Artículo científico
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Recepción: 27 Febrero 2018
Aprobación: 17 Diciembre 2018
Resumen: La linaza es una planta herbácea de la familia de las lináceas que corresponde a la semilla del lino (Linum usitatissimum L.) utilizada tradicionalmente como oleaginosa. El interés por estas semillas aumenta por el reconocimiento de algunos de sus componentes con potenciales beneficios para la salud. En este estudio se determinó la eficacia de la prueba de viabilidad de tetrazolio en semillas de L. usitatissmum. En consecuencia, se sometieron semillas de L. usitatissmum a cuatro tratamientos, los cuales consistieron en dos concentraciones (0.5 % y 1 %) y dos tiempos de exposición (24h y 48h). Posteriormente, se evaluó la tinción de las semillas con la ayuda de un microscopio estereoscopio, tomando como semillas viables las que presentaron coloración roja en el embrión, de esta forma se pudo obtener diferencias estadísticamente significativas (P ≤ 0,05: Tukey HSD) para el tratamiento T1 (0.5 %, 24h) con un 65% de semillas viables. Del mismo modo, no se observaron diferencias entre los tratamientos T2 (1 %, 24h), T3 (0.5 %, 48h) con viabilidad del 86% y T4 (1 %, 48h) con 89 % de viabilidad. En cuanto a la prueba de germinación, en promedio se obtuvo un 86 % en las cinco repeticiones con una desviación estándar de 9.63. Se concluye que la evaluación de la viabilidad en semillas de linaza mediante ensayo de tetrazolio es eficiente para las concentraciones de 1 % durante 24 y 48 horas y para 0.5 % a 48 horas de exposición.
Palabras clave: Cloruro de trifeniltetrazolio, linaza, viabilidad, germinación.
Abstract: Flaxseed is a herbaceous plant of the Linnaceae family that corresponds to the flax seed (Linum usitatissimum L.) it is traditionally used as oil-seed. The interest for these seeds increases due to the recognition of some components with the health benefits. In this study, the effectiveness of the tetrazolium viability test in L. usitatissmum seeds was determined. Consequently, seeds of L. usitatissmum were presented to four treatments, which consisted of two (0.5 % and 1 %) and two exposure times (24h and 48h). Subsequently, the duration of the seeds was evaluated with the help of a stereoscope microscope, as the viable seeds of the red coloration in the embryo, in this way statistically significant differences can be obtained (P ≤ 0.05: Tukey HSD) for the T1 treatment (0.5 %, 24h) with 65 % viable seeds. Similarly, no differences were observed between treatments T2 (1 %, 24h), T3 (0.5 %, 48h) with viability of 86 % and T4 (1 %, 48h) with 89 % of viability. In the germination test, an average of 86 % was obtained in the five replicates with a standard deviation of 9.63. Concluding that the evaluation of viability in flax seed by means of the tetrazolium assay is efficient for the responses of 1 % for 24 and 48 hours and for 0.5 % at 48 hours of exposure.
Keywords: Triphenyltetrazolium chloride, flaxseed, viability, germination.
Introducción
El género Linum hace parte de la familia Linaceae y comprende alrededor de 200 especies, las cuales presentan una amplia diversidad bioquímica y morfológica (Gul et al., 2016). El nombre del genero linum provienen del llin que significa rojo; la palabra usitatissimum proviene del latín y significa muy útil (Fonnegra, 2007). La semilla de linaza (L. usitatissimum) posee un historial extenso de consumo en Europa y Asia. Se cultiva desde por lo menos 5,000 años a.C; hoy en día se cultiva principalmente por su aceite (Liu et al., 2016). En Brasil, esta oleaginosa está siendo adicionada a diversos alimentos tales como: cereales, barras energéticas y otros productos para la alimentación (Lenzi de Almeida et al., 2008). Su origen es del mediterráneo; hasta hace un tiempo fue considerada como una oleaginosa industrial debido a sus diversos usos en alimentación, salud y su gran valor nutritivo en grasa, fibra y proteínas hacen que se despierte un interés por esta semilla en diversas industrias como lo son la de alimentos y por parte del consumidor (Cuevas y Sangronis, 2012). La linaza se reconoce como una fuente vegetal de ácidos grasos esenciales omega-3 (Soni et al., 2017; Jiménez et al., 2013), los cuales son importantes para la salud humana, además contiene diversos nutrientes como proteínas, fibras y antioxidantes como lignanos, fenoles, tocoferoles y flavonoides (Herchi et al., 2015; Zaa et al., 2012).
Las semillas son esenciales para la multiplicación de diversas especies de plantas (Victoria et al., 2006) y la calidad de estas semillas es crucial para obtener buenas cosechas (Ávila-Marioni et al., 2012). Existen especies que requieren mayor investigación pues poseen características importantes para el bienestar de los seres humanos (Victoria et al., 2006), tal es el caso de la linaza, por ello resulta apropiado realizar estudios con el objetivo de optimizar la producción.
La viabilidad de semillas es comúnmente evaluada utilizando el test de tetrazolio (Vudala y Ribas, 2017). En donde, esta se implementa en una gran variedad de especies (Salazar y Botello, 2018; Pereira et al., 2017; Sarmento et al., 2013; Salazar, 2012), debido a que se requiere muy poco tiempo para la identificación de las semillas viables y no viables (Scherwinski et al., 2010). A través del tiempo se enfatiza en obtener mejores resultados a la hora de cultivar para obtener los mayores índices de cosecha posibles. El test de Tetrazolio es un identificador funcional a la hora de la determinación de la viabilidad de las semillas (Salazar y Cancino, 2012; Salazar et al., 2013). De acuerdo a lo anterior, el test de tetrazolio es uno de los más utilizados por investigadores con el propósito de evaluar la viabilidad de las semillas de cualquier especie (Hosomi et al., 2012). Esta prueba se basa en la actividad de las enzimas hidrolasas, particularmente deshidrogenasas del ácido málico que reduce la sal de tetrazolio a formazan en los tejidos viables de las semillas (Prieto et al., 2015). De acuerdo con lo anterior, la solución de tetrazolio debido a la reducción causa coloración rojiza en los tejidos vivos de la semilla (embrión) lo cual indica que la semilla es viable, los tejidos muertos (no viables) no reaccionan con la solución conservando su color natural (Lazarotto et al., 2011). También, son varios los factores que interfieren con el test del tetrazolio, especialmente aquellos relacionados con la metodología como la preparación de las semillas (Pereira et al., 2017).
El periodo en el cual la semilla está inmersa en la solución de tetrazolio posee una influencia en los resultados, pues el exceso del tiempo de contacto del embrión con la solución puede resultar en una coloración incluso si las semillas no son viables (Pereira et al., 2017; Sarmento et al., 2013). Por otra parte, para confirmar la actividad de la prueba del Tetrazolio es necesario que se realicen ensayos de germinación que permiten evaluar el poder germinativo y reconocer el valor potencial para la siembra en campo (Rodriguez y Redman, 2008). El presente estudio evalúa la viabilidad de las semillas de L. ussitassimum utilizando la prueba de tetrazolio con diferentes concentraciones y tiempos de exposición, además su comparación con la prueba de germinación.
Materiales y métodos
Material vegetal
Las semillas de linaza (Linum usitatissimum), se adquirieron en zonas de cultivo en el sector el “Morro” de la ciudad de Mérida, Venezuela en agosto del 2017. Posteriormente se almacenaron en sobres de papel kraft a 25 ± 2 °C y humedad relativa del 60 %. El estudio se realizó en las instalaciones de la Universidad Francisco de Paula Santander, en el laboratorio de fisiología vegetal ubicado en la Facultad de Ciencias Agrarias y del Ambiente.
Viabilidad de semillas
Para estudiar óptimamente la viabilidad de las semillas de linaza, se realizó un corte longitudinal a las semillas y la testa se retiró para exponer el embrión a la solución de tetrazolio (figura 1). Las semillas fueron evaluadas según las categorías de tinción determinadas por Maldonado-Peralta et al. (2016).
Figura 1
Semillas de L. usitatissimum para la evaluación de la viabilidad. (A) Corte longitudinal de la semilla, (B) semilla con testa y (C) semilla sin testa (c: endospermo, e: embrión y t: testa).
Se sumergieron 100 semillas de linaza con cinco repeticiones en una solución de tetrazolio (2, 3, 5-cloruro trifenil tetrazolio) con diferentes concentraciones (0.5 % y 1.0 %) y tiempos de exposición (24 y 48h), en la oscuridad (cuadro 1). La viabilidad de las semillas se evaluó con un microscopio estereoscopio LEICA EZ4. De cada tratamiento se desarrollaron cinco réplicas. Las semillas viables se tiñeron de rojo por consecuencia de la reducción del tetrazolio debido a la actividad respiratoria de las células. (Salazar y Gélvez-Manrique, 2015). La viabilidad de las semillas se clasificó según la coloración del embrión (ISTA, 2010). Se considera que es viable cuando posee una coloración rojiza ya sea intensa (roja) o parcial (rosada) en el embrión (figura 2; A, B, C, D, E, F, G, H) y aquellas semillas que no son viables se constatan mediante el análisis de la no tinción del embrión (figura 2; I, J, K, L).
Tratamientos de L. usitatissimum con diferentes concentraciones y tiempos de exposición con tetrazolio.
Germinación
Para propósitos de estudio de la germinación de las semillas, el método utilizado fue el descrito por las reglas internacionales ISTA (2012). Utilizando como sustrato toallas de papel, a una temperatura alterna entre 20 y 30 °C, correspondiendo la temperatura baja al ciclo de noche (16 horas) y alta al ciclo de día (8 horas). Con una humedad relativa del 80 % (Pollock y Ross, 1972). Las repeticiones fueron sembradas siguiendo la metodología empleada por Patil et al. (2015). Para la evaluación de la germinación en semillas de Linum ussitassimum, se utilizaron bandejas de plástico con una proporción de 35 ml de agua por gramo de papel, donde se humedecieron a diario. Estas fueron sometidas a oscuridad durante tres días, se evaluaron 100 semillas con cinco repeticiones. Las semillas que germinaron fueron contadas para la determinación del porcentaje de germinación, que posteriormente se compararon con los porcentajes de viabilidad.
Diseño experimental
El diseño experimental fue factorial 2 x 2, completamente al azar (dos concentraciones de tetrazolio y dos tiempos de exposición) y 100 semillas con cinco repeticiones. Los datos arrojados en la prueba de tetrazolio se analizaron con ANDEVA, del mismo modo, en la comparación hecha entre el porcentaje de germinación y la prueba de viabilidad con tetrazolio. Posteriormente, las medidas fueron comparadas utilizando la prueba de rangos múltiples de Tukey con el propósito de determinar las diferencias significativas a un nivel de P≤0.05. En la evaluación del análisis estadístico, fue utilizado el software Statgraphic Centurion® versión 17. Para la elaboración de las gráficas se utilizó el software KyploT 2.0.
Resultados
Viabilidad y germinación de las semillas de Linum ussitassimum
De acuerdo a la evaluación de la coloración en las semillas de Linum ussitassimum se encontró variación en los tratamientos aplicados. No se observó diferencias estadísticamente significativas (P: 0.0005, Tukey HSD) entre los tratamientos T2 (1 %, 24h) con un 86 %, T3 (0.5 %, 48h) con un 86 %, y T4 (1 %, 48h) mostrando un 89 % de semillas viables (cuadro 2). Así mismo se visualizaron diferencias estadísticamente significativas entre el uso de solución de tetrazolio al 0.5 % por un tiempo de exposición de 24h (T1), y el resto de los tratamientos (T2, T3, y T4) con una media de 65 %, dato muy por debajo del resto. Lo que demuestra que tanto el tiempo, como la concentración de tetrazolio intervienen directamente en los resultados de la tinción.
Porcentaje de la viabilidad de semillas de L. usitatissimum utilizando la prueba de tretrazolio.
Los valores de las medias con diferente letra de cada columna, indican diferencias estadísticamente significativas, según la prueba de Tukey HSD (P≤0.05). ±: Error estándar.
Figura 2
Evaluación de la viabilidad de semillas de L. usitatissimum utilizando la prueba de tetrazolio (A, B, C, D, E, F, G, H) semillas viables (I, J, K, L) semillas no viables.
Porcentaje de germinación de L. usitatissimum
En la prueba de germinación se obtuvo un porcentaje promedio del 86 % en la evaluación del porcentaje de germinación (cuadro 3), valor que concuerda estadísticamente con los porcentajes obtenidos de viabilidad en T2, T3 y T4 (cuadro 4).
Comparación entre el porcentaje de viabilidad y porcentaje de germinación de Linum usitatissimum
Los valores con diferente letra dentro de cada ensayo de viabilidad y germinación, demuestran diferencias estadísticamente significativas, de acuerdo a la prueba de Tukey HSD (P≤0.05).
Discusión
Comparación de viabilidad y germinación
Los patrones de tinción identificados en las semillas de L. ussitasimum fueron similares a los reportados en otras especies como Chromolaena odorata y Cariniana pyriformis, datos obtenidos en el estudio realizado por Espitia-Camacho et al. (2017). Las variaciones en la intensidad de tinción (figura 2), ocurren debido a que la sal de tetrazolio permite determinar también la presencia, localización y por ende naturaleza de las alteraciones de los tejidos de las semillas (Lima et al., 2010; ISTA, 2014). De esta forma la coloración roja intensa indica la presencia de actividad celular en el embrión y la no coloración indica que no hay presencia de actividad celular, por lo tanto, es una semilla no viable (Monroy et al., 2017). Por tal razón, la prueba del tetrazolio se utiliza en programas de control de calidad de semillas, aquella pequeña tinción débil que presentan las semillas en algunas partes del embrión indican que poseen una disminuida actividad respiratoria y, por lo tanto, menor actividad de las enzimas deshidrogenasas (Rao et al., 2007).
En otras especies como Acca sellowiana (Sarmento et al., 2013) y Ceiba speciosa (Lazarotto et al., 2011), se encontraron resultados similares, permitiendo constatar la eficiencia de los tratamientos utilizados para la determinación de la viabilidad de las semillas de L. ussitassimum, lo que concuerda con lo reportado por Grzybowski et al. (2012) en Hordeum vulgare. En diversas especies el método más utilizado para la determinación de viabilidad es la prueba bioquímica de tetrazolio (Johnson et al., 2007). Aunque, no todas las semillas responden de la misma forma a la prueba, ya que esta se basa en la actividad de las deshidrogenasas (Salazar et al., 2013). Según un estudio realizado por Elizalde et al. (2017), se identificó que es posible determinar en las semillas su viabilidad por la tinción del tejido vivo (coloración roja) y analizar si está parcialmente dañado (tonalidades rosadas) o en dado caso no viable o muerto (ISTA, 2010).
La prueba de germinación ayuda a discriminar entre las semillas que no germinaron por ser latentes, abortadas, o tener embrión dañado (Elizalde et al., 2017). Dicha prueba mostró un 86 % de germinación en promedio para las cinco repeticiones con una desviación estándar de 9.63 (cuadro 3), siendo más bajo en comparación a la viabilidad obtenida en T4 (1 %, 48h) (cuadro 2), encontrándose igualdad con T2 (1 %, 24h) y T3 (0.5 %, 48h), donde la viabilidad fue del 86 % para cada uno (cuadro 4). Resultados similares a los descritos por Zaghdoudi et al. (2015), donde semillas de L. ussitasimum, presentaron un 97 % germinación en condiciones similares a este estudio, siendo conveniente en el ámbito agronómico, ya que se observa una tendencia en los resultados del estudio realizado por Patil et al. (2015) en semillas de L. ussitasimum, donde la germinación fue del 92 % para la variedad NL-97 y de 96 % para la variedad NL-260. Según Nasri et al. (2017), las fluctuaciones de factores como la temperatura influyen en la germinación de las semillas, no obstante, la prueba con tetrazolio, permitió determinar que las semillas analizadas, tenían potencial germinativo, indicando que en promedio el 81.5 % de las semillas de la muestra tenían posibilidad de germinar.
Las semillas de la mayoría de las plantas precisan de un periodo de letargo o dormancia antes de que estas puedan germinar; este letargo puede interrumpirse con la acción de la temperatura o la luz (Ramírez et al., 2016). Los ensayos de germinación permiten determinar el potencial que posee un lote de semillas y por lo tanto determinar su capacidad para la siembra en campo (Rodríguez et al., 2008). Sin embargo, la germinación puede verse afectada por factores externos, internos y del medio ambiente (Stefanello et al., 2017; Arenas y Heredia, 2017). De acuerdo con lo anterior, la validez de la evaluación de la viabilidad de las semillas debe ser confirmada con la prueba de germinación (Johnson et al., 2007). Dentro de los factores internos se encuentra la viabilidad, la cual se midió a través de la prueba bioquímica del tetrazolio, que permite la diferenciación de los tejidos vivos y muertos por la tinción roja del formazan sobre las células vivas (Canuto, 2012). Según Elizalde et al. (2017) la prueba de germinación permite reconocer aquellas semillas que germinaron y aquellas que no, por ser latentes o tener el embrión dañado. La prueba del tetrazolio es rápida al momento de estimar la viabilidad de semillas y su vigor basado en las alteraciones de color (coloración roja) en los tejidos vivos en contacto con la solución de tetrazolio, lo que refleja el grado de actividad del sistema enzimático de la deshidrogenasa relacionado estrechamente con la respiración celular y por tanto indica la viabilidad de las semillas (Corbineau, 2012). La germinación es un factor importante con el cual se comprueban los valores de viabilidad obtenidos con el tetrazolio como se demostró en este estudio. La finalidad de estas dos pruebas es identificar las diferencias más importantes de las semillas en el potencial fisiológico (Filho, 2015).
Conclusión
Se determinó que la evaluación de la viabilidad mediante la prueba de tetrazolio es eficiente ya que, gracias a esta, se puede conocer el potencial germinativo de un lote de semillas, presentando una alternativa rápida para determinar la calidad fisiológica de semillas de L.usitatissimum. Del mismo modo, se concluye que las concentraciones de 0.5 % a 48h, 1 % a 24 y 48h de exposición, mostraron un alto grado de eficiencia con respecto al porcentaje de germinación.
Recomendación
Realizar estudios adicionales de viabilidad usando concentraciones mayores a 0.5 % y tiempos de 24h y/o más horas de exposición a la sal de tetrazolio, buscando llegar a una mayor exactitud en la determinación de la eficacia de la prueba de tetrazolio en semillas de L. usitatissimum.
Agradecimientos
A la Universidad Francisco de Paula Santander por su valiosa colaboración.
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Apéndices
Linaza+Tetrazolio
Autora: Marisol Herrera Sosa
Tamaño: 12.5 x18 cm
Técnica: Acuarela
