El contenido de azúcares reductores se determinó con el método del ácido dinitrosalisílico y se empleó la D-glucosa (Sigma) como azúcar patrón (Miller, 1959). La absorbancia se medió a una longitud de onda de 456 nm.

La cuantificación de carbohidratos en las muestras se realizó colorimétricamente mediante el método del fenol–sulfúrico (Dubois et al., 1956), con el uso de D-glucosa como azúcar patrón. Las muestras fueron leídas a una absorbancia de 490 nm.

El contenido proteico se determinó colorimétricamente mediante el método descrito por Lowry et al. (1951), con el uso de albúmina de suero bovino (BSA) como patrón. Los valores de absorbancia se obtuvieron a 750 nm y las concentraciones (mg/ml) se determinaron mediante la curva patrón.

La extracción de los fenoles solubles se realizó según el método descrito por Quiñones et al. (2015). Se mezcló 0.1 g de polvo de hojas secas y metanol (3 veces hasta volumen final 1ml). La mezcla se agitó vigorosamente, se centrifugó a 15 000 rpm durante 5 minutos y se colectó el sobrenadante. El precipitado se homogenizó en hidróxido de sodio 2 mol l^-1 para la extracción de los fenoles ligados a las paredes celulares, y luego se neutralizó en igual volumen de ácido clorhídrico 2 mol l^-1. La concentración de fenoles solubles se determinó con el uso de ácido clorogénico (0.05 mol/l) como patrón y los valores de absorbancia fueron determinados a 725 nm.

Para la determinación de los metabolitos secundarios se utilizó la metodología descrita por Chigodi et al. (2013). Se evaluaron de manera cualitativa los extractos etanólico y acuoso de hojas y raíces.

Antocianinas: se mezcló 1 ml de cada extracto con 3 ml de agua destilada y posteriormente se adicionó 1 ml de ácido clorhídrico (HCl) 2 mol l^-1 y de solución amoniacal 0.5 mol l^-1 a 1 ml de la mezcla anterior. La presencia de un color rosado-rojo que se torna azul-violeta indicó la presencia de antocianinas.

Terpenoides: se mezcló 1 ml de cada extracto con 1 ml de cloroformo (CHCl₃) y a continuación se adicionaron 2 ml de ácido sulfúrico (H₂SO₄) concentrado. La coloración rojo-parda en la interfase indicó la presencia de terpenoides.

Flavonoides: se adicionó 1 ml de hidróxido de sodio (NaOH) 0.1 mol l^-1 a 1 ml de cada extracto y posteriormente se agregó igual volumen de ácido clorhídrico (HCl) 0.1 mol l^-1. La formación de un color amarillo en la solución indicó la presencia de flavonoides.

Taninos: se mezcló 1 ml de cada extracto con 2 ml de agua destilada y la mezcla se calentó en un baño termostatado. Posteriormente se le adicionaron dos gotas de solución de cloruro férrico al 1% en metanol. La presencia de taninos se identificó mediante la formación de un color verde oscuro en la solución.

Saponinas: se mezcló 1 ml de cada extracto con 3 ml de agua destilada, se agitó con vigor y posteriormente la mezcla se calentó a 100ºC. La formación de espuma con pequeñas burbujas mostró la presencia de saponinas.

Antraquinonas: se mezclaron 2 ml de cada extracto con 3 ml de ácido clorhídrico (HCl) al 10% y la mezcla se calentó a 100ºC durante 3 minutos en baño termostatado. Posteriormente se dejó enfriar a temperatura ambiente. Seguido se adicionó igual volumen de cloroformo (CHCl₃) y a continuación unas gotas de solución amoniacal al 10% y se volvió a calentar la mezcla. La formación de una coloración rosada indicó la presencia de antraquinonas.

Glucósido cardiotónico: se mezcló 1 ml de cada extracto con 1 ml de ácido acético glacial que contenía una gota de solución de cloruro férrico al 1%. A cada mezcla se adicionó cuidadosamente por las paredes del tubo de ensayo 1 ml de ácido sulfúrico concentrado (H₂SO₄). La presencia de desoxiazúcares característicos de los compuestos cardiotónicos se observaron por la formación de un anillo pardo en la interfase junto a un anillo púrpura.

Flobataninos: se mezcló 1 ml de cada extracto con una solución de ácido clorhídrico (HCl) al 2% y se calentó a 100ºC. La presencia de flobataninos se determinó por la formación de un precipitado rojo.

Esteroides: se mezcló 1 ml de cada extracto con 3 ml de cloroformo (CHCl₃) y se agitó la mezcla. Posteriormente se adicionaron cuidadosamente 2 ml de H₂SO₄ concentrado por los lados del tubo de ensayo. La formación de un color rojo en la capa superior y una coloración verde en la capa de H₂SO₄ indicó la presencia de esteroides en el extracto.

Emodinas: se mezcló 1 ml de cada extracto con 1 ml de hidróxido de amonio (NH₄OH) y 2 ml de benceno. La formación de una coloración roja indicó la presencia de emodinas.

Cumarinas: se mezcló 1 ml de cada extracto con 1 ml de hidróxido de sodio (NaOH) al 10%. La formación de una coloración amarilla indicó la presencia de cumarinas en el extracto.

La presencia de los metabolitos se determinó de manera cualitativa a través del sistema no paramétrico de cruces (MINSAP, 1997). Presencia: +++= abundante; ++= moderado; += bajo y - = ausencia.

La determinación cualitativa de los metabolitos secundarios y las lecturas de absorbancia para las cuantificaciones bioquímicas se realizaron por triplicado.

La actividad antimicrobiana in vitro de los extractos se evaluó frente a dos bacterias de referencia (Staphylococcus aureus ATCC 25923 y Escherichia coli ATCC 25922), así como cepas salvajes aisladas e identificadas previamente, presentes en fluidos de ubres de vacas con mastitis: S. aureus, S. epidermidis (Gram positivas), E. coli y Klebsiella pneumoniae (Gram negativas). El ensayo se realizó mediante la técnica de difusión en pocillos (Pérez et al., 1990).

Las cepas bacterianas fueron resembradas previamente sobre medio Agar Cerebro de Corazón a 37°C. Se inoculó el medio Agar Mueller-Hinton con células de turbidez equivalente al tubo 0.5 de la escala de Mc Farland con el uso de un hisopo estéril. Los pocillos se realizaron con la ayuda de un oradador estéril de 8 mm de diámetro y se les adicionaron 150 µL de cada extracto (100 mg.ml^-1). Las placas fueron incubadas toda la noche a 37°C. Como control positivo se utilizó la tetraciclina (45 μg) y como control negativo la solución hidroalcohólica. La actividad antibacteriana se obtuvo a partir del diámetro de la zona de inhibición del crecimiento bacteriano. Se realizaron tres réplicas por cada extracto evaluado (Parekh y Chanda, 2006).

Los ensayos de actividades antibacteriana se realizaron mediante un diseño completamente aleatorizado. Los datos correspondientes a los análisis bioquímicos cuantitativos y a la actividad antibacteriana fueron procesados con el paquete SPSS versión 15.0 para Windows. Se determinó el ajuste de los datos a una distribución normal mediante la prueba de Bondad de Ajuste Kolmogorov-Smirnov y la Homogeneidad de Varianza mediante las Pruebas de Bartlett (Sigarroa, 1985). En caso de que los datos cumplieran los requisitos exigidos fueron procesados mediante ANOVA de clasificación simple y se realizó la Prueba de Rangos Múltiples de Tukey HSD para la comparación entre las medias. Los datos que no cumplieron con estas premisas fueron analizados mediante la Prueba de Kruskal-Wallis y la Prueba de Rangos Múltiples de Student-Newman-Kwels (SNK).

Los resultados de la actividad antimicrobiana muestran un efecto antibacteriano de los extractos de hojas y raíces de Piper auritum, contra las diferentes bacterias Gram positivas y Gram negativas que se enfrentaron (cuadro 3). La actividad antibacteriana ante las cepas de referencias fue mayor que la observada frente a las cepas salvajes. Además, la inhibición de S. aureus resultó mayor en comparación a los valores obtenidos con E. coli. Tanto el extracto de hoja como de raíz mostraron una actividad inhibitoria semejante frente a S. aureus ATCC 25923, S. aureus (salvaje), E. coli ATCC 25922 y E. coli (salvaje); sin embargo, frente a S. epidermidis y K. pneumoniae, solamente el extracto de hojas mostró efectividad, aunque estadísticamente los resultados fueron inferiores al control.

Al comparar la inhibición del crecimiento de las cepas Gram positivas y Gram negativas frente a los extractos utilizados, se observó una mayor actividad antibacteriana frente a las bacterias Gram positivas.

Cuadro 3
Actividad antibacteriana de extractos etanólicos de hojas y raíces de Piper auritum frente bacterias patógenas Gram positivas y Gram negativas.

DZI: diámetro de la zona de inhibición. Los datos representan medias de tres réplicas. Letras diferentes indican diferencia significativa según Test de Tukey HSD (P≤0.05).

La actividad antibacteriana encontrada en los extractos de hojas y raíces de P. auritum, puede estar relacionada con la presencia de determinados metabolitos secundarios identificados en las pruebas bioquímicas, como los flavonoides, los terpenos y los taninos, a los cuales se les atribuyó actividades antimicrobianas (Reena et al., 2012).

En estudios realizados por Rojas et al. (2014) se observó una actividad antibacteriana contra Pectobacterium carotovorum, la cual fue asociada con la presencia de monoterpenos, los que pueden provocar daños estructurales y funcionales a las membranas lipídicas. Estos metabolitos interactúan con proteínas de membrana e inducen cambios en la polaridad de esta estructura, lo que provoca la liberación de material intracelular de las bacterias (Hyldgaard et al., 2012; Rajendran et al., 2014).

Los taninos pueden reaccionar con proteínas ricas en prolina para formar complejos irreversibles que provocan la inhibición de la síntesis de proteínas, de ahí que estos compuestos posean actividad antibacteriana. Las plantas que presentan taninos como componente astringente principal, se utilizan para el tratamiento de desórdenes intestinales como diarreas y disenterías (Vu et al., 2017).

La actividad inhibitoria inferior de los extractos frente a las cepas Gram negativas, pudo estar relacionada con la mayor complejidad que presentan las paredes celulares de estas bacterias Gram negativas en comparación con las Gram positivas. Las primeras poseen, además de la capa de peptidoglicano, una capa de lipopolisacáridos que puede constituir un obstáculo para la entrada de metabolitos secundarios de peso molecular elevado hacia el interior de la célula, los cuales son asociados con la acción antibacteriana (Madigan et al., 2015).

Trabajos similares sobre evaluación de la actividad antibacteriana contra bacterias asociadas con la mastitis, evidenciaron un uso potencial de los extractos vegetales para el control de dicha enfermedad (Toribio et al., 2009; Voigt et al., 2013). A pesar de haber obtenido resultados positivos con relación al efecto antibacteriano de los extractos contra cepas asociadas a mastitis, es importante realizar estudios in vivo para determinar la efectividad del producto. En un trabajo similar realizado por Leal (2014) con extractos de diferentes especies vegetales para el control de la mastitis, se observó un efecto bactericida frente a Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae y Escherichia coli; sin embargo, cuando se realizó la aplicación de los biopreparados (extractos vegetales y propilenglicol como vehículo) a los animales afectados con mastitis, los resultados obtenidos por estos autores no fueron los esperados y se observaron reacciones adversas.

Los ensayos antibacterianos realizados en la presente investigación demuestran el uso potencial de Piper auritum, como fuente de agentes terapéuticos naturales para combatir infecciones de origen bacteriano. Las propiedades antibacterianas de los extractos de hojas de Piper auritum contra cepas bacterianas salvajes aisladas de vaca con mastitis, indican la posibilidad de utilizar estos extractos para el control y prevención de esta enfermedad común en el ganado bovino, aunque se requieren de ensayos posteriores in vivo.