La investigación se realizó en la hacienda “Zoila Luz”, Santo Domingo de los Tsáchilas, Ecuador, 00º14’ de latitud S y 79º12’ longitud O, a 557 m.s.n.m, 23.50 °C de temperatura promedio anual, 87 % de humedad relativa, 2,728.50 mm de precipitación promedio anual, 660 horas de radiación solar anual y en un suelo arcilloso (dac, 2012). Los análisis del semen colectado por ocho semanas se realizaron en el laboratorio de biotecnología animal del Instituto Agropecuario Superior Andino (iasa II) y en el laboratorio de biotecnología de la Universidad de las Fuerzas Armadas (espe), valle Los Chillos.

Se utilizaron ocho toros Sahiwal seleccionados como sementales en la hacienda. La edad de los animales fue de 24.54 ±0.67 meses, el peso vivo de 482.33 ±38.88 kg y la circunferencia escrotal de 32.54 ±3.22 cm. Los animales pastaron de 7:00-18:00, en un área de Brachiaria decumbens. El pasto no se regó y se fertilizó con 20 t de materia orgánica por ha, dos veces al año. El tiempo de ocupación del pastizal fue de siete días y 21 días de reposo. Se alojaron en corrales con piso de cemento, en horario nocturno. Tuvieron acceso a agua y sal mineral a voluntad, las 24 horas. El corte de vellos del prepucio se realizó cada 15 días. Los toros se vacunaron contra carbunco sintomático, edema maligno, septicemia sintomática y fiebre aftosa, semestralmente. El baño contra parásitos externos se realizó con Cipermetina Carval (1 mL/L, con 4 L/animal), por mochila de aspersión y se aplicó Dectomax 1 % Pfizer (1 mL/50 kg de peso vivo, cada dos meses). Se enviaron muestras de eyaculado al laboratorio veterinario VETELAB Machachi, para detectar las infecciones de transmisión sexual siguientes: Brucella abortus (por la prueba de Rosa de Bengala), leucosis bovina (por Elisa indirecta), rinotraqueitis infecciosa bovina (por inmunofluorescencia indirecta), diarrea viral bovina (por inmunofluorescencia indirecta) y Leptospira interrogans (por microaglutinación).

Se lavó el vientre y prepucio con agua y jabón, y se secó antes de la colecta. Extracción por vagina artificial: la excitación se realizó en un cepo, con una vaca maniquí. Se colocó la vagina artificial en el pene desviado hacia el lado derecho y se esperó el golpe de riñón, para retirar la vagina. Se extrajo el tubo con el semen de la vagina artificial.

Extracción por electroeyaculador Standard Precision Electronics: se ató el animal, se vació el recto e introdujo el vástago del eyaculador. El electroeyaculador se colocó en automático y desplazó el vástago hacia adelante y hacia atrás, lentamente. Se dejó escapar el líquido pre-eyaculatorio.

En ambos métodos se protegió el semen del sol y se llevó al laboratorio para el análisis, en los tubos colectores graduados Pirec de 15 mL.

Se realizaron dos extracciones por animal en la semana, en 84 días totales, en las horas frescas de la mañana, para un total de 48 colectas (24 por cada vagina artificial y los otros 24 por electroeyaculador) y se analizaron las variables siguientes:

• Volumen del semen fresco (Vs, en mL). Se determinó en el tubo colector graduado. Luego de la medición, se colocaron los tubos en baño termostático, a 37 °C (Ruíz et al., 2010).

• Medición de pH. Se introdujo la sonda del peachímetro portátil (Boeco PT70) en la muestra por 10 segundos.

• Motilidad masal (Mm, en %). Se utilizó una gota de semen fresco en un portaobjeto que se mantuvo a 37°C, por una placa térmica y se visualizó la muestra a 10x, en un microscopio óptico (CX21, Olympus). Se evaluó la formación y progresión de los movimientos de la masa espermática y se clasificó (subjetivamente) de la forma siguiente (León et al., 1991): (a) mala, de 0-25 % de la masa espermática en movimiento sólo con vibraciones; (b) regular, 25-50 % con oscilaciones; (c) buena, 50-75 % con remolinos lentos; y (d) muy buena, 75-100 % con remolinos rápidos.

• Concentración espermática (Ce, en miles de millones de Spz/mL). Se midió por un espectrofotómetro digital (Spermacue®, Minitub) calibrado para bovinos.

• Viabilidad espermática (Imp, en %). Se utilizó la prueba de integridad de la membrana plasmática (Host formol-citrato: 3.40 g de citrato de sodio, 0.5 mL de formol y 100 mL de agua ultra purificada (Andrade, 2005), con el procedimiento de Alberio et al. (2010) y Cisale et al. (2006), por el procedimiento siguiente: (a). Se colocó 1 mL de solución hipo-osmótica (con los ingredientes citados por Andrade, 2005): 490 mg de citrato de sodio, 900 mg de fructosa, 100 mL de agua ultra purificada y el procedimiento de Cisale et al. (2006) en los tubos Eppendorf; (b). Se colocaron los tubos a 37°C en baño de María; (c). Se agregó 25 μL de semen y se mantuvo a 37 °C, por 10 min; (d). Se adicionaron 5 μL de solución Host-formol (200 μL a uno); (e). Se extendió la muestra sobre un portaobjetos, se secó al aire y se observó en el microscopio con contraste de fase con el lente de 40x; y (f). Se contaron 200 células. Se consideraron positivos los espermatozoides con cualquier grado de torsión helicoidal de la cola “Swellin”.

• Vitalidad espermática (Ve, en %). Es el recuento de espermatozoides vivos en los eyaculados colectados. Se adicionó una gota de 5 µL del colorante eosina, precalentado a 37 °C en el borde de un portaobjetos. Sobre esta gota se añadió otra del semen y se extendió con un portaobjetos, en un ángulo de 30-40°. Se secó al aire rápidamente y se observaron 200 células por microscopio óptico (CX21, Olympus), a 1000x, con aceite de inmersión. Si el espermatozoide se encuentra muerto, la membrana plasmática permite el paso de la eosina (Muñoz y Muñoz, 2005).

• Normalidad espermática (Ne, en %). Se utilizó la tinción metacromática Spermac (Stain Enterprises) para evaluar la morfología espermática. Se siguió el protocolo Industrie Park Noord 32, 8730 por tinción de frotis de semen fresco diluido (se utilizó diluyente Andromed Minitube, con su protocolo adjunto) en portaobjetos. Se utilizó el fijador del kit, con base de formalina, por 5 min. Se dejó secar el frotis y se utilizaron los tres colorantes del kit (A, B y C). El A (rojo) se dejó por 2 min; y el B (amarillo) y C (verde) por 1 min. Luego se enjuagaron con agua corriente y la membrana quedó teñida de verde. Se dejó secar y observó al microscópico óptico, a 400x, con aceite de inmersión. Se contaron 200 espermatozoides y subdividieron porcentajes con forma normal y anormal.

• Integridad del acrosoma (Ia, %). Se utilizó la tinción de Spermac, para observar la morfología espermática e integridad de la membrana del acrosoma, por un procedimiento similar al de la normalidad espermática (medición número seis), para teñir el acrosoma de verde, el post-acrosoma de rojo y la membrana verde. La lámina se observó al microscopio de luz, a 400x, con aceite de inmersión. Se contaron 200 espermatozoides por campo. Se clasificaron en normales (con el acrosoma intacto) y los que reaccionaron (con el acrosoma dañado que se coloreó de rojo y/o con la membrana discontinua o difusa).

Se utilizó un diseño crossover. Este diseño permitió eliminar el error experimental, por efecto de la diferencia del valor genético propio del semental y evaluar exclusivamente, el efecto del método de extracción de semen. Los ocho toros se distribuyeron al azar, con dos grupos experimentales (extracción por vagina artificial o por electro-eyaculador), cuatro animales por grupo. Los datos se analizaron por el software sas (Statistical Analysis System), versión 9.3 (2013), para evaluar los estadígrafos descriptivos. Se utilizó la prueba de Tukey, para la comparación de las medias, en el análisis de varianza simple (ANOVA), al 95 % de confianza (α=0.05).