INTRODUCCIÓN

Las crecientes demandas de combustible derivado del petróleo, debido al rápido desarrollo de la industria automotriz, junto con los problemas de contaminación ambiental, han inspirado los esfuerzos en la exploración de combustibles alternativos (Thangavelu, Saleh y Nasir, 2016). Desde esta perspectiva, se ha fomentado la producción y el consumo de energías renovables, sostenibles y respetuosas con el medioambiente, a través de la biomasa lignocelulósica, la cual puede obtenerse a partir de materiales de desecho de las actividades agrícolas (Conesa, Segui y Fito, 2013). Las fuentes de biocombustibles están distribuidas geográficamente de manera más uniforme que los combustibles fósiles, lo que las convierte en una opción ideal para cumplir con los requerimientos de manera sostenible. Varios promotores de esta alternativa energética subyacen a los crecientes intereses de los biocombustibles, a causa de la creciente incertidumbre de los suministros de petróleo por el aumento de la demanda, la disminución de las reservas conocidas, la preocupación por el calentamiento global y las emisiones de gases de efecto invernadero asociadas con el uso de combustibles fósiles (Saini, Saini y Tewari, 2015).

Los sustratos vegetales están compuestos por celulosa, hemicelulosa y lignina, los cuales eran considerados la materia prima del futuro para la producción de biocombustibles, por su bajo costo y disponibilidad (Abril y Navarro, 2012). La producción y el uso de dichos combustibles ayudan a minimizar las emisiones de gases de efecto invernadero, ya que son obtenidos de fuentes de energía alternativa; asimismo, la producción de bioetanol a partir de materia lignocelulósica implica diferentes etapas: pretratamiento, hidrólisis, fermentación (Silva y Oliveira, 2014).

Por esos motivos, en este estudio se utilizará la cáscara de plátano, la cual es una fuente abundante de material celulósico, que es el constituyente externo del banano, representa alrededor del 40% en peso y tiene el potencial de producir alcohol; sin embargo, es necesario un procesamiento químico y bioquímico para convertir estos polímeros en azúcares monoméricos (Quintero, Martínez, Velasco et al., 2015). Una vez en forma monomérica, los azúcares pueden convertirse mediante microorganismos fermentativos en bioetanol; además, durante la etapa de pretratamiento e hidrólisis, se producen compuestos no deseables que afectan negativamente la tasa de fermentación de la levadura. También, la toxicidad de estos compuestos, llamados inhibidores, sobre los microorganismos es uno de los principales factores limitantes en el rendimiento de bioetanol durante la fermentación (Jaramillo, Gómez y Fontalvo, 2012). Por ello, debe realizarse un pretratamiento antes de la hidrólisis para remover la lignina, hidrolizar la hemicelulosa a azúcares fermentables, y reducir la cristalinidad de la celulosa para liberar la glucosa (Morales, 2012). Esto determina el rendimiento que se obtendría después de la fermentación alcohólica.

En ese sentido, Saval (2012) manifiesta que la hidrólisis enzimática se aplica una vez que los residuos han sido tratados. Así, las cadenas poliméricas son más expuestas para que la generación de compuestos tóxicos no aumente y se evite la adición de compuestos químicos. El proceso se lleva a cabo mediante la adición de enzimas celulíticas al biorreactor (Zhao, Cao, Wang et al., 2013). El uso de la Trichoderma en la industria biotecnológica se debe a su capacidad de producir diversos metabolitos y por su adaptación a diversas condiciones ambientales y sustratos. Por otro lado, la levadura Saccharomyces cerevisiae es usada frecuentemente en la fermentación alcohólica (Sotelo, Avilez y Ginés-Carbajal, 2015), por ser un microorganismo anaeróbico facultativo que tiene la capacidad de fermentar la glucosa y no presentar muchas exigencias en cuanto a nutrientes. Por tal motivo, el objetivo de la presente investigación fue hidrolizar la celulosa y hemicelulosa presente en la cáscara de banano maduro a azúcares reductores y su posterior fermentación alcohólica para obtener bioetanol de segunda generación.

METODOLOGÍA

Materiales

Las cáscaras utilizadas fueron de bananos maduros de la variedad Cavendish. Estas habían sido desechadas de las líneas de producción de la empresa Diana Food S. A., que tiene su planta de procesamiento ubicada en Pasaje, provincia de El Oro, en Ecuador. Asimismo, se empleó polietilenglicol de peso molecular 1500 (PEG 1500) de Sigma-Aldrich (Alemania). El hongo fue obtenido de la marca comercial Trichoeb, proporcionado por Ecua Biológica (Ecuador); y la levadura activa seca fue proporcionada por Levapan (Ecuador).

Pretratamientos

Se molió la cáscara, con la finalidad de aumentar su área de contacto con el hongo, luego se procedió a realizar un tratamiento térmico en una autoclave All American 25X a 121 °C durante 15 minutos.

Diseño del experimento

Se prepararon tres soluciones al 60% de cáscara molida de banano, concentración reportada por Romero, Ayala, y Lapo (2015), ya que, con este porcentaje de cáscara se obtiene mayor concentración de glucosa hidrolizada. Se añadieron 3 concentraciones diferentes de PEG 1500, mostradas en la Tabla 1: PEG1 (0,01); PEG2 (0,02) y PEG3 (0,03 g/g biomasa), para evaluar su efecto como inhibidor en la hidrólisis, ya que la lignina y otros compuestos que se encuentran presentes en los residuos lignocelulósicos limitan la hidrólisis de la celulosa y la hemicelulosa (Ko, Um, Park et al., 2015).

Hidrólisis enzimática

La hidrólisis enzimática de la biomasa se realizó en biorreactores de 2 L a una concentración de 60% de cáscara, a los cuales se les añadió tres concentraciones diferentes de PEG 1500 (0,01-0,03 g PEG/g biomasa). Estas habían sido disueltas en agua purificada y agitadas durante 5 minutos para que el PEG absorba a los inhibidores de la hidrólisis enzimática. Posteriormente, se adicionó 0,4 g/L de conidios del hongo Trichoderma viride. Se agitó durante 1 hora a 200 rpm y se tomó una muestra cada hora. Durante el proceso se midió pH, °Bx (grados Brix) y oxígeno disuelto, para lo cual se utilizó un medidor portátil de acuerdo a lo manifestado por Tejeda, López, Rojas et al. (2015).

Cuantificación de azúcares reductores

Para la cuantificación de glucosa se tomó una muestra de hidrolizado en un tubo de ensayo y se centrifugó a 10 000 rpm durante 10 min, y con el sobrenadante se hizo una dilución de 1:10. Luego se tomaron 0,5 mL de la dilución y 0,5 mL del reactivo DNS, los cuales se colocaron en un tubo de ensayo en baño de agua a 100 °C por 5 min. En este lapso el ácido 3,5 dinitrosalicílico fue reducido por los azúcares reductores que entran en contacto con el mismo, ocasionando un cambio de color con variaciones de amarillo hasta café (Ávila, Rivas, Hernández et al., 2012). Se enfrió hasta lograr temperatura de ambiente y se adicionó 5 mL de agua destilada. Se agitó y se realizó la lectura a 540 nm en el espectrofotómetro Hach DR 3900 (Canseco, Aráoz, Gusils et al., 2015).

Con el experimento PEG3 (PEG 0,03 g/g cáscara), que fue el tratamiento con el que se obtuvo mayor concentración de glucosa, se realizó la fermentación para la obtención de bioetanol.

Fermentación

Después de la hidrólisis enzimática de la cáscara, se inactivó el hongo pasteurizando el hidrolizado a 90 °C por 10 min (Centeno, 2016). Se trabajó con un volumen de 1000 mL, se controló el pH y se adicionó 800 ufc/mL de levadura seca comercial (Saccharomyces cerevisiae) que previamente fue activada; asimismo, se colocó el jarabe glucosado en un biorreactor anaerobio, donde se tomaron muestras para medir la concentración de alcohol mediante cromatografía de gases. El pH, °Bx y oxígeno disuelto se midieron con un equipo multiparamétrico.

Estimación comparativa de costos variables

Se realizó una estimación comparativa de costos variables del proceso de sacarificación mediante hidrólisis enzimática y de fermentación alcohólica, para lo cual se asumió una base de cálculo de 600 g de cáscara/L de solución.

A continuación, en la Tabla 2 se detallan los costos de los insumos necesarios en el proceso.

RESULTADOS

La Figura 1 presenta la producción de azúcares reductores (mg/L) para los 3 tratamientos y una muestra control durante 24 horas de hidrólisis enzimática.

En el experimento con PEG 0,03 g/g biomasa se alcanzó un incremento de 895,95 (± 1,9) mg/L de azúcares reductores, existiendo diferencias significativas con respecto a los otros tratamientos, tal como se puede evidenciar en la Tabla 3, donde todos los p-value alcanzaron valores menores a 0,05.

Por otro lado, la Figura 2 muestra el efecto del polietilenglicol (PEG) agregado a la cáscara de banano maduro molida a diferentes concentraciones (Tabla 1), en la producción de glucosa. Se puede observar que existen diferencias significativas entre los pretratamientos estudiados.

Por su parte, la variación del pH respecto al tiempo de hidrólisis enzimática de cáscara de banano maduro en las condiciones de estudio se puede observar en la Figura 3.

Asimismo, la disminución del oxígeno disuelto durante el proceso de hidrolizado, se muestra en la Figura 4.

Adicionalmente, el comportamiento de la producción de bioetanol durante la fermentación por un periodo de 4 días se observa en la Figura 5.

DISCUSIÓN

A partir de la Figura 1 se pudo observar que la adición de PEG con concentración de 0,02 y 0,03 g/g biomasa (PEG2 y PEG3) aumenta los rendimientos de azúcares reductores hasta valores de 895,95 (± 1,9) mg/L, lo que permitió obtener un rendimiento de alcohol del 7% v/v (Figura 5). Este rendimiento de etanol obtenido en este estudio es mayor al reportado por Benjamin, Singh, Dipuraj et al. (2014), los cuales encontraron 2,38% y 6% de etanol a los 2 y 7 días respectivamente. Estos autores utilizaron 5% de cáscara en polvo, Aspergillus niger al 3% p/v y pH 6, desinfectada la cáscara de banano con etanol al 70%. Posteriormente, la secaron al sol durante 7 días y la fermentaron con 4% v/v de inóculo de Saccharomyces cerevisiae. Un estudio comparativo de costos variables se puede observar en la Tabla 3. Mayores rendimientos de etanol (59,3% p/v) han sido reportados por Boluda, García, González et al. (2010) a partir de cáscara de mandarina, pero utilizando explosión con vapor como pretratamiento de la biomasa utilizada en la fermentación alcohólica. Precisamente, este pretratamiento tiene la desventaja de causar la generación de inhibidores que afectan el proceso de fermentación, para lo cual debe combinarse con H2SO4 o CO2 para mejorar la eficiencia del proceso; además, existe el riesgo de producción de compuestos fenólicos solubles (Sánchez, Gutiérrez, Muñoz et al., 2010).

Por otra parte, con respecto al descenso del pH en función del tiempo de hidrólisis de la cáscara de banano maduro presente en los tratamientos PEG1, PEG2 y PEG3 (Figura 3), se puede manifestar que este se produce desde 6,2 a 4,9 unidades de pH en el tratamiento de control; de 6,2 a 4,8 en el tratamiento PEG1; de 6,5 a 4,6 en el tratamiento PEG2; y de 6,5 a 4,6 en el tratamiento PEG3; estabilizándose después de 18 horas de hidrólisis en todos los tratamientos, lo cual indica que el hongo modifica el pH del medio de cultivo para su crecimiento y producción de glucosa.

Por su parte, el comportamiento del oxígeno disuelto, respecto al tiempo (Figura 4), se puede observar que decrece conforme avanza la hidrólisis enzimática, debido a que una fracción de este microorganismo lo consume como parte de la vía metabólica aeróbica.

Además, el análisis en los costos variables del pretratamiento aplicado a la cáscara de banano en la producción de etanol obtenido en este estudio, para glucosa producida a partir del mejor tratamiento aplicado (PEG3) en comparación con otros estudios, se presenta en la Tabla 4 lo siguiente.

Estos costos están calculados en dólares para cada etapa del proceso empleado, tanto en la hidrólisis enzimática como en la fermentación alcohólica, utilizando una base de cálculo de 600 g de cáscara de banano maduro (60% p/v).

Es importante mencionar que el método mencionado por Benjamin, Singh, Dipurak et al. (2014) incluye una etapa de secado de la cáscara de banano por un tiempo de 7 días, lo cual es una desventaja importante para el proceso propuesto por esos autores.

CONCLUSIONES

Se observó que el polietilenglicol (PEG) influye en la conversión de la celulosa de la cáscara de banano maduro en glucosa mediante hidrólisis enzimática. Siendo el tratamiento PEG3, el que produjo mayor cantidad de jarabe glucosado. Se encontraron diferencias significativas para la glucosa obtenida entre los tres tratamientos hidrolíticos. Los resultados demuestran que a partir de residuos lignocelulósicos de la cáscara de banano maduro, se puede obtener bioetanol, cuyo rendimiento obtenido de 7% v/v se aproxima a otros reportados en ese campo de investigación. Por otro lado, el análisis de los costos variables del pretratamiento aplicado a la cáscara de banano en la producción de etanol obtenido permite estimar que el método planteado en este estudio es menos costoso comparado con los demás, a partir del mismo residuo, con mayor rendimiento de bioetanol e incluso en menor tiempo.

Referencias

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