La ejecución de la investigación incluyó las siguientes actividades:

• Adecuación del método de aminas biógenas. Se determinó el límite de cuantificación y rango de trabajo para el análisis de histamina y tiramina en muestras de chicha de jora

• Exploración del número total de productores de chicha de jora. Tras realizar un recorrido previo en los distritos de Abancay y Tamburco, se determinó que el número de chicherías es variable debido a la baja demanda de esta bebida y a la temporada del año, por lo cual se decidió recolectar todas las muestras durante el recorrido programado.

• Recolección de muestras. Las muestras fueron recolectadas durante los meses de junio y julio del 2015

• Ejecución de ensayos. Se realizaron los análisis de aminas biógenas (Histamina y Tiramina) y análisis fisicoquímicos (%Acidez, pH, grado alcohólico y sólidos totales)

• Muestras. Las muestras de chicha de jora consideradas en el estudio fueron recolectadas, tras realizar un recorrido completo por los distritos de Abancay y Tamburco; encontrando 82 chicherías en total, 57 en Abancay y 25 en Tamburco.

Figura 1
Cromatógrafo líquido (1100 Serie - Agilent Technology) - HPLC
Elaboración Propia

Estas muestras fueron transportadas a la ciudad de Lima en Coolers a -18°C por 24 horas, luego acondicionados y almacenadas a temperatura de congelación hasta el momento de sus análisis.

Equipos. Cromatógrafo líquido (1100 Serie - Agilent Technology) con bomba cuaternaria y detector de arreglo de diodos. Condiciones cromatográficas:

• Columna: RP 18e (125mm*4mm*5μm)

• Fase Móvil: Metanol- Agua (80:20)

• Bomba: Isocrática

• Flujo: 1 ml/min

• Volumen de inyección: 20μl

• Detección: 254nm

• emperatura: 30ºC

• Histamina y Tiramina (NCh 2637. Of 2001). La descripción del ensayo se muestra en la Figura 2.

  • A 5 g de muestra se le agregó 10 mL de ácido tricloroacetico al 5%. Se agitó en el Shaker por 30 minutos, y el sobrenadante se centrifugó por 15 minutos a 3000rpm. Se filtró y re-filtró el sobrenadante con papel Whatman #4 y filtros de membrana de 0.45µm respectivamente.

  • Se prepararon las soluciones estándar de tiramina e histamina de 1000 mg/L cada una en ácido tricloroacetico al 5%. De estas soluciones madre se prepararon soluciones de trabajo de 2, 4, 8, 16, 32 y 40mg/L para tiramina y 0.5, 1, 2, 4, 8 y 10 mg/L para histamina.

  • Los extractos de muestras, conjuntamente con las soluciones estándar fueron derivatizadas con cloruro de dansilo, añadiendo secuencialmente lo siguiente:

    • 100 µL de extracto de muestra o solución estándar

    • 400 µL de solución de bicarbonato de sodio 0.25M

    • 200 µL de solución de cloruro de dansilo 10mg/mL.

    • 300 µL de solución de bicarbonato de sodio 0.25M

  • Los derivatizados se incubaron a 60°C por 1 hora en un baño maría. Se enfriaron a temperatura ambiente. Y las muestras fueron inyectadas en el equipo HPLC.

• %Acidez (AOAC Official Method 950.07). 50 mL de las muestras desgasificadas fueron tituladas con solución de hidróxido de sodio 0.1N estandarizada. El punto final fue evaluado con el valor de pH, siendo aceptable de 8.1 a 8.3.

• pH (AOAC Official Method 945.10). A 50 mL de las muestras desgacificadas de chicha de jora se introdujo el sensor de pH (previamente calibrado con Buffer de pH 4 y 7) y se realizaron las lecturas.

• Grado alcohólico (AOAC Official Method 935.21). Se pesó una fiola de 100 mL. Luego se agregó agua desionizada (20°C) y se registró el peso. A la misma fiola seca, se le agregó la muestra de chicha de jora (20°C) y se pesó. Esta muestra fue colocada en un sistema de destilación con la ayuda de 30 mL de agua. El destilado se recibió en la misma fiola y se pesó a 20°C.

• Sólidos totales (NOM-116-SSA1-1994). En una placa vacía se pesaron alrededor de 4g de arena purificada y se colocó en la estufa a 100°C por 2 horas. En la placa acondicionada se pesaron entre 2 y 6 g de muestra de chicha de jora previamente preparada. Se mezcló bien con la arena y se llevó al baño maría a 90°C hasta sequedad. Las muestras del baño maría se llevaron a la estufa por 4 horas a 100°C.

Figura 2
Proceso seguido para la determinación de aminas biógenas
Elaboración Propia

Medidas de control

Cada muestra fue analizada por duplicado y aleatoriamente se introdujeron muestras adicionadas con solución estándar de las aminas biógenas en estudio, como sistema de aseguramiento de la calidad de resultados.

En la evaluación de resultados, se evidenció la presencia de picos cromatográficos de histamina y tiramina (Figura 3, 4 y 5). En estas figuras, el eje “Y” es una medida de la intensidad de la absorbancia (en unidades de mAU o unidades de mili-absorbancia); el eje X esta en unidades de tiempo (generalmente minutos), y se usa para determinar el tiempo de retención (tR) para cada pico.

Figura 3
Picos cromatográficos de la solución estándar de histamina y tiramina /// Eje “Y”: intensidad de absorbancia(mAU); y el eje “X”: tiempo (minutos)
Elaboración Propia

Figura 4
Picos cromatográficos de una de las muestra de chicha de jora en estudio /// Eje “Y”: intensidad de absorbancia(mAU); y el eje “X”: tiempo (minutos) /// Procedencia de la muestra: distrito de Tamburco /// Numero de muestrasanalizadas por distrito: 25
Elaboración Propia

Figura 5
Picos cromatográficos de una de las muestra de chicha de jora en estudio /// Eje “Y”: intensidad de absorbancia(mAU); y el eje “X”: tiempo (minutos) /// Procedencia de la muestra: distrito de Abancay /// Numero de muestrasanalizadas por distritoñ: 57
Elaboración Propia

Los picos cromatograficos fueron cuantificados con el uso de estándares de aminas biogenas de concentración conocida, y tras el cálculo respectivo se obtuvieron los valores presentados en la Figura 6 y 7.

Figura 6
Representación gráfica del contenido (mg/L) de Histamina y Tiramina en las muestras de Chicha de Jora deldistrito de Abancay
Elaboración Propia

Figura 7
Representación gráfica del contenido (mg/L) de Histamina y Tiramina en las muestras de Chicha de Jora deldistrito de Tamburco
Elaboración Propia

Con un 95% de nivel de confianza, los resultados de las muestras de chicha de jora en estudio fueron comparados estadísticamente con la concentración límite permisible para cada amina biógena (se utilizó el valor mínimo dentro del rango expuesto); 8 mg/L para histamina y 25 mg/L para la tiramina, según lo indicado por Soufleros et al. (1998), quien reportó que estas concentraciones pueden causar efectos fisiológicos negativos tras el consumo de muestras de vino.

La evaluación previa se ejecutó aplicando ANOVA de 1 factor para cada distrito, realizando el contraste de la hipótesis nula (todas las muestras tienen igual concentración de aminas biógenas) y la hipótesis alterna (al menos una de las muestras presenta diferente concentración de aminas biógenas). Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla1.

Tabla 1
Comparación del contenido de aminas biógenas por muestra

Elaboración propia

En base a las conclusiones obtenidas, se procedió a realizar una segunda evaluación con la finalidad de conocer las diferencias en la concentración de aminas biógenas y verificar cuantas muestras superan el valor límite permisible previamente establecido. Para esta evaluación se aplicó la Prueba Tukey al 95% de confianza, obteniendo los resultados de la Tabla 2.

Tabla 2
Prueba Tukey, agrupación por concentración de aminas biógenas

Elaboración propia

En la Tabla 3 se muestra un resumen de datos obtenidos durante la investigación

Tabla 3
Resumen de resultados

Elaboración propia

Los valores máximos obtenidos superaron los límites permisibles. Situación similar al estudio sobre el contenido de tiramina y otras aminas en Boza «bebida fermentada de cereales que tiene como uno de sus ingredientes al maíz», donde se reportaron concentraciones de hasta 82.79 mg/L de Tiramina (Cosansu, 2009). Los resultados reportados en ambos trabajos de investigación remarcan la importancia de la evaluación del contenido de aminas biógenas en bebidas de fermentación espontanea, y así evitar el riesgo de producir daños al consumidor.

Para el caso de la histamina, la Boza sólo reportó valores hasta 4.07 mg/L (Cosansu, 2009). Esta diferencia puede estar relacionada a características propias de cada bebida o a las prácticas de manufactura aplicada para la elaboración, tal es el caso del estudio de comparación entre diferentes tipos de cerveza, donde se concluyó que la cerveza de fermentación espontánea, presenta la mayor concentración de histamina, tiramina y otras aminas biógenas; pero no todas las cervecerías en estudio mostraron bebidas con alarmantes niveles de estas sustancias (Loret et al., s.f.).

Analizando los resultados obtenidos, se presume que el bajo porcentaje de muestras que superaron los límites permisibles, puede estar relacionado a la presencia de Lactobacillus plantarum en la chicha de jora (Quillama, Pasteris y Manca de Nadra, 1996. Última investigación realizada a la fecha de redacción del presente artículo). Teniendo en cuenta que esta bacteria es productora de bacteriocinas con capacidad de inhibición de Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Salmonella sp. (Huamán, 2013), y bacterias lácticas (Quillama, 1998. Última investigación realizada a la fecha de redacción del presente artículo); microorganismos que en su mayoría están relacionados con la formación de aminas biógenas (Fernández y Alvares, 2005). Adicionalmente, en una evaluación de las especies de bacterias lácticas capaces de sintetizar aminas biógenas en vino, se concluyó que Lactobacillus plantarum no es productor de histamina y para el caso de la tiramina, menos del 1% de Lactobacillus plantarum encontrados son productores de esta amina biógena (Molenaar et al., 1993 citado por EFSA., 2011).

Todas las muestras de chicha de jora recolectadas fueron analizadas, y se resumen los resultados en la Tabla 4.

Tabla 4
Resumen de resultados de parámetros fisicoquímicos

Elaboración propia

Los valores obtenidos para pH y acidez, están incluidos en el rango de concentración reportado en muestras de fermentación espontanea provenientes del Valle del Mantaro – Huancayo (García-Ventocilla, 2008).

Los valores del grado alcohólico en el rango de concentración reportado en muestras de fermentación espontanea provenientes de Arequipa, Cusco, Piura y Lima (Manrique, 1979. Última investigación realizada a la fecha de redacción del presente artículo). La densidad promedio obtenida es similar al reportado en muestras de fermentación espontanea provenientes de Catacaos y Sullana (Gonzales, 1987. Última investigación realizada a la fecha de redacción del presente artículo).

Estos datos permiten concluir que las características fisicoquímicas de esta bebida milenaria, son similares en diferentes lugares del Perú, planteando la hipótesis de que el método de preparación es equivalente; pero la antigüedad de las referencias es una limitante que debe ser subsanada con nuevos trabajos de investigación sobre la caracterización de muestras de chicha de jora de fermentación espontanea.

Se estudiaron los coeficientes de correlación al 95% de nivel de confianza entre la histamina, tiramina, y el resto de parámetros analizados con el fin de determinar una posible relación entre ellos. Utilizando la prueba de Análisis de regresión, se realizó el contraste de la hipótesis nula (P>0.05, coeficiente de correlación es igual a cero) y la hipótesis alterna (P<0.05, coeficiente de correlación es diferente de cero).

Las comparaciones que presentaron valores de coeficientes de correlación (r) significativamente diferentes de cero (P <0,05), son aquellas que presentan un grado de relación considerable y son mostrados en la Tabla 5.

Tabla 5
Relación entre aminas biógenas y parámetros fisicoquímicos

Elaboración propia

El grado de correlación entre la histamina y la tiramina en las muestras de chicha de jora en estudio fue mayor que el reportado en el análisis de aminas biógenas en muestras de sidra [r = 0.67] (Garai-Ibabe, 2010).

Estas diferencias hacen presumir que la dependencia Histamina – Tiramina también está influenciada por el tipo de alimento en el que se desarrollan las aminas biógenas. El alto grado de correlación puede ser indicativo de la presencia de un microorganismo con capacidad descarboxilante para ambas aminas biógenas en las muestras analizadas (Loret et al., s.f.).

A pesar de que el coeficiente de correlación presentado para la comparación Histamina - %Acidez es significativa (r=0.502), el modelo matemático obtenido, sólo presentó un 21.9% de confianza, lo que permite concluir que el nivel de relación entre ambos parámetros es baja y no es representativa para las muestras de chicha de jora en estudio.

En cervezas europeas se ha reportado que el contenido de histamina y tiramina fueron mayores en cervezas con altos valores de acidez total y de pH (Camacho et al., 2007); sin embargo, en un estudio de aminas biógenas en muestra de boza «bebida fermentada que incluye maíz entre sus ingredientes», no se encontró relación significativa entre las aminas biógenas estudiadas y el valor de pH (Yegin y Uren, 2008), tan igual como los resultados obtenidos en este trabajo de investigación. De manera general, se menciona que un alto valor de pH aumentaría el contenido de aminas biógenas (Gardini et al., 2005 citado por Garai-Ibabe, 2010); ya que el nivel del pH es un factor importante que influye en la actividad de descarboxilación del aminoácido (Silla Santos, 1996 citado por EFSA, 2011), siendo el pH óptimo para la actividad amino descarboxilasa entre 4,0 y 5,5 (Halász et al., 1994 citado por Karovicova y Kohajdova, 2003). Sin embargo, hay dos mecanismos relacionados al pH que actúan simultáneamente, uno provoca el incremento de la acidez qué inhibe el crecimiento de microorganismos (Maijala et al., 1993 citado por EFSA, 2011), y el otro afecta la producción y actividad de la enzima porque en un ambiente de pH bajo, se estimulan las bacterias para producir más enzimas descarboxilasas como parte de su mecanismo de defensa contra la acidez (Molenaar et al., 1993 citado por EFSA, 2011). Estos factores contrarios interfieren entre sí y el resultado neto depende de su equilibrio (EFSA., 2011).

En un trabajo de investigación, sobre la cerveza, se observó que las muestras menos fermentadas tenían los mayores contenidos de histamina; sin embargo, no presentaron una correlación significativa entre el nivel de histamina o tiramina y el contenido de alcohol (Landete, 2005). En otro estudio, se reportó que el etanol presente en el vino también influye en la concentración de histamina, encontrando que cuando las concentraciones superaban el 10% v/v de etanol se observaba una disminución en la población microbiana y por tanto en los niveles de histamina; sin embargo cuando los niveles de etanol eran iguales o inferiores al 10% v/v, se encontró que la producción de histamina aumentaba con la concentración alcohólica; concluyendo que la actividad del enzima descarboxilasa se ve favorecida por la presencia de etanol hasta cierto grado alcohólico (Camacho et al., 2007).

Tan igual como en las muestras de chicha de jora en estudio, no se han reportado correlación significativa entre histamina o tiramina y la materia seca total en muestra de boza, «bebida fermentada que incluye maíz entre sus ingredientes» (Yegin y Uren, 2008).