Artículo científico
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Recepción: 18 Mayo 2018
Aprobación: 21 Septiembre 2018
Resumen: El objetivo fue evaluar el efecto de dos métodos de extracción de semen: vagina artificial (va) y electroeyaculador (eey), en la calidad espermática y del eyaculado de toros Sahiwal. Se analizaron el volumen del semen fresco (Vs, mL); pH; motilidad masal (Mm, %); concentración (Ce, 106 Spz/mL); viabilidad (Imp, %); vitalidad (Ve, %); normalidad (Ne, %) e integridad del acrosoma (Ia, %). Se realizaron 48 colectas (igual número por grupo experimental), dos veces/ semana, de ocho sementales (edad: 24.54 ±0.67 meses, peso: 482.33 ±38.88 kg y circunferencia escrotal: 32.54 ±3.22 cm). Los toros se alimentaron con base de pastos, con libre acceso al agua y sales minerales. Con va se obtuvieron los resultados siguientes: Vs=4.28 mL, pH=7.02, Mm=84.17 %, Ce=928.71 Spz/mL, Imp=58.36 %, Ve=76.35 %, Ne=86.38 %, Ia=93.95 %. Con el método de extracción por eey se obtuvieron los siguientes resultados: Vs=3.98 mL, pH=7.02, Mm=92.29 %, Ce=714.68 Spz/mL, Imp=41.78 %, Ve=74.65 %, Ne=85.25 %, Ia=94.21 %. Se demostró que el método de extracción del semen afectó la calidad espermática de los toros Sahiwal donde la mayor Mm se obtuvo por eey mientras Ce y Imp fueron mayores por extracción con va, sin diferencias en el resto de los indicadores.
Palabras clave: Concentración espermática, electroeyaculador, motilidad masal espermática, vagina artificial, viabilidad espermática.
Abstract: The objective was to evaluate the effect of two methods of extraction of semen: artificial vagina (va) and electroejaculator (eey) in the sperm quality and ejaculation of Sahiwal bull. Fresh semen volume (Vs, mL), pH, mass motility (Mm, %), concentration (Ce, 106 Spz/mL), viability (Imp, %), vitality (Ve, %), normality (Ne, %), and integrity of the acrosome (Ia, %) were analyzed. There were 48 collections (equal number per experimental group), two times/ week, of eight stallions (age: 24.54 ± 0.67 months, weight: 482.33 ±38.88 kg and scrotal circumference: 32.54 ±3.22 cm). The bulls were fed on grass, with free access to water and mineral sales. With va the following results were obtained: Vs=4.28 mL, pH=7.02, Mm=84.17 %, Ce=928.71 Spz/mL, Imp=58.36 %, Ve=76.35 %, Ne=86.38 %, Ia=93.95 %. With the extraction method by eey the following results were obtained: Vs=3.98 mL, pH=7.02, Mm=92.29 %, Ce=714.68 Spz/mL, Imp=41.78 %, Ve=74.65 %, Ne=85.25 %, Ia=94.21 %. It was demonstrated that the semen extraction method affected the sperm quality of the Sahiwal bulls where, the highest Mm was obtained by eey while, Ce and Imp were higher by extraction with va, without differences in the rest of the indicators.
Keywords: Sperm concentration, electroejaculator, mass motility sperm, artificial vagina, sperm viabilit.
Introducción
Sahiwal, pertenece al tronco genético Bos indicus, deriva de la raza Shindi y se considera emparentada con los bovinos de Afganistán mestizos, con la raza Gyr, y una de las mejores razas lecheras de India. Se originó en la frontera entre India y Paquistán, cerca del río Ravi, en una región con un clima sub-tropical árido (Carrera et al., 2015). La evaluación del eyaculado en los sementales del tronco Bosindicus es una necesidad para los países tropicales en desarrollo, porque permite disponer de un semen de machos probados, con alto valor genético y libres de infecciones de transmisión sexual, como garantía para el progreso productivo de los rebaños y la adaptación al medio ambiente tropical. La recolección de semen por vagina artificial o electro-eyaculación, ha permitido el establecimiento de bancos de germoplasmas de toros seleccionados (Benítez et al., 2018). Sin embargo, existen diferentes criterios respecto al método de colecta del semen y calidad. Según las investigaciones de Parvanov (2000) y Persson (2007), el método de extracción, por vagina artificial o electroeyaculador, afecta la calidad del eyaculado. Sin embargo, en los trabajos de Posada (2014) y Bopape et al. (2015), no se encontraron diferencias entre ambos métodos. El objetivo de esta investigación fue evaluar la calidad espermática del eyaculado de toros Sahiwal, con la extracción del semen por vagina artificial y por electroeyaculador.
Materiales y métodos
Localización
La investigación se realizó en la hacienda “Zoila Luz”, Santo Domingo de los Tsáchilas, Ecuador, 00º14’ de latitud S y 79º12’ longitud O, a 557 m.s.n.m, 23.50 °C de temperatura promedio anual, 87 % de humedad relativa, 2,728.50 mm de precipitación promedio anual, 660 horas de radiación solar anual y en un suelo arcilloso (dac, 2012). Los análisis del semen colectado por ocho semanas se realizaron en el laboratorio de biotecnología animal del Instituto Agropecuario Superior Andino (iasa II) y en el laboratorio de biotecnología de la Universidad de las Fuerzas Armadas (espe), valle Los Chillos.
Animales
Se utilizaron ocho toros Sahiwal seleccionados como sementales en la hacienda. La edad de los animales fue de 24.54 ±0.67 meses, el peso vivo de 482.33 ±38.88 kg y la circunferencia escrotal de 32.54 ±3.22 cm. Los animales pastaron de 7:00-18:00, en un área de Brachiaria decumbens. El pasto no se regó y se fertilizó con 20 t de materia orgánica por ha, dos veces al año. El tiempo de ocupación del pastizal fue de siete días y 21 días de reposo. Se alojaron en corrales con piso de cemento, en horario nocturno. Tuvieron acceso a agua y sal mineral a voluntad, las 24 horas. El corte de vellos del prepucio se realizó cada 15 días. Los toros se vacunaron contra carbunco sintomático, edema maligno, septicemia sintomática y fiebre aftosa, semestralmente. El baño contra parásitos externos se realizó con Cipermetina Carval (1 mL/L, con 4 L/animal), por mochila de aspersión y se aplicó Dectomax 1 % Pfizer (1 mL/50 kg de peso vivo, cada dos meses). Se enviaron muestras de eyaculado al laboratorio veterinario VETELAB Machachi, para detectar las infecciones de transmisión sexual siguientes: Brucella abortus (por la prueba de Rosa de Bengala), leucosis bovina (por Elisa indirecta), rinotraqueitis infecciosa bovina (por inmunofluorescencia indirecta), diarrea viral bovina (por inmunofluorescencia indirecta) y Leptospira interrogans (por microaglutinación).
Procedimiento experimental
Se lavó el vientre y prepucio con agua y jabón, y se secó antes de la colecta. Extracción por vagina artificial: la excitación se realizó en un cepo, con una vaca maniquí. Se colocó la vagina artificial en el pene desviado hacia el lado derecho y se esperó el golpe de riñón, para retirar la vagina. Se extrajo el tubo con el semen de la vagina artificial.
Extracción por electroeyaculador Standard Precision Electronics: se ató el animal, se vació el recto e introdujo el vástago del eyaculador. El electroeyaculador se colocó en automático y desplazó el vástago hacia adelante y hacia atrás, lentamente. Se dejó escapar el líquido pre-eyaculatorio.
En ambos métodos se protegió el semen del sol y se llevó al laboratorio para el análisis, en los tubos colectores graduados Pirec de 15 mL.
Mediciones y muestreos
Se realizaron dos extracciones por animal en la semana, en 84 días totales, en las horas frescas de la mañana, para un total de 48 colectas (24 por cada vagina artificial y los otros 24 por electroeyaculador) y se analizaron las variables siguientes:
• Volumen del semen fresco (Vs, en mL). Se determinó en el tubo colector graduado. Luego de la medición, se colocaron los tubos en baño termostático, a 37 °C (Ruíz et al., 2010).
• Medición de pH. Se introdujo la sonda del peachímetro portátil (Boeco PT70) en la muestra por 10 segundos.
• Motilidad masal (Mm, en %). Se utilizó una gota de semen fresco en un portaobjeto que se mantuvo a 37°C, por una placa térmica y se visualizó la muestra a 10x, en un microscopio óptico (CX21, Olympus). Se evaluó la formación y progresión de los movimientos de la masa espermática y se clasificó (subjetivamente) de la forma siguiente (León et al., 1991): (a) mala, de 0-25 % de la masa espermática en movimiento sólo con vibraciones; (b) regular, 25-50 % con oscilaciones; (c) buena, 50-75 % con remolinos lentos; y (d) muy buena, 75-100 % con remolinos rápidos.
• Concentración espermática (Ce, en miles de millones de Spz/mL). Se midió por un espectrofotómetro digital (Spermacue®, Minitub) calibrado para bovinos.
• Viabilidad espermática (Imp, en %). Se utilizó la prueba de integridad de la membrana plasmática (Host formol-citrato: 3.40 g de citrato de sodio, 0.5 mL de formol y 100 mL de agua ultra purificada (Andrade, 2005), con el procedimiento de Alberio et al. (2010) y Cisale et al. (2006), por el procedimiento siguiente: (a). Se colocó 1 mL de solución hipo-osmótica (con los ingredientes citados por Andrade, 2005): 490 mg de citrato de sodio, 900 mg de fructosa, 100 mL de agua ultra purificada y el procedimiento de Cisale et al. (2006) en los tubos Eppendorf; (b). Se colocaron los tubos a 37°C en baño de María; (c). Se agregó 25 μL de semen y se mantuvo a 37 °C, por 10 min; (d). Se adicionaron 5 μL de solución Host-formol (200 μL a uno); (e). Se extendió la muestra sobre un portaobjetos, se secó al aire y se observó en el microscopio con contraste de fase con el lente de 40x; y (f). Se contaron 200 células. Se consideraron positivos los espermatozoides con cualquier grado de torsión helicoidal de la cola “Swellin”.
• Vitalidad espermática (Ve, en %). Es el recuento de espermatozoides vivos en los eyaculados colectados. Se adicionó una gota de 5 µL del colorante eosina, precalentado a 37 °C en el borde de un portaobjetos. Sobre esta gota se añadió otra del semen y se extendió con un portaobjetos, en un ángulo de 30-40°. Se secó al aire rápidamente y se observaron 200 células por microscopio óptico (CX21, Olympus), a 1000x, con aceite de inmersión. Si el espermatozoide se encuentra muerto, la membrana plasmática permite el paso de la eosina (Muñoz y Muñoz, 2005).
• Normalidad espermática (Ne, en %). Se utilizó la tinción metacromática Spermac (Stain Enterprises) para evaluar la morfología espermática. Se siguió el protocolo Industrie Park Noord 32, 8730 por tinción de frotis de semen fresco diluido (se utilizó diluyente Andromed Minitube, con su protocolo adjunto) en portaobjetos. Se utilizó el fijador del kit, con base de formalina, por 5 min. Se dejó secar el frotis y se utilizaron los tres colorantes del kit (A, B y C). El A (rojo) se dejó por 2 min; y el B (amarillo) y C (verde) por 1 min. Luego se enjuagaron con agua corriente y la membrana quedó teñida de verde. Se dejó secar y observó al microscópico óptico, a 400x, con aceite de inmersión. Se contaron 200 espermatozoides y subdividieron porcentajes con forma normal y anormal.
• Integridad del acrosoma (Ia, %). Se utilizó la tinción de Spermac, para observar la morfología espermática e integridad de la membrana del acrosoma, por un procedimiento similar al de la normalidad espermática (medición número seis), para teñir el acrosoma de verde, el post-acrosoma de rojo y la membrana verde. La lámina se observó al microscopio de luz, a 400x, con aceite de inmersión. Se contaron 200 espermatozoides por campo. Se clasificaron en normales (con el acrosoma intacto) y los que reaccionaron (con el acrosoma dañado que se coloreó de rojo y/o con la membrana discontinua o difusa).
Diseño, grupos experimentales y análisis estadístico
Se utilizó un diseño crossover. Este diseño permitió eliminar el error experimental, por efecto de la diferencia del valor genético propio del semental y evaluar exclusivamente, el efecto del método de extracción de semen. Los ocho toros se distribuyeron al azar, con dos grupos experimentales (extracción por vagina artificial o por electro-eyaculador), cuatro animales por grupo. Los datos se analizaron por el software sas (Statistical Analysis System), versión 9.3 (2013), para evaluar los estadígrafos descriptivos. Se utilizó la prueba de Tukey, para la comparación de las medias, en el análisis de varianza simple (ANOVA), al 95 % de confianza (α=0.05).
Resultados
La motilidad masal fue superior con el método de extracción del semen por electro-eyaculación (92.29 %). Sin embargo, la concentración espermática (928.71 x 106 Spz/mL) y la viabilidad espermática (58.36 %) fueron superiores en la colecta por el método de la vagina artificial (P ≤0.05). No se encontraron diferencias en el resto de los indicadores que se evaluaron en el estudio (cuadro 1).
Indicadores del eyaculado y la calidad espermática de toros Sahiwal, con extracción de semen por el método de vagina artificial o por electro-eyaculador.
EE: Error estándar de la media estadística; P: Probabilidad (Prueba de Tukey con α=0.05).
Discusión
El volumen seminal no se afectó por el método de extracción. Posada (2014) no halló diferencias en el volumen (11.42 mL por va y 12.75 mL por eey). Este indicador es uno de los más variables, pero se controlaron las fuentes de variación como la raza, edad, peso vivo, sistema de alimentación y manejo. Sin embargo, Austin et al. (1961) y Parvanov (2000) encontraron diferencias en el volumen por ambos métodos. Bopape et al. (2015) reportaron igual comportamiento de pH neutro para ambos métodos (va: 7.20 y eey: 6.90), al igual que Palmer (2005) y León et al. (1991), 7 para va y 6.96 para eey. Sin embargo, Austin et al. (1961) encontró diferencias, con 6.70 para va y 7.30 para eey.
La estimulación eléctrica aumentó la motilidad masal de los espermatozoides, como lo informaron también León et al. (1991) y Persson (2007), con valores de 77 y 60 % para la extracción por va, y 75 y 57 % en la extracción por eey. La concentración espermática fue superior en la extracción por va. Este resultado fue similar a los reportes de Austin et al. (1961) y Persson (2007), con 625 y 1800 x 106 Spz/mL, por el método de va y 293 y 718 x 106 Spz/mL, por la eey. Ahmad et al. (2011) y Kumar et al. (2015) informaron una concentración espermática para Sahiwal de 1.10 y 1.13 x 109 Spz/mL en toros Sahiwal. Estos resultados pueden deberse a la mayor descarga de plasma seminal que ocurre por electro-estimulación de las vesículas seminales en el método de extracción por electro-eyaculador.
La viabilidad espermática fue superior en la extracción por va, como ocurrió en los trabajos de Sarsaifi et al. (2015), con 65.80 % por va y 62.86 % por eey. Según, Farroq et al. (2015) y Kumar et al. (2015), los valores aceptados de viabilidad espermática para Sahiwal están entre 58.00-63.15 %. La menor viabilidad de espermatozoides en la colecta por eey puede deberse a la eyaculación de células sexuales inmaduras y al gasto energético adicional que condiciona el estímulo eléctrico del eyaculador, por aumento de la movilidad masal. El método de extracción de semen no afectó la vitalidad espermática. Este valor fue similar al que obtuvo Jimenez-Rabádan (2014), con 79.02 %, para va y 79.70 %, para eey. Al respecto, Sattar y Riaz (2002) informaron que la vitalidad espermática para Sahiwal fue del 76.02 % y Farroq et al. (2015) del 78.60 %.
La normalidad espermática fue similar en ambos métodos, como lo presentaron Posada (2014) con 75.25 % en va y 73.30 % eey. Sin embargo, Persson (2007) encontró menor valor para va (76.80 %), respecto al eey (94 %). Sattar y Riaz (2002) y Farroq et al. (2013) determinaron que 74.13 y 86.97 % son valores aceptables para este indicador en Sahiwal. La integridad del acrosoma no se afectó por el método de extracción. Sus valores fueron superiores a los que informaron Sarsaifi et al. (2015), con 65.80 % para va y 62.86 % para eey. Sajjad et al. (2010) reportaron 70.70 % de integridad del acrosoma. Sin embargo, Kumar et al. (2015) reportaron valores más altos, del 89.99 %, ambos para toros Sahiwal. En general, existen discrepancias, en cuanto al mejor método de extracción, ya que resulta más fácil el trabajo con el eey. Sin embargo, los resultados en múltiples indicadores de la calidad del semen resultan superiores con va.
Conclusiones
Se demostró que la calidad espermática de los toros Sahiwal fue buena, con un aumento de la motilidad masal por electro-eyaculador; la concentración y viabilidad espermática fueron mayores por vagina artificial, sin diferencias en el volumen, pH, vitalidad, normalidad e integridad del acrosoma.
Literatura citada
Ahmad, E.; Ahmad, N.; Naseer, Z.; Khan, M.; Ashig, M.; and Younis, M. (2011). Relationship of age to body weighh, scrotal circumference, testicular ultra-sonograms and semen quality in Sahiwal bulls. Tropical Animal Heath Production 43(1): 159-164.
Alberio, R.; Aller, J.; Hozbor, F.; Kaiser, G.; Manes, J.; Mucci, N. y Rios, G. (2010). Fisiología de la reproducción. En: Proyecto 2009-2012. INTA, Balcarze, Buenos Aires, Argentina. http://inta.gob.ar/ proyectos/AESA-203931 (Consultada el 15 abril de 2018).
Andrade, A. (2005). Influencia en la calidad espermática de la adición de distintas concentraciones de crio-protectores. Tesis de doctorado. Universidad Complutense de Madrid, España.
Austin, J.; Hupp, E.; and Muephee, R. (1961). Effect of scrotal insulation on semen of Hereford bulls. Journal of Animal Science 20: 307-311.
Benítez, E.; Chamba, H.; Sánchez, E; Luzón, F.; Sánchez, J. (2018). Evaluación comparativa de dos métodos de recuperación espermática de epidídimos bovinos post-mortem. Abanico Veterinario 8(1): 59-74
Bopape, M.; Knoboso, C.; Tlou, C.; and Tshimangadzo, L. (2015). Comparation of Electro ejaculator and Artificial Vagina on Semen Collection from South African Indigenous Goat Folloeing Assessment by Computer Aided Sperm Analysis. Open Journal of Animal Sciences 5: 210-218.
Carrera, F; Ulloa, S.; Uday, M.; Zapata, J.; Veintimilla, F.; Valdivieso, F. y Gómez, G. (2015). Efecto de la suplementación mineral y la época del año sobre la calidad seminal de toros cruza Sahiwal en el trópico húmedo. Memorias del III Congreso REDU. Escuela Politécnica Nacional. Ecuador. 29 p.
Cisale, H.; Piehl. L.; Torres, N.; and Hager, A. (2006). Biochemical characterization and membrane fluidity of membrane isolated from boar seminal plasma. Animal Reproduction Science 92(3-4): 401-10.
DAC. (Dirección de la Aviación Civil) (2012). Reporte de caracterización climática de la provincia de Santo Domingo de los Tsáchilas. Estación climática del aeropuerto de Santo Domingo de los Tsáchilas, Ecuador. 8 p.
Farroq, U.; Ijaz, A.; Ahmad, N.; Rehman, H.; and Zaneb, H. (2013). Investigations on semen quality and freezability of cholistani breeding bulls - A preliminary study from cholistan desert of Pakistan. The journal of animal and plant sciences 23(2): 359-363.
Farroq, U.; Mahmood, S.; Ahmad, I.; Ahmad, N.; Idris, M.; and Abbas, M. (2015). Evaluation of post thaw sperm parameters and fertility of cholistani service bulls. Turk. J. Vet. Anim. Sci. 39: 472-479.
Jimenez-Rabádan, M. (2014). Advances in sperm cryopreservation of samples collected by artificial vagina and electro-ejaculation from Blanca celiberica goad breed. Tesis de doctorado. INIA, Universidad de Castilla La Mancha. Albacete, España.
Kumar, A.; Grupta, A.; Chakravarty, A.; and Singh, P. (2015). Sexual behavoir and its relationship with semen quality parameters in Sahiwal breeding bulls. Veterinary World 8(6): 745-749.
León, H.; Porras, A.; Galina, C.; and Navarro, F. (1991). Effect of the collection method on semen characteristics of Zebu and European type cattle in the tropics. Theriogenology 36(3): 349-55.
Muñoz, O. y Muñoz, G. (2005). Cómo mejorar la colección, manejo y calidad microbiológica del semen. Manual de ganadería doble propósito. Pp. 19-25. http://www.avpa.ula.ve/docuPDFs/libros_online/ manual-ganaderia/seccion6/articulo19-s6.pdf (Consultada el 19 febrero de 2018).
Palmer, C. (2005). Welfare aspects of theriogenology: investigating alternatives to electro-ejaculation of bulls. Theriogenology 64(3): 469-479.
Parvanov, P. (2000). Study on the effect of method of bull semen collection upon several qualitative parameters of fresh and after trawling of semen. Bulgarian Journal Agric. Sci. 6: 233-237.
Persson, Y. (2007). Breeding soundness evaluation of young beef bulls. Doctoral thesis. Uppsala University, Uppsala, Sweden.
Posada, R. (2014). Estudio de la calidad del toro de lidia fragmentación del ADN espermático. Tesis de doctorado. Universidad Complutense de Madrid, España.
Ruíz, B.; Ruiz, H.; Mendoza, P.; Oliva, M.; Gutiérrez, F.; Rojas, R.; Herrera, J.; Ruíz, D.; Aguilar G.; León, H.; Bautista, G.; Ruíz, A.; Ibarra, C. y Villalobos, A. (2010). Caracterización reproductiva de toros Bos taurus y Bos indicus y sus cruzas en un sistema de monta natural y sin reposo sexual en el trópico Mexicano. Rev. Científica UDO Agrícola 10(1): 94-102.
Sajjad, M.; Allah, B.; and Akhter, S. (2010). Effect of L-Cysteine in extender on post-thaw quality of Sahiwal bull semen. Pakistan journal of zoology 29(3): 197-203.
Sarsaifi, K.; Vejayan, J.; Haron, A.; Yusoff, R.; Hani, H.; Rasoli, M.; Mohamed, A.; and Mazni, A. (2015). Protein profile and functionality of spermatozoa from two semen collection methods in Bali bulls. Livestock science 172: 96-105.
SAS. (2013). User’s guide: Statistics. V.9.3. De SAS Institute. INC. Cary. N.C. USA.
Sattar, A. and Riaz, H. (2002). Comparison of semen characteristic of reciprocal crossbred bulls of Friesien x Sahiwal origens. Int. J. Agri. Biol. 4(4): 474-475.
Apéndices
Título: Semental Sahiwal
Autor: Marisol Herrera Sosa
Técnica: Acuarela
Medidas: 21 cm x 14 cm
