INTRODUCCION

Las frutas y verduras son componentes esenciales de la dieta humana y hay evidencia considerable de los beneficios de salud y nutricionales asociados con su consumo (Warriner et al., 2005; Abadias et al., 2008). Sin embargo, diversos microorganismos patógenos son frecuentemente vinculados con frutas y vegetales que se consumen crudos, los cuales en su mayoría provienen del tracto intestinal de animales de sangre caliente, incluido el hombre. Se destacan Salmonella spp, y Escherichia coli, entre otros (Gómez-Álvarez et al., 2012). Por lo tanto, el saneamiento de estos alimentos después de su cosecha es una práctica obligada que puede disminuir hasta un 50 % o más las pérdidas por descomposición debidas al ataque de estos microrganismos (Sargent et al., 2000). Esto ocurre principalmente por la desinfección del agua de lavado, superficie de los productos, equipo y cuartos de almacenamiento en lugar de controlar directamente las infecciones causadas por los patógenos en el producto (Feliziani et al., 2016).

Por ello, los desinfectantes se utilizan ampliamente para minimizar la contaminación de productos por patógenos que afectan la salud humana (Wirtanen y Salo, 2003; Gómez-López, 2012). Así, el saneamiento de recipientes de cosecha, soluciones de lavado, cepillos rotativos, cintas transportadoras, clasificación y otros equipos de procesamiento, se convierte en una necesidad fundamental cuando se manipulan frutas y verduras (Adaskaveg et al., 2002). Aunado a lo anterior, la industria de frutas y vegetales frescos está buscando tratamientos de desinfección eficaces para estos productos porque opera dentro de un área de incertidumbre regulatoria (Habibi y Haddad, 2009). Asimismo, los consumidores son cada vez más conscientes de las limitaciones de las técnicas de desinfección común, por lo que se buscan productos alimenticios seguros que sufran un procesamiento mínimo, con retención de alta calidad (Ramos et al., 2013). Hay una gran variedad de métodos utilizados para reducir la población de microorganismos en productos enteros y recién cortados. El mejor método es prevenir la contaminación en primer lugar. Sin embargo, esto no siempre es posible y el uso de técnicas que reducen y/o eliminan patógenos es de extrema importancia para prevenir brotes transmitidos por alimentos (Corbo et al., 2006). Los métodos químicos y físicos han demostrado ser moderadamente eficientes en la reducción de la microflora autóctona y también de los patógenos contaminantes (Parish et al., 2003). Los métodos químicos de limpieza y desinfección de las superficies de los productos usualmente implican la aplicación de lavado mecánico en presencia de desinfectantes, seguido de enjuague con agua potable (Wei et al., 2006). Se pueden utilizar varios agentes desinfectantes para el lavado de frutas y verduras con la intención de reducir el riesgo de contaminación microbiana, ayudando en la prevención de enfermedades postcosecha y enfermedades transmitidas por los alimentos (Zagori, 1999; Ramos et al., 2013). La evaluación de la eficacia de la desinfección de diferentes tecnologías se ve afectada en gran medida por varios factores, tales como las propiedades fisicoquímicas del agua de lavado del proceso y el tipo de producto (Gil et al., 2009). Además, los métodos utilizados para aplicar los tratamientos de descontaminación y las características del procedimiento (duración, secuencia de lavado, por ejemplo) también afectan a la recuperación de microbiota nativa y microorganismos patógenos (Pirovani et al., 2004; Ukuku y Fett, 2004).

Algunos de los nuevos agentes químicos que han ganado interés en los últimos años incluyen el dióxido de cloro, ozono, ácidos orgánicos, ácido peroxiacético, agua electrolizada oxidante y peróxido de hidrógeno (Joshi et al., 2013). Por todo lo expuesto anteriormente, el objetivo principal de esta investigación es evaluar la concentración y eficiencia durante el tiempo de uso de nuevos desinfectantes que reduzcan el deterioro microbiano de los productos frescos.

MATERIALES Y METODOS

Desinfectantes: Yodo (Fagalab, México), Peróxido de Hidrógeno (Fagalab, México), Ácido Peracético (BioSide™ HS 15 %), Cloro Granulado HTH 65 %, Hipoclorito de Sodio (Cloralex^®), y Agua Electrolizada (DESY^®), todos en concentraciones de 10 y 20 ppm.

Se realizó un ensayo con los anteriores productos y concentraciones en 1 l de agua desionizada para medir conductividad y pH en tiempos diferentes después de su preparación (0, 10, 20, 30, 60 y 120 min). la conductividad se midió con un conductímetro VWR (23226-505, Texas, USA) a una temperatura de 25 ºC y el pH con un equipo pH/mV/Ion (UP-25, Denver Instruments, Colorado, USA). los resultados se utilizaron como referencia para los ensayos posteriores.

Estandarización de la técnica para evaluación de los desinfectantes

Preparación del inóculo: las cepas de Escherichia coli (genérica) de marca Microbiologics, presentación 2 KWIK-STIK™ denominación ATCC, se cultivaron en tubos con 3 ml de caldo BHI y posteriormente se incubaron a 35 ºC durante 24 h.

Preparación del sub cultivo: Se tomó una asada del cultivo de trabajo (E. coli) y se resembró en 3 tubos con 15 ml de agar soya tripticasa (AST), los cuales estaban inclinados; posteriormente se introdujeron en una incubadora PRECISION (6-51221109, Texas, USA) para coliformes por 48 h a una temperatura de 35 ºC.

Preparación de la suspensión del microorganismo: Al subcultivo ya desarrollado se le adicionaron 5 ml de solución salina estéril al 0.85 % (0.85 g de NaCl + 100 ml de agua destilada, esterilizada a 121 ºC por 15 min), se agitó en Vortex (VORTEX-GENIE 2, Scientific Industries, New York, USA) por unos segundos para obtener la suspensión bacteriana y posteriormente se trasfirió a un tubo estéril. Se verificó el funcionamiento del espectrofotómetro UV-Visible VARIAN (CARY- 50, USA) y posteriormente se ajustó a 580 nm, la suspensión a 10 ± 2 % de transmitancia, utilizando como blanco la solución salina estéril (Anexo 2). A continuación se realizaron diluciones seriadas como se indica en la NOM-110-SSA1-1994. A partir de la dilución -4 hasta la -8 se comenzó a sembrar en placas por la técnica de vaciado; 1 ml por duplicado con agar PC, dejando una placa como blanco, posteriormente se incubaron por 48 h a 35 ºC. Transcurrido el tiempo se retiraron de la incubadora para determinar el crecimiento bacteriano con el equipo "contador de colonias" leica (3327, USA) para determinar la concentración total de UFC/ml, según los indica la NOM-092-SSA1-1994.

Desarrollo de la prueba: Para esta prueba se ocupó un inóculo de 500-10000 UFC/ml como se indica en la NOM-181-SSA1-1998. Con los resultados obtenidos del conteo bacteriano en la estandarización de la técnica se realizaron los cálculos y se obtuvo la concentración de carga bacteriana que se aplicó al desinfectante en cada uno de los tiempos (2 ml de la dilución -2 al 10 ± 2 % de transmitancia por cada 500 ml de desinfectante). Dicho inóculo se preparó diariamente para cada una de los desinfectantes a diferentes concentraciones, así como la verificación del espectrofotómetro que se ajustaba al 10 ± 2 % de transmitancia.

Preparación del desinfectante: Se prepararon por separado cada uno de los desinfectantes en concentraciones de 10 ppm y 20 ppm en 3 l de agua desionizada para posteriormente tomar 500 ml para cada tiempo a evaluar (0, 10, 20, 30, 60 y 120 min). Después, se le agregó 2 ml del inóculo antes mencionado, se agitó en el Vortex y se realizaron diluciones seriadas de -1 a la -7 según lo indica la NOM-110-SSA1-1994, sembrando en placas por la técnica de vaciado, 1 ml por duplicado con agar PC y dejando una placa como blanco. Transcurridos los tiempos indicados se incubaron a una temperatura de 35 ºC por 48 h. Por último, se retiraron de la incubadora para determinar el crecimiento bacteriano. Con los resultados de la cuenta de UFC/ml en la estandarización de la técnica y el conteo de colonias desarrolladas después de aplicar el desinfectante de prueba, se calcularon los porcentajes de reducción bacteriana de acuerdo a la NOM-181-SSA1-1998.

RESULTADOS

Conductividad Eléctrica (CE)

En la Figura 1 se presentan los resultados obtenidos en relación a la conductividad eléctrica de los desinfectantes evaluados en los seis tiempos de exposición (muestreos). Dicha medición se refiere a la capacidad de una solución acuosa para transmitir una corriente eléctrica y es igual al recíproco de la resistividad de la misma (Fuentes y Massol-Deyá, 2002). En esta investigación se utilizó como referencia el agua desionizada, la cual mantuvo una CE de 0.22 µS/cm con una resistividad de 4.64 Ω•m en todos los tiempos; por detrás del peróxido de hidrógeno con 0.26 µS/cm, seguido del yodo con una CE de 0.175 µS/cm. El desinfectante con mayor CE es el cloro con 25.4 µS/cm, aumentando un poco en el minuto 30 (25.7 µS/cm) con una resistividad de 0.039 Ω•m.

Como se puede observar en la misma figura, los desinfectantes aumentaron su CE cuando se aumentó la concentración de la solución a 20 ppm; a excepción del peróxido de hidrógeno (0.24-0.26 µS/cm), que se comportó casi a la par con el agua desionizada (0.22 µS/cm). Manteniéndose el cloro con una mayor CE, mientras que el ácido peracético y yodo se comportaron prácticamente igual, comparado con la solución a 10 ppm.

pH

El pH es una acrónimo para potencial de hidrógeno e indica la concentración del ion hidronio en una solución, el cual expresa la intensidad de un ácido, dependiendo de su capacidad de disociación, así como de su concentración (Fuentes y Massol-Deyá, 2002).

En los resultados obtenidos en la concentración 10 ppm (Figura 2) se observa que el agua desionizada mantuvo un pH de 4.94. Con respecto a los desinfectantes evaluados, el ácido peracético es el que presentó un pH más ácido (3.99), seguido del yodo (4.1-4.2) y el cloro presentó un pH alcalino iniciando con 7.5, aumentando en el minuto 30 a 8.05 para concluir con un pH 8.15 al minuto 120. En el caso del pH en los desinfectantes con una concentración de 20 ppm, no se observaron cambios relevantes en ninguno de los tiempos analizados en comparación con la concentración menor de los mismos (10 ppm). Sin embargo, visualmente cabe destacar que el pH bajó un poco cuando se aumentó la concentración de 10 a 20 ppm en todos los desinfectantes.

Porcentaje de Reducción Bacteriana (% RB)

Cuando una bacteria Gram negativa se encuentra frente a un agente interruptor, la fluidez de la membrana es afectada, iniciando la entrada del compuesto y por tanto, ejerciendo efecto para la destrucción del patógeno (químico-dependiente). Como respuesta, los microorganismos que presenten mecanismos de defensa (resistencia) generarán disminución de este efecto, utilizando diversas respuestas (Vaara y Kaakola, 1989; Vaara, 1992; Russell, 1995; Chapman, 1998; Segura et al., 1999; Champlin et al., 2005). También, existe la posibilidad de que la membrana citoplasmática (interna), pueda proveer un mecanismo de resistencia intrínseca, ya que se encuentra compuesta de lipoproteínas y prevendría la difusión pasiva de moléculas hidrofílicas (Denyer y Stewart, 1998).

En la tabla 1 se muestran los porcentajes del efecto de reducción bacteriana en cada uno de los desinfectantes en los diferentes tiempos de exposición. El cloro granulado en ambas concentraciones (10 y 20 ppm) y en todos los tiempos de exposición, obtuvo una eficiencia del 100 % sobre la bacteria E. coli al 10 % de transmitancia. En el caso del hipoclorito de sodio, por ser un derivado de los compuestos clorados y uno de los más utilizados en la industria alimentaria (Troller 1993; Stewart et al., 1994; Sanderson y Stewart, 1997), se esperarían resultados semejantes. Sin embargo, ni en las concentraciones evaluadas y en ninguno de los tiempos de exposición obtuvo un porcentaje de reducción bacteriana satisfactoria. En el minuto 0 con la concentración de 10 ppm obtuvo una eliminación del 99.30 % y en 20 ppm fue de 99.54 %. Por lo anterior y según la NOM-181-SSA1-1998, no es un desinfectante viable para ser utilizado. La NOM-181-SSA1-1998 indica que el porcentaje de reducción bacteriana debe ser igual o mayor al 99.99 % para considerar que el desinfectante puede ser utilizado.

El uso de agua electrolizada para desinfección de agua, frutas y verduras es una tecnología relativamente nueva en la industria alimentaria (Meireles et al., 2016). Este es un método respetuoso con el medio ambiente, ya que sólo utiliza sal y agua para producir la solución química; no hay problemas en el manejo de la solución (Huang et al., 2008; Aday, 2016). El agua electrolizada Desy® indica en el modo de empleo que para desinfectar bajo condiciones normales, el tiempo de contacto es de un minuto. Para la desinfección de agua se requieren 7 gotas del desinfectante por cada litro de agua y para el caso de frutas y verduras, 1 taza de desinfectante por cada 8 tazas de agua potable. Los resultados obtenidos muestran que en ambas concentraciones evaluadas y en todos los tiempos de contacto, se obtuvo un 100 % de reducción bacteriana.

En el caso del yodo cuando se aumenta la concentración resultó ser más eficiente en reducción bacteriana (100 %) hasta el minuto 30. En contraparte y en la concentración de 10 ppm, en ese mismo tiempo su eficiencia fue del 99.92 %, lo que indica que después de ese tiempo no se puede seguir utilizando.

López et al. (2002), evaluaron la acción germicida in vitro de productos desinfectantes utilizados en la industria alimentaria. Ellos demuestran que con una concentración de 2000 ppm de ácido peracético y con un inóculo de 10⁷ ufc/mL de Escherichia coli, tuvo una disminución del 99.99 % a los 5 min de exposición. Según el test de Chamber utilizado para evaluar lo anterior, considera como un buen desinfectante al producto que, a la concentración recomendada, cause un 99.99 % de muerte a una cantidad entre 7.5 x 10⁷ y 1.3 x 10⁸ células/mL en 30 segundos. Comparado con nuestros resultados, este mismo desinfectante, con un inóculo menor (5000-10000 ufc/mL) así como sus concentraciones, arrojó una eficacia del 100 % desde el minuto 0 de exposición hasta el minuto 60. Al aumentar la concentración a 20 ppm se obtuvo un resultado del 100 % de reducción bacteriana en todos los tiempos de exposición.

El peróxido de hidrógeno es un fuerte oxidante. Los productos de reacción con materia orgánica son oxígeno y agua. Los trabajos de Sapers (2001) demostraron que soluciones de peróxido de hidrógeno al 1 % eran capaces de reducir la población de E. coli en la superficie de manzanas inoculadas igual o mejor que 200 ppm de hipoclorito. El uso de peróxido de hidrógeno como agente desinfectante está limitado para algunas frutas y hortalizas. En esta investigación se utilizaron concentraciones de 10 y 20 ppm, arrojando una disminución del 99.60 % en la concentración de 20 ppm al minuto 0. Mientras que a una concentración de 10 ppm y a partir del minuto 30, fue incontable ya que la NOM-092-SSA1-1994 indica que solo se deben de contar las placas que tengan de 25 a 250 UFC, para disminuir el error de conteo.

CONCLUSIÓN

Bajo las condiciones del experimento y de muestreo utilizadas en este trabajo, los resultados muestran un efecto de reducción bacteriana (E. coli) en todos los desinfectantes durante los tiempos de exposición; sin embargo, los desinfectantes con mayor efectividad fueron el cloro granulado HTH 65 % y el agua electrolizada Desy^®. En todos los tiempos de exposición obtuvieron un 100 % de eficiencia en ambas concentraciones. En el caso del ácido peracético, al aumentar la concentración su eficacia se mantuvo en 100 % hasta el minuto 120. Peróxido de hidrógeno resultó el desinfectante con menor efectividad a una concentración de 10 ppm con un 83.33 % de efecto de reducción sobre la bacteria E. coli en el minuto 0.

De acuerdo a los resultados del presente estudio, se recomienda el uso del cloro HTH 65 % y agua electrolizada Desy^® en ambas concentraciones (10 y 20 ppm), así como la del ácido peracético (BioSide™ HS 15%) a 20 ppm contra la bacteria E. coli, dada su alta efectividad en el tiempo máximo de exposición evaluado (120 min). En el caso del yodo (20 ppm), se puede utilizar los primeros 30 minutos manteniendo una eficiencia del 100%.

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Notas de autor

Autor de correspondencia: E-mail: jemagaro@ciad.mx