Introducción

Las moscas taquínidas son ampliamente usadas para el manejo de barrenadores de caña de azúcar, las especies Billaea claripalpis Wulp. (anteriormente Paratheresia) y Lydella minense Townsend (anteriormente Metagonistylum) (ambas Diptera: Tachinidae, Dexiinae) son las más prominentes (Aya et al., 2018). Las dos especies fueron introducidas en Colombia para el control del barrenador de la caña de azúcar, Diatraea saccharalis F. (Lepidoptera: Crambidae) (Smith y Bellotti, 1996). Actualmente, ambos parasitoides son producidos y vendidos regularmente por compañías de biocontrol y liberados en los campos de caña de azúcar durante todo el año (Vargas et al., 2015). Pese a esto, la diversidad de barrenadores de caña de azúcar en Valle del Cauca aumentó considerablemente a lo largo de los años y actualmente se encuentran seis especies congéneres D. saccharalis, D. busckella Dyar & Heinrich, D. tabernella Dyar, D. indigenella Dyar & Heinrich, D. lineolate Walker y D. rosa Heinrich (Vargas et al., 2013; Vargas et al., 2018).

A pesar de que se considera que los taquínidos tienen rangos de hospedadores, generalmente más amplios que los parasitoides himenópteros koinobiontes (cenobiontes) (Stireman et al., 2006; Stireman y Singer, 2003), este aumento en la diversidad de especies plaga puede haber tenido consecuencias significativas para el impacto de los agentes de biocontrol en el campo. Por tanto, se considera que la relación de hospederos de las moscas taquínidas merece un estudio más detenido.

Existe otro barrenador de caña de azúcar en Colombia que puede llegar a poblaciones muy altas: Rhynchophorus palmarum L. (Coleoptera: Dryophthoridae), el cual es reportado como plaga principal de la palma de coco (Cocos nucifera L) y plaga importante de palma de aceite (Elaeis guineensis Jacq.) y chontaduro (Bactris gasipaes Kunth) (Löhr et al., 2015). No se sabe mucho sobre el daño que causa esta plaga en la caña de azúcar, pero las capturas en trampas de feromonas en plantaciones de este cultivo pueden ser extremadamente altas. Löhr et al. (2015) reportaron la captura en menos de un año de más de 53 000 especímenes en trampas que rodean un área de caña de azúcar de siete hectáreas, lo que podría suponer una amenaza mayor a la registrada hasta ahora en la producción de este cultivo.

Debido a que gran parte de su desarrollo ocurre dentro de los tejidos de la planta, las larvas y pupas del picudo R. palmarum están protegidas contra los métodos actuales de control, los cuales están dirigidos principalmente a la captura de adultos con feromonas específicas, erradicación de plantas muertas y uso de insecticidas químicos (Aldana et al., 2011). Encontrar un enemigo natural exitoso de larvas y pupas de R. palmarum en Colombia, supondría una solución al problema y una ventaja para varios cultivos comerciales (Palma de aceite, coco, chontaduro, etcétera) y no comerciales (nativas y ornamentales) de palmáceas. Así como también, para cultivos donde esta plaga ha tomado mayor importancia, como en el cultivo de caña de azúcar. Una alternativa que parece ser la más prometedora hasta el momento y que no ha recibido la atención debida, son las moscas parasitoides de larvas y pupas, Billaea menezesi (Townsend) y Billaea rhynchophorae (Blanchard) (Diptera: Tachinidae) reportadas en Brasil (Moura et al., 2006). El género Billaea parasita exclusivamente escarabajos de las familias Cerambycidae, Dryophthoridae y Passalidae, la única excepción conocida es B. claripalpis (Nihei y Pavarini, 2011).

El objetivo de esta investigación está dirigido a evaluar la capacidad de B. claripalpis de parasitar y afectar larvas de R. palmarum de diferentes pesos criadas sobre caña de azúcar y dieta artificial en condiciones de laboratorio.

Materiales y métodos

Tres experimentos se realizaron en los laboratorios de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria AGROSAVIA en Palmira, Valle del Cauca, cuyas coordenadas geográficas son 3° 31´ 48´´ latitud norte y 76° 81´ 13´´ longitud oeste, a una altura de 1 001 msnm. Los dos primeros experimentos consistieron en evaluar el parasitismo forzado: inoculación manual de larvas de R. palmarum por larvas de la mosca (planidios) B. claripalpis; el tercer experimento consistió en medir el parasitismo por moscas en condiciones seminaturales (jaula). Para todos los ensayos se usaron moscas grávidas de B. claripalpis, obtenidas de la casa comercial Perkins Ltda.

Para la inoculación manual, las larvas de R. palmarum se parasitaron con la ayuda de un pincel entomológico, exponiendo tres planidios de la mosca de 15 días de edad, en la parte dorsal de cada larva. Posteriormente, las larvas inoculadas se colocaron individualmente en trozos de caña de azúcar previamente perforadas o en recipientes con dieta artificial. Las diferentes clases de peso se mantuvieron separadas en el laboratorio en cajas de acrílico transparente (32 x 20 x 15 cm). Para evitar sesgos en los experimentos, se inocularon larvas de diferentes tamaños con los planidios presentes en el ovario de una sola mosca. Como control negativo del experimento, se utilizaron larvas del picudo sin parasitar, criadas tanto en dieta artificial como en caña de azúcar.

Cría del picudo Rhynchophorus palmarum en dieta artificial y caña de azúcar

El proceso de cría de R. palmarum en laboratorio inició con la captura de picudos adultos en campo (Löhr, 2016). Para este propósito se ubicaron trampas tipo galón en cultivos de caña de azúcar (Saccharum officinarum L., variedades CC003257 y CC991606) en el centro de investigación AGROSAVIA-Palmira, utilizando la feromona sintética de agregación Rhyncolure (2-methylhept-5-en-4-ol) y acetato de etilo como atrayentes (Löhr y Parra, 2014). Una vez capturados, los insectos adultos fueron llevados al laboratorio donde se separaron por sexo, según características morfológicas publicadas por Löhr (2016). Las hembras se ubicaron en cajas de acrílico transparente (32 x 20 x 15 cms, Rubbermaid®) con una perforación para permitir el intercambio gaseoso. Para la alimentación de las hembras se utilizaron rodajas de papaya pelada, finamente cortadas. Cada 48 horas se retiraron los huevos por decantación en agua, posteriormente se dispusieron en cajas Petri de 90 mm de diámetro con papel toalla húmeda y fueron mantenidos hasta la eclosión. Las larvas neonatas fueron transferidas a recipientes, conteniendo 150 g de dieta artificial (Löhr, 2016) (cuadro 1). Posteriormente, se delimitó el espacio de las larvas con ayuda de pitillos (60 mm de diámetro), con el objetivo de crear una microjaula y evitar canibalismo. Transcurridos cinco días, las larvas se retiraron y se individualizaron en nuevos recipientes plásticos de 150 ml con 25 g de dieta artificial. Dos semanas más tarde, las larvas se transfirieron a recipientes más grandes con 200 g de dieta, donde permanecieron hasta completar el peso deseado a evaluar (desde 100 mg hasta 7000 mg).

Para la cría de larvas de R. palmarum en caña de azúcar, las larvas neonatas fueron transferidas individualmente a estacas de caña de 10 cm de longitud, las cuales habían sido previamente perforadas con un taladro manual. Ambos extremos de la caña se humedecieron con propilene-glycol (C₃H₈O₂), y fueron sellados con parafina derretida para evitar contaminación y deshidratación de la estaca. Las larvas fueron cambiadas de estacas cada dos semanas o cada que lo requerían.

Moscas parasitoides

Las moscas Billaea claripalpis adultas utilizadas en estos ensayos fueron adquiridas de la casa comercial Perkins Ltda. y se mantuvieron en condiciones de laboratorio hasta su posterior uso. Según lo reportado en la literatura, las moscas de Billaea alcanzan su madurez sexual a los 10-12 días de edad; por tanto, la disección de las moscas se realizó después de este tiempo, extrayendo cuidadosamente el abdomen y los ovarios. Estos últimos fueron colocados sobre una superficie negra para facilitar la percepción de los planidios y un círculo de vaselina se formó alrededor de ellos, con el objetivo de reducir la velocidad de su movimiento y así evitar el escape.

Inoculación forzada de larvas de Rhynchohporus palmarum criadas en dieta artificial

Para este primer experimento se utilizó un diseño completamente al azar bajo condiciones de laboratorio (T: 25±3 °C; H.R: 57±3 %, L12: O12). Las larvas de R. palmarum fueron criadas sobre dieta artificial hasta alcanzar cinco diferentes rangos de peso: 100400 mg; 401-800 mg; 801-2000 mg; 2001-4000 mg; 4001-7000 mg, comprendiendo desde el primer hasta el octavo-noveno instar larval. Todas las larvas fueron parasitadas individualmente con tres planidios de 15 días de edad. Posteriormente, la mitad de cada grupo de larvas se dispuso nuevamente en dieta artificial y la otra mitad en estacas de caña de azúcar hasta su evaluación dos semanas después. Las larvas en el rango de peso 4001-7000 mg se mantuvieron solamente en caña después de ser parasitadas. Cada larva individual representaba una unidad experimental. Los tratamientos consistieron en los cinco rangos de peso evaluados y para cada tratamiento se evaluaron 83 larvas, con un total de 415 larvas de R. palmarum parasitadas en este ensayo.

Inoculación forzada de larvas de Rhynchohporus palmarum criadas en caña de azúcar

En el segundo experimento, las larvas de R. palmarum fueron criadas sobre caña de azúcar en condiciones de laboratorio (T: 25±3 °C; H.R: 57±3 %, L12: O12) hasta alcanzar cinco diferentes rangos de peso: 40-150 mg; 151-300 mg; 301-600 mg; 601-1200 mg; 1201-2700 mg, comprendiendo desde el primer hasta el cuarto instar larval aproximadamente. Posteriormente, todas las larvas fueron parasitadas en su parte dorsal con tres planidios y se regresaron individualmente a estacas numeradas de caña de 20 cm (previamente perforadas) hasta su evaluación. El experimento se mantuvo en un diseño completamente al azar a 26 °C y 70 % HR. Cada larva dentro de la caña representó una unidad experimental. Los tratamientos consistieron en los cinco rangos de peso evaluados, para cada tratamiento se evaluaron 95 larvas, con un total de 475 larvas de R. palmarum parasitadas en este experimento.

Parasitismo en jaula

Para evaluar el parasitismo sobre R. palmarum en condiciones de libre elección, se utilizaron cuatro jaulas (45 x 45 x 90 cm) con un tamiz delgado para impedir el escape de las moscas. En cada jaula se introdujo horizontalmente un total de cuatro estacas de caña de azúcar (40 cm de longitud) conteniendo en su interior una larva de R. palmarum (100-2000 mg de peso) en un extremo y una larva de D. saccharalis (120-200 mg) como control positivo en el extremo sobrante; posteriormente se liberaron dos moscas en cada jaula por un periodo de 48 horas. Las jaulas se mantuvieron en condiciones de laboratorio a una temperatura de 25±3 °C, humedad relativa de 57±3 % y condiciones naturales de luz. Para este ensayo se realizaron un total de cuatro repeticiones (cuatro jaulas diferentes) con cuatro unidades de cada larva, para un total de 16 larvas de R. palmarum y 16 larvas de D. saccharalis evaluadas.

Revisión de larvas parasitadas

A una temperatura de 25 °C y ocho días después del parasitismo, las larvas de B. claripalpis emergen del huésped D. saccharalis. Observaciones preliminares han mostrado que el desarrollo de B. claripalpis en larvas de R. palmarum es más lento. Por lo tanto, la revisión de parasitismo se realizó 15 días después de que las larvas fueron parasitadas. Una vez transcurrido este tiempo, las larvas del picudo fueron pesadas nuevamente y diseccionadas. Los criterios de evaluación consistieron en determinar si las larvas fueron parasitadas o no, para esto se buscaban evidencias que indicaran la presencia de embudos respiratorios del parasitoide; número, posición y aspecto de larvas parasitoides, así como la presencia de puparios. Según el comportamiento de las larvas del picudo al momento de la evaluación, se calificaron como normales o afectadas. Se consideraron afectadas aquellas larvas que presentaron movimiento anormal o cuando su peso disminuyo después de parasitismo.

Análisis estadístico

Para todos los experimentos, el número de larvas afectadas y normales se comparó entre cada rango de peso y entre los diferentes sustratos de cría mediante una prueba no paramétrica de chi-cuadrado(χ²). Los datos de peso final de larvas y la frecuencia de larvas afectadas también fueron comparados mediante una regresión lineal. El número de planidios encontrados para cada grupo de peso fue analizado mediante un análisis de varianza ANOVA de una vía. Las diferencias significativas fueron separadas usando una prueba de Tukey (p< 0.05) (R versión 3.0.0, 2013).

Resultados

Parasitismo de larvas de Rhynchophorus palmarum criadas con dieta artificial

El peso final de las larvas del picudo, dos semanas después de haber sido parasitadas con planidios de B. claripalpis, no evidenció diferencias significativas en comparación con las larvas control no parasitadas (P= 0.1829). El número de larvas del parasitoide recuperadas después de parasitismo fue mayor para las larvas de R. palmarum dispuestas en caña para los cinco rangos de peso evaluados. Las larvas entre 4001-7000 mg llevadas a la caña después de ser parasitadas, alcanzaron el número promedio más bajo de larvas recuperadas del parasitoide (figura 1).

En todos los casos, y para todos los rangos de peso, las larvas del parasitoide recuperadas se encontraban en un estado de encapsulación (figura 2).

El número de larvas afectadas después de parasitismo presentó diferencias significativas entre los diferentes rangos de peso para larvas dispuestas en caña (χ²= 35.1176, P< 0.0001). Mientras que las larvas dispuestas en dieta artificial después de parasitismo no mostraron una diferencia significativa entre los cinco rangos de peso evaluados (χ²= 2.2924, P= 0.513). En todos los casos se puede evidenciar un mayor número de larvas afectadas en caña de azúcar, comparado con la dieta (figura 3).

Existió una relación directa inversa entre el porcentaje de larvas afectadas después de parasitismo y los pesos finales de las larvas del picudo criadas en caña (R²= 0.7749; P <0.0001) (figura 3).

La mortalidad fue mayor en larvas del picudo dispuestas en caña de azúcar, comparada con las larvas dispuestas en dieta artificial (19.5 y 9.68 %, respectivamente), presentando diferencias significativas (P< 0.0001). Los rangos de peso entre 801-4 000 mg no presentaron mortalidad para ninguno de los dos métodos de cría evaluados.

Del número total de larvas parasitadas para este ensayo (415) se encontraron solamente dos larvas del picudo con desarrollo del parasitoide hasta estado de pupa (0.48 %). Las larvas del picudo que presentaron esta condición coincidían en un peso menor a 1 500 mg. En ambos casos, las pupas no lograron emergencia hasta moscas adultas, ya que fueron dañadas por las larvas del picudo.

Parasitismo de larvas de Rhynchophorus palmarum criadas en caña de azúcar

Las larvas del picudo que presentaron un peso superior a 4000 mg no resultaron afectadas en el primer ensayo. Por esta razón, para este ensayo, se seleccionaron solamente larvas con un peso inferior a los 3000 mg. Los pesos de las larvas se dividieron en cinco rangos: 40-150 mg; 151-300 mg; 301-600 mg; 601-1200 mg; 1201-2700 mg.

El número promedio de larvas del parasitoide recuperadas después del parasitismo es similar para los cinco rangos de peso evaluados (1.00, 1.14, 0.87 y 0.82 para los rangos de peso 40-150; 151-300; 301-60; 601-1200 mg, respectivamente), con una ligera disminución en el peso 1201-2700 mg (0.58).

Existe una diferencia significativa entre larvas afectadas, larvas sanas y larvas muertas después del parasitismo para los cinco rangos de peso evaluados (χ²= 39.49, P< 0.00001). El rango de peso entre 1201-2700 mg obtuvo el menor porcentaje de larvas afectadas (figura 4), lo que está directamente relacionado con el promedio de larvas del parasitoide recuperadas para este rango de peso. También se encontró una correlación (R²= 0.719; P=0.0066) entre el porcentaje de larvas afectadas y el tamaño de estas. El peso promedio adecuado para el parasitismo de larvas del picudo con tres planidios de la mosca estaría entre 40-800 mg, lo que concuerda con el primer experimento.

Las larvas del picudo que resultaron afectadas, pero no murieron, se regresaron a estacas de caña realizando seguimiento semanalmente. De estas larvas, 75 % lograron su desarrollo hasta adultos sin ningún problema. El porcentaje restante de larvas se desarrolló de manera anormal o no logró sobrevivir. Las larvas que presentaron el embudo respiratorio del parasitoide en uno de sus últimos segmentos abdominales presentaron problemas al momento de la muda. En la figura 5 se puede observar cómo el exoesqueleto queda adherido al embudo respiratorio del parasitoide, siendo la larva incapaz de liberarse, lo que genera un estrés adicional para las larvas con un mayor gasto energético para la misma.

La menor mortalidad de larvas del picudo, la presentaron las larvas en el rango de peso entre 300-600 mg. Mientras la mortalidad más alta se presentó en el rango de peso más bajo (40-150 mg).

Parasitismo de Rhynchophorus palmarum expuestas a moscas

Los resultados obtenidos en este ensayo indican que las larvas del picudo pueden ser parasitadas por la mosca B. claripalpis en un ambiente seminatural, de libre elección, con un alto porcentaje de larvas afectadas (50 %) y una mortalidad de 23 %; sin embargo, y de acuerdo con los experimentos anteriores, no se observaron puparios de la mosca en larvas de R. palmarum. Por el contrario, las larvas de D. saccharalis que funcionaron como controles positivos, sí presentaron un desarrollo completo del parasitoide. El número de larvas afectadas, sanas y muertas fue estadísticamente diferente entre las larvas de R. palmarum y larvas de D. saccharalis (X²= 35.188, P<0.00001).

Discusión

En todos los casos, y para todos los rangos de peso, las larvas del parasitoide recuperadas se encontraban en un estado de encapsulación. En muchos casos de parasitismo, la respuesta celular inmune del huésped es activada generando un proceso de fagocitosis o de atrapamiento del parasitoide, lo que conduce a un mecanismo de encapsulación del atacante (Lavine y Strand, 2002). La encapsulación puede ser seguida por un proceso de melanización, resultando en la muerte del parasitoide por asfixia o citotoxicidad (Reed et al., 2007). En el género Rhynchophorus ya se han reportado este tipo de procesos como mecanismo de defensa. Tal es el caso de la encapsulación de larvas del nematodo Steinernema carpocapsae por parte del picudo rojo de las palmeras, Rhynchophorus ferrugineus (Manachini et al., 2013; Mastore et al., 2015).

En estudios con B. claripalpis, también se ha reportado resistencia al parasitismo. Aya et al., 2018, reportaron la presencia de larvas del parasitoide encapsuladas después de inoculación manual de planidios de B. claripalpis sobre larvas de D. tabernella y D. busckella.

El mayor número de larvas afectadas y larvas muertas en caña de azúcar comparado con dieta artificial se podría explicar debido a que la dieta artificial presenta alto contenido nutricional (Löhr, 2016), brindando a las larvas mayor defensa contra patógenos o parasitoides. Son varias las razones de variación en los parámetros biológicos que podrían devenir de los potenciales efectos de la dieta sobre la interacción hospedero-parasitoide (Reguilón et al., 2014). La larva del parasitoide deberá inducir la supresión del sistema inmune de la larva hospedero (Rodríguez y Beckage, 2006), si el hospedero se cría en condiciones nutricionales que fortalezcan su sistema inmune, esto podría potencialmente afectar el desarrollo del parasitoide, como pudo haber ocurrido en este caso.

Las larvas parasitadas de R. palmarum de mayor edad resultaron menos afectadas, presentando posiblemente una mejor respuesta de su sistema inmune. La edad de las larvas del huésped es un factor importante para el éxito del parasitismo en Tachinidae (Löhr et al., 2019). Hernández (2010) reporta que las larvas de D. saccharalis de estados más avanzados (últimos instares) matan un mayor porcentaje de parasitoides con el sistema de defensa externa.

En crías masivas de B. claripalpis y bajo condiciones controladas, el parasitismo y desarrollo completo sobre su hospedero natural D. saccharalis supera 70 % (Perkins Ltda.). Mientras que en condiciones de campo se ha encontrado parasitismo inferior a 5 % (Leyton-Flor et al., 2018). En este estudio, se observó que la mayor parte de larvas del parasitoide fueron encapsuladas en su primer estado de desarrollo. Sólo dos larvas de R. palmarum (lo que corresponde a 0.48 %), lograron el desarrollo del parasitoide hasta su estado final (pupa). Esto podría indicar que la respuesta celular inmune del picudo evita que el parasitoide pueda llegar a su estado final.

En el caso de parasitismo en jaula, los resultados evidenciaron la capacidad de B. claripalpis de entrar naturalmente al huésped R. palmarum, afectando significativamente a las larvas (50 %) y en algunos casos causando su muerte (23 %), este porcentaje de mortalidad puede ser el resultado de la sobreexposición de pladinidos al hospedero. Löhr et al. (2019) reportan que el número de planidios que atacan el hospedero en los diferentes estados del huésped es uno de los factores más importantes del éxito de parasitismo en Tachinidae.

Conclusiones

La mosca B. claripalpis presenta la capacidad de penetrar larvas de R. palmarum; sin embargo, bajo las condiciones estudiadas, los planidios de la mosca no lograron completar su desarrollo hasta pupa.

A pesar de que las larvas del picudo parasitadas fueron afectadas en su compartimiento, estas lograron completar su desarrollo dando lugar a adultos aparentemente normales. Los sustratos de cría y los diferentes pesos evaluados afectan el desarrollo del parasitoide y el efecto de este sobre el huésped.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Freddy Suárez por el apoyo en la parte técnica durante el desarrollo de los ensayos y a la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA) por la financiación de la investigación.

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Notas de autor

jgaviriav@agrosavia.com