada locus).

• Presenta desequilibrio de ligamento: hay una frecuencia mayor de asociación entre los alelos de loci situados adyacentemente (Rey, 2015).

La detección del HLA en poblaciones humanas es importante dada la variedad que existe en los diferentes grupos que se han originado luego de las migraciones que siguen efectuándose. En este orden de ideas, la paleoserología es una herramienta fundamental, que permite determinar, entre otras cosas, el grupo sanguíneo de muestras humanas y es ampliamente aplicado en los estudios de genética de poblaciones. (De La Rúa, 1993)

Estudios realizados con el fin de comprobar los movimientos migratorios en el Estrecho de Bering (De La Rúa, 1993), utilizaron la paleo-serología para determinar a través del grupo sanguíneo y los antígenos presentes en las muestras, la vulnerabilidad de esa población a infecciones de ciertas bacterias, lo cual da la explicación la poca frecuencia de la combinación antigénica AB en las poblaciones actuales de regiones adyacentes. Inicialmente, fue Boyd en 1959 (citado en De La Rúa, 1993) quien sugería que las poblaciones que cruzaron el Estrecho eran del grupo sanguíneo B, mientras que Hart y otros en 1980 (citado en De La Rúa, 1993) proponía que esas poblaciones eran del grupo sanguíneo AB, los cuales son más vulnerables a ciertas bacterias, tales como el Pneumococcus y la Salmonella, por no presentar anticuerpos anti-A y anti-B, dando una posible explicación a la baja frecuencia de personas en la actualidad con la combinación antigénica AB.

El reconocimiento de la evolución genética y el patrón de dispersión de las poblaciones evidenciado a través de la aplicación del HLA es fundamental para resolver problemáticas de investigación en el área de bioantropología; sin embargo, es necesario reconocer ciertos marcadores genéticos de alta variabilidad para lograr medir con éxito las diferencias interpoblacionales y determinar genealogías por medio de análisis filogenéticos (Rey, 2015).

2.4. ADN de microorganismos.

Siendo el ADN una fuente de información de tan amplia riqueza, la cual, como fue mencionado anteriormente, puede determinar aspectos de evolución humana y sus patrones de movilización, es necesario tomar en cuenta que los microorganismos pueden arrojar datos útiles para las ciencias médicas, por medio de estudios multidisciplinarios en donde confluya la bioantropología, la paleomicrobiología, entre otras disciplinas. Es necesario destacar que, a través del ADN de los microorganismos, es posible detectar factores patogénicos en muestras antiguas; así mismo, la evolución de los microorganismos y establecer comparaciones con las formas patógenas actuales (Solórzano, Díaz, Smerling, Montiel y Malgosa; 2011). Teniendo en cuenta que las enfermedades siempre han estado presentes en el devenir del ser humano, es importante conocer la información que se pueda obtener a partir los microorganismos, siendo el ADN el reservorio principal. Estudios presentados tales como el de Campillo y otros (1998) develan la existencia de la tuberculosis durante la época medieval.

En cuanto a las enfermedades infecciosas, en el caso específico de la cavidad bucal, es necesario resaltar la caries dental, ya que es la enfermedad bucodental más común y que se ha identificado fragmentos de ADN de Streptococcus mutans, su principal agente causal en muestras arqueológicas (Solórzano, Díaz, Smerling, y otros, 2011). Es por ello que, una vez localizada el ADN de la bacteria en la muestra arqueológica, la identificación del mapa genético y el análisis funcional del microorganismo, es posible determinar la paleopatología de la caries dental en todos sus aspectos.

3. LA ODONTOLOGÍA GENÓMICA. ODONTOLOGÍA DEL SIGLO XXI

La Odontología ha sido considerada una ciencia en constante evolución. Desde sus inicios como cirujanos barberos en la Edad Media, la necesidad de establecer protocolos cientificistas fue evidente dado el empirismo en las técnicas que, en muchos casos y por desconocimiento, conllevaba a resultados letales. Sin embargo, para el siglo XVIII, Pierre Fauchard, considerado el padre de la Odontología moderna, estableció ciertos parámetros sistemáticos en los procedimientos odontológicos, los cuales son los fundamentos que procuraron el establecimiento de la ciencia odontológica. La incorporación de los materiales dentales, así como la creación de instrumental y la introducción de la farmacología (anestésicos locales), permitieron el tratamiento curativo y preventivo de la caries dental y la enfermedad periodontal, siendo estas las enfermedades más comunes en el ámbito buco-dental.

El conocimiento de la secuencia completa del ADN nuclear humano, ha permitido el estudio genético de patologías bucodentales lográndose un avance diagnóstico impresionante, ya que pueden detectarse variables genotípicas que posteriormente se manifestarán en el fenotipo de una generación o de las subsiguientes como alteraciones de los tejidos duros y blandos de cavidad bucal. Esta odontología genómica tiene 2 objetivos principales: la prevención y la predicción de las enfermedades bucales (Zerón, 2006).

La odontología genómica ha centrado en los últimos años sus estudios hacia las bacterias causantes de la enfermedad periodontal (Zerón, 2006) y la caries dental (Astorga y otros,2015); patologías, que como se ha indicado en párrafos anteriores, son las más comunes en cavidad bucal y que aquejan a gran parte de la población (OMS, 2012). A su vez, con el mejoramiento del diagnóstico, conlleva a introducir nuevas terapias génicas, tal como la farmacogenética y otros tratamientos que sean menos tóxicos y dirigidos a un nivel casi individual y personalizado para los pacientes (Zerón, 2006).

Es importante mencionar que estos avances han permitido la evolución de muchos campos de estudio dentro de la odontología, así como disciplinas científicas afines, lo cual permite el manejo interdisciplinario de problemáticas de investigación. Entre las cuales pueden mencionarse la odontología forense y la bioantropología.

4. ELDIENTECOMOHERRAMIENTABIOLÓGICA PARA RESGUARDAR EL ADN.

Los elementos dentarios están formados por cuatro tejidos: El esmalte, la dentina, el cemento radicular y la pulpa dental. Los tres primeros se caracterizar por estar formados por un alto grados de sustancia inorgánica (cristales de hidroxiapatita cálcica) y el último, la pulpa dental, es un tejido conectivo caracterizado por una densidad importante de células mesenquimáticas indiferenciadas. Dadas las características estructurales de los componentes de los dientes, en conjunto forman una protección de la pulpa dental, lo que puede traducirse en una preservación del material genético a agentes externos (Rodríguez, 2005). Teniendo en cuenta que se conoce la secuencia completa del ADN mitocondrial, muchos estudios se han valido de este conocimiento para analizar los haplogrupos y sus variaciones genéticas, determinando así sus orígenes, movimientos humanos migratorios y e incluso mutaciones y enfermedades, a partir de la obtención de ADN de dientes antiguos (Solórzano, Díaz, Montiel y otros, 2009).

4.1. Toma de muestras para el estudio de ADN en cavidad bucal.

En seres humanos vivos, la saliva es una fuente importante de material genético (Pandeshwar y Das, 2013), tiene como principales ventajas su recolección no invasiva, su fácil almacenaje y se requiere poco material para obtener ADN, a diferencia de otros tipos de muestras. Existen diferentes métodos para obtener muestras de saliva. Entre ellos se menciona la obtención de saliva completa, la cual se recolecta indicándole al sujeto que se enjuague (con un colutorio) y escupa en un vaso. El efecto del enjuague bucal reduce el crecimiento bacteriano durante el transporte de la muestra (Pandeshwar y Das, 2013).

El análisis genético de la saliva permite reconocer fragmentos de interés en el genoma humano, en el genoma de bacterias de la microbiota bucal e incluso la presencia de virus, por su riqueza en ADN, ARN y proteínas.

Otro método ampliamente utilizado para la obtención de material genético es la recolección de células epiteliales descamadas de mucosa bucal por medio de citología exfoliativa (Omaña y Martínez, 2009), la cual es una técnica sencilla, mínimamente invasiva y relativamente económica que permite la obtención de material genético ampliamente informativo.

La citología puede realizarse de varias maneras: por aposición (frotar un trozo de la muestra en una lámina porta-objetos), el raspado, el cual consiste en frotar un baja-lengua o un hisopo sobre la superficie de la lesión y posteriormente frotarlo en una lámina porta-objetos. Otras técnicas más específicas incluyen la utilización de kits o Citobrush, la cual utiliza el mismo principio del raspado, pero con un cepillo de cerdas muy suaves, para no modificar las células de la muestra durante la toma de la muestra (Omaña y Martínez, 2009). La identificación de ADN bacteriano en cavidad bucal permite determinar enfermedades, tales como: la caries dental y la enfermedad periodontal (Morillo, Lau, Sanz y otros, 2003).

Es importante destacar que a través del material genético obtenido a partir de la descamación de células epiteliales puede establecerse el diagnóstico precoz de ciertas lesiones en cavidad bucal, tales como papilomatosis, VPH, (Steinau y otros, 2011), cáncer bucal (Diniz, García, Crespo y otros, 2004), entre otras.

4.2. Toma de muestras para el estudio de ADN en restos antiguos.

Inicialmente, la evidencia evolutiva del hombre se basaba en los cambios morfológicos macroestructurales que se observaban en restos antiguos. La antropología física, cuyas técnicas incluyen las medidas antropométricas, osteométricas, entre otras, eran los métodos más factibles para determinar el transitar del hombre a través del tiempo. Sin embargo, la incorporación de la genética en la antropología biológica permite la recolección de evidencia genética en huesos e incluso, cálculo dental y piezas dentales.

La Antropología Biológica es posible gracias a los grandes beneficios de la PCR. La identificación de linajes a través del análisis de ADN mitocondrial o nuclear, a partir de restos óseos o dentales para extraer pequeños fragmentos de ADN y posteriormente secuenciarlo. Cabe destacar que, al momento de realizar el análisis de las muestras, hay que evitar a toda costa la contaminación con ADN contemporáneo, siguiendo los parámetros propuestos por Pääbo y otros (2004) descritos seguidamente:

• Tener un área pre-PCR y post-PCR separadas e independientes. Si es posible, en diferentes extremos del edificio y diferentes pisos.

• Irradiar con luz UV todas las superficies de trabajo y materiales de laboratorio, posterior lavado con lavadina al 10% (ambos desnaturalizadores de ADN-ADNasa) antes de cada extracción o amplificación de las muestras.

• Utilizar pipetas y reactivos exclusivos para el análisis del ADN antiguo (ADNa), así como material descartable estéril.

• La implementación de barreras físicas correspondientes para cada clínico (tapabocas, gorro, bata descartable de laboratorio, lentes, entre otros) y cambiarlos frecuentemente.

• Realizar las reacciones de PCR en campana de flujo laminar horizontal bajo flujo de aire positivo a través de un filtro HEPA en un ambiente estéril equipado con luz UV.

• Incluir un control negativo y un blanco de extracción para identificar falsos positivos, y contaminación con ADN exógeno.

• Cada extracción de ADNa debe realizarlas un único investigador, para evitar que se contamine la muestra.

Es necesario tener en consideración el buen uso de la PCR, ya que puede ayudar a los investigadores en biomedicina, y en este caso en específico, a los investigadores en antropología biológica, a obtener más datos de las muestras antiguas de poblaciones humanas, permitiendo tener un panorama más acertado y contrastando con otras fuentes de información disponibles. Todo esto, con el fin de dar respuesta a las grandes interrogantes que se han generado sobre nuestros orígenes en la tierra (Izaguirre, Durán y De La Rúa, 1998; Korlevic y otros, 2015). En el caso de muestras esqueléticas, es recomendable obtener una muestra ósea de al menos 2 cm2, la cual debe ser limpiada por abrasión con un arenador con el fin de asegurarse la eliminación total de ADN moderno (Izaguirre, Durán y De La Rúa, 1998).

La variabilidad genética de grupos humanos puede visualizarse gracias a la toma de muestras en restos esqueléticos, ya sean antiguos o actuales, por medio de la amplificación del ADN mitocondrial por medio de la PCR. Sin embargo, estas muestras deben encontrarse en buen estado de preservación, para que el material genético sea de la mejor calidad posible (Izaguirre, Durán y De La Rúa, 1998).

Para muestras dentarias, se toman en consideración ciertos aspectos que puedan afectar la calidad del material genético con- tenido en las mismas: que no posean lesiones cariosas, fracturas demasiado importantes que hayan contribuido a la contaminación del material genético, ápices abiertos, entre otros. Es necesario procesar la muestra a través de métodos químicos (ácido acético al 25%, ácido clorhídrico al 15%) que inactiven el ADN superficial. Posteriormente, se sumergen en una solución de etanol al 70% y agua destilada estéril. Y como paso final, la muestra dental se irradia con luz UV de 254 nm. (Izaguirre, Durán y De La Rua, 1998; Damgaard y otros, 2015). La muestra es procesada, pulverizando el fragmento seleccionado de la pieza dentaria, se decanta en un tubo de ensayo plástico y se almacena a bajas temperaturas hasta el momento en el que se proceda a los procesos de extracción, purificación y amplificación de ADN.

Se ha comprobado que el material genético procedente de piezas dentales tiene como ventaja la mejor preservación del ADN y menos riego de haber sido contaminado, por lo cual, se encuentra en mejor condición que el ADN que se encuentran en restos arqueológicos de huesos largos, los cuales tienen mayor riesgo de presentar contaminación del suelo, entre otros factores que puedan alterarlo.

Al momento de obtener el material genético, se hace pertinente, ya que la literatura no especifica protocolos establecidos, el uso de instrumental odontológico (desde la extracción de la pieza dentaria del alveolo con fórceps hasta el abordaje cameral y extracción del polvo dentario utilizando fresas de diferentes formas). Esto con el fin de que exista un contacto mínimo por parte del operador con las muestras (Díaz, 2009).

6.REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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