2021
392
05022020
28072021
GABRIEL ERNESTO SILVA ACOSTA gabrielsacosta@gmail.com
Universidad del Magdalena, Colombia
ALBERTO RAFAEL PÁEZ REDONDO apaez@unimagdalena.edu.co
Universidad del Magdalena, Colombia
Resumen: Phytophthora palmivora se asocia como causante de la pudrición del cogollo (PC), enfermedad que afecta el rendimiento y supervivencia de las plantaciones de palma aceitera en Colombia. Con el objetivo de explorar alternativas de control biológico a la PC se evaluó en in vitro la acción antagónica de nueve cepas de hongos filamentosos: Aspergillus clauatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Penicillium sp. 01, Penicillium sp. 02, Paecilomyces variotii y Trichoderma sp. contra Phytophthora sp. aislado de palma aceitera, más un tratamiento control. Se estableció un diseño de bloques completos al azar con cuatro repeticiones y se usó la técnica del plato dual en cajas Petri (Ø = 90 mm) con agar papa destroza. Se midieron las variables crecimiento micelial radial (CMR), tasa de crecimiento micelial (TCM) y grado de inhibición (GI), a las 96 horas de incubación de los tratamientos. Trichoderma sp. y A. niger fueron estadísticamente superior a los demás tratamientos (p≤0,01), ejerciendo un 79 y 74 % de GI sobre el oomycete, respectivamente, restringiendo su CMR entre 2 a 2,3 cm y limitando su TCM hasta 4 veces menos respecto al control. Tres conglomerados jerárquicos fueron formados entre los nueve aislamientos por su comportamiento antagónico contra Phytophthora sp. Los aislados sobresalientes muestran potencial como biorreguladores del patógeno.
Palabras clave: AntagonistaAntagonista,biocontrolbiocontrol,Elaeis guineensis JacqElaeis guineensis Jacq,fitopatologíafitopatología.
Abstract: Bud Rot Disease (BR), caused by Phytophthora palmivora, affects the yield and survival of oil palm crops in Colombia. With the objective of exploring biological control alternatives to the BR, we evaluated, under in vitro conditions, the antagonistic effect of nine filamentous strains fungi: Aspergillus clauatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Penicillium sp. 01, Penicillium sp. 02, Paecilomyces variotii y Trichoderma sp. against Phytophthora sp., isolated from an oil palm crop, in addition to a control trial. A randomized complete block design with four repetitions was established using the dual culture technique in petri dishes (Ø = 90 mm) with potato dextrose agar. We measured variables such as radial mycelial growth (RMG), mycelial growth rate (MGR), and inhibition percentage (IP), at 96 hours after treatment incubation. The statistical test revealed that Trichoderma sp. and A. niger were the superior trials (p≤0,01), exerting 79 and 74 % of IP, respectively, against the oomycete. Furthermore, they restricted the RMG of the pathogen between 2 to 2,3 cm and limited its MGR up to 4 less times than the control trial. Three hierarchical conglomerates were formed according to the nine strains' antagonistic performance confronted with Phytophthora sp. The outstanding isolates have potential as bioregulators of the pathogen.
Keywords: Antagonist, biocontrol, Elaeis guineensis Jacq, phytopathology.
Artículo de investigación
Antagonismo in vitro de nueve hongos aislados del Caribe colombiano sobre Phytophthora sp. asociado a palma aceitera
In Vitro Antagonism of Nine Isolated Fungi from the Colombian Caribbean against Phytophthora sp., Associated with Oil Palm
GABRIEL ERNESTO SILVA ACOSTA gabrielsacosta@gmail.com
ALBERTO RAFAEL PÁEZ REDONDO apaez@unimagdalena.edu.co
Recepción: 05 Febrero 2020
Aprobación: 28 Julio 2021
El género Phytophthora es considerado como uno de los grupos de microrganismos causales de enfermedades en las plantas más devastadores [1]. En el caso de la palma aceitera (Elaeis guineensis Jacq.), Phytophthora palmivora fue identificada como el principal agente causal asociado a la Pudrición del cogollo (PC), enfermedad reconocida como el problema fitosanitario más limitante en las plantaciones comerciales de palma aceitera a nivel del trópico [2], [3].
En Colombia, la palma aceitera representa el cultivo agroindustrial más extendido, con alrededor de 560 000 ha cultivadas y una producción de aceite de 2 millones de toneladas anuales, aproximadamente, aportando cerca del 10 % del valor del PIB agrícola nacional y generando 188 000 empleos, entre directos e indirectos, lo cual convierte al país en el mayor productor de aceite de palma en Sudamérica [4], [5]. Sin embargo, a pesar de la representatividad de este subsector agrícola en el país, su sostenibilidad se ha visto seriamente amenazada por la presencia de la PC en las plantaciones, la cual se estima que en los últimos cuatro años ha afectado alrededor del 22 % del total de superficie cultivada con palma aceitera [6], [7].
Desde la aparición de la PC en el territorio colombiano, reportada por primera vez en el año de 1964 en la región del Urabá antioqueño, a esta enfermedad se le atribuye en la actualidad del bajo rendimiento en fincas productoras en la zona central, norte y oriental del país. Por ejemplo, la PC fue el origen principal de erradicación de cerca de 35 000 hectáreas de cultivo en el departamento de Nariño y de afectar cerca de 2 000 ha en el departamento del Magdalena, en los últimos cinco años [8].
En términos etiológicos la PC se caracteriza por generar en sus etapas iniciales síntomas de pudrición en las hojas jóvenes (flechas) de las plantas de palma infectadas, cuya severidad se va incrementando cuando la pudrición alcanza el área meristemática del estípite, es decir, el punto donde ocurren procesos de multiplicación celular que inciden en el crecimiento de la planta. En esta etapa la infección es prácticamente irreversible, y desencadena gradualmente el necrosamiento de tejidos hasta ocasionar la muerte de las plantas enfermas [9].
Ante el limitado desarrollo de materiales comerciales de palma aceitera resistentes o altamente tolerantes a la PC, aptos para su cultivo en todo el territorio colombiano, el manejo de la enfermedad se ha centrado principalmente en la aplicación de las buenas prácticas agrícolas para prevenir su aparición dentro de nuevas plantaciones o de lentificar su diseminación en áreas productoras que ya han sido afectadas [10]. Prácticas como adecuado manejo de las plántulas en etapa de vivero, nutrición balanceada del cultivo, óptimos sistemas de riego y drenaje, monitoreo constante de insectos plaga, aplicación de fungicidas y erradicación de plantas enfermas, constituyen las principales actividades que se recomiendan para el manejo de la PC en la mayoría de los casos. No obstante, estas medidas se consideran insuficientes para manejar la enfermedad, especialmente cuando el nivel de contagio en una plantación alcanza el 5 % [11].
Ante este contexto, las estrategias de manejo de la PC en Colombia han enfocado su interés en la última década en probar opciones de control biológico de la enfermedad [12], sin que haya hasta la fecha resultados determinantes o productos en el mercado que se recomienden para el manejo biológico de la PC en condiciones de clima cálido tropical como, por ejemplo, en la región Caribe de Colombia, en la cual se cultiva cerca del 32 % del área total sembrada con palma aceitera en el país [13].
El control biológico, en cuanto al uso de microrganismos, se basa principalmente en identificar y probar especies de hongos, bacterias o virus que, de acuerdo con su naturaleza o rasgos evolutivos, puedan ejercer una acción antagónica sobre otros microrganismos susceptibles a estos, bajo las mismas condiciones medioambientales y entorno, para su desarrollo [14].
En búsqueda de alternativas que complementen las prácticas para el manejo de la PC, esta investigación tuvo como objetivo evaluar in uitro la acción antagónica de nueve cepas de hongos pertenecientes a los géneros Aspergillus, Penicillium, Paecilomyces y Trichoderma, provenientes de agroecosistemas de la región Caribe de Colombia, frente a Phytophthora sp. aislado de una plantación comercial de palma aceitera afectada con PC, de la misma región
El aislamiento de Phytophthora sp. provino de porciones de tejido de hojas jóvenes (cogollos) de plantas de palma aceitera con sintomatología de la enfermedad de pudrición del cogollo (PC), colectadas en una finca comercial de palma aceitera ubicada en el corregimiento de Guacamayal, municipio Zona Bananera, departamento del Magdalena (Colombia), ubicada en las coordenadas 10° 44'45.23'' N y 74°09'58,18'' O.
Las muestras se obtuvieron y se procesaron con base en protocolos ajustados de acuerdo con lo descrito por Martínez et al. [15], para la toma y manejo de muestras de tejidos en plantas de palma aceitera afectadas por la PC.
La confirmación taxonómica del aislamiento de Phytophthora sp. se realizó mediante montajes de porciones de crecimiento del patógeno en placas portaobjeto, en contraste con azul de metileno, observadas con un microscopio eléctrico Leica ICC50 (Leica Application Suite® LAS EZ, versión 1.7.0 Build:35), y siguiendo las claves taxonómicas de Erwin y Ribeiro [16], definidas para la identificación de especies del género Phytophthora. El asilamiento identificado como Phytophthora sp. fue morfológicamente similar a la descripción de Phytophthora palmivora [16], no obstante, se reservó la identificación por nombre específico (sp.). Réplicas en tubos de ensayo y platos Petri con medio Agar Papa Dextrosa (PDA) y Corn Meal Agar (CMA), ligeramente acidificados al 2 % con ácido láctico, se obtuvieron para purificar, multiplicar y conservar la cepa fitopatógena [16].
Las nueve cepas de hongos filamentosos con potencial antagónico utilizados en el experimento correspondieron a Aspergillus clauatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans Aspergillus terreus, Paecilomyces variotii, Penicillium sp. 01, Penicillium sp. 02 y Trichoderma sp., los cuales se obtuvieron de seis diferentes agro-ecosistemas en el departamento del Magdalena producto del proyecto de investigación Caracterización de hongos del suelo potencialmente biocontroladores, en ecosistemas interuenidos y no interuenidos del Caribe seco colombiano, desarrollado entre 2012 y 2013 en la Universidad del Magdalena (Santa Marta, Colombia) y cofinanciado por el Departamento Administrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación de Colombia (Colciencias) hoy Minciencias.
Se consideró cada una de las nueve cepas enfrentadas en pruebas de antagonismo in vitro contra Phytophthora sp., como un tratamiento. Asimismo, se estableció un tratamiento control, el cual consistió en la siembra de Phytophthora sp. en el medio de cultivo utilizado (PDA), sin ningún antagonista (tabla 1). La investigación se llevó cabo en condiciones controladas en el Laboratorio de Fitopatología de la Universidad del Magdalena (coordenadas 11°13'18"N y 74°11'10"O).
Se utilizó la técnica del plato dual para las pruebas de antagonismo in uitro [17]. Los tratamientos se organizaron bajo un diseño experimental de bloques completos al azar (DBCA) con cuatro repeticiones. Como unidad experimental se estableció un plato Petri (Ø = 90mm) de cada enfrentamiento en 20 ml de medio PDA acidificado al 2 % con ácido láctico.
En los montajes de cada tratamiento en los platos Petri se marcaron dos ejes paralelos distanciados a 4 cm entre sí y separados a 2,5 cm del borde de la caja. En el centro de un eje se colocó una porción de 2 mm de diámetro de medio de cultivo con crecimiento de Phytophthora sp. de 72 horas de incubación y en el centro del otro eje se colocó una porción de medio semejante con el microorganismo por evaluar, de la misma edad de incubación que el patógeno [17].
Los tratamientos fueron incubados en condiciones de oscuridad y a temperatura oscilante entre 27 y 29 °C y humedad relativa del 85 %, en una incubadora de la marca MMM serie INCUCELL®. Las evaluaciones se llevaron a cabo por un periodo de 96 horas, el cual fue el tiempo promedio en que Phytophthora sp. colonizaba el 90% ± 5 % del medio de cultivo en las cajas de Petri donde creció como monocultivo.
Las variables dependientes evaluadas fueron: i) Crecimiento micelial radial (CMR) de los aislamientos evaluados frente al patógeno, cuantificado en cm a las 24, 48, 72 y 96 horas después de haber sembrado la cepa antagonista, versus el patógeno. ii) Tasa de crecimiento micelial (TCM) de los aislamientos (cmdía-1), determinada por la ecuación 1 [18]. iii) Grado de inhibición (GI) del crecimiento del patógeno, en porcentaje, con lectura a las 96 horas, aplicando la fórmula de la ecuación 2 [19].
Donde Cf y Ci corresponde al crecimiento final y crecimiento inicial a las 96 y 24 horas, respectivamente, expresados en cm. Tf y Ti es el tiempo final y tiempo inicial de las mediciones, representados en días, respectivamente.
Donde CP es el crecimiento radial del patógeno (testigo), en centímetros, a las 96 horas, y Cp+a es el crecimiento radial del patógeno bajo la acción del antagonista a las 96 horas, expresado en centímetros.
Observaciones microscópicas de porciones de micelio de cada uno de los hongos filamentosos evaluados en su respectivo tratamiento fueron efectuadas después de 96 horas de incubación, para identificar posibles mecanismos de acción de microparasitismo frente a la cepa de Phytophthora sp.
Los datos obtenidos en el experimento fueron sometidos a pruebas de normalidad, mediante las cuales se comprobó la distribución normal de los datos. Se realizaron análisis de varianza para las tres variables evaluadas y pruebas de comparación de medias mediante Tukey (p≤0,05) en los casos en los que hubo significancia estadística. En estos análisis se utilizó el software estadístico SAS versión 9.0.
Se realizó la prueba de la distancia de Gower y el método de agrupamiento jerárquico de Ward [20], entre las nueve cepas de hongos filamentosos enfrentadas a Phytophthora sp., como forma de generar un sistema de jerarquización de conglomerados por similitudes cuantitativas respecto al desempeño antagónico global de cada uno de los aislamientos. Para ello se usó el paquete estadístico InfoStat-Statistical Software versión 2017.
El análisis de varianza evidenció diferencias altamente significativas (p<o,oi) entre los 10 tratamientos evaluados para las tres variables analizadas, crecimiento micelial radial (CMR), tasa de crecimiento micelial (TCM) y grado de inhibición (GI), con coeficientes de variación menores que 10 % para cada variable (tabla 2).
La prueba de comparaciones de medias según Tukey (tabla 3) mostró que los hongos correspondientes a los tratamientos T3 (Aspergillus niger) y T9 (Trichoderma sp) fueron los que más afectaron el CMR del patógeno Phytophthora sp., sin diferencias estadísticas entre sí (p≤0,05), restringiendo el crecimiento de Phytophthora sp. en un 70,5 y 74,3 %, respectivamente, respecto al tratamiento control (T10). Entre tanto, los hongos correspondientes al T2 (Aspergillus glaucus), T5 (Aspergillus terreus), T7 (Penicillium sp. -01) y T8 (Penicillium sp. -02) no afectaron el CMR del patógeno, permitiendo que este se desarrollara de manera similar a como lo hizo en el tratamiento control (tabla 3). A. niger (T3) fue el microorganismo que más afectó la TCM de Phytophthora sp, registrando un valor medio de 0,28 cmdía-1 y siendo estadísticamente superior a los demás (p≤0,05), mientras que las cepas Penicillium sp. - 01 (T7), Aspergillus glaucus (T2) y Aspergillus terreus (T5) mostraron una baja incidencia sobre la restricción de la TCM de Phytophthora sp. (tabla 3).
Se plantea que el potencial antagónico que poseen algunas cepas de hongos hacia otros microorganismos, especialmente fitopatógenos, está dado por la capacidad que tiene el antagonista de colonizar y destruir parcial o totalmente las poblaciones del patógeno. Esta interacción se fundamenta en la biología de sobrevivencia y adaptación que posee la cepa antagónica en contraste con la susceptibilidad que presenta el patógeno [18], [21]. Lo anterior puede explicar lo evidenciado con Aspergillus niger (T3) y Trichoderma sp. (T9) frente la cepa de Phytophthora sp., donde mediante actividades antagónicas específicas lograron reducir significativamente el crecimiento del patógeno in uitro.
Los bajos valores de CMR y TCM presentados por Phytophthora sp. ante la acción de Aspergillus niger (T3) y Trichoderma sp. (T9), respecto a los demás hongos filamentosos, puede estar relacionado con una mayor actividad metabólica y reproductiva, así como una mejor adaptación ambiental de estas dos especies de microrganismos [22].
Respecto al grado de inhibición (GI) se ratificó la tendencia observada en las dos variables anteriores (CMR y TCM), siendo Trichoderma sp. (T9) y Aspergillus niger (T3) las cepas que ejercieron mejor capacidad antagónica al registrar una inhibición en el crecimiento de Phytophthora sp. del 74,36 y 70,52 %, respectivamente, comportándose estadísticamente iguales entre sí y diferente de los demás tratamientos (p<0,05) (figura 1).
Para el caso de los microrganismos con mayor GI, Trichoderma sp. (T9) y Aspergillus niger (T3), su comportamiento antagónico frente a Phytophthora sp., de acuerdo con las observaciones realizadas al microscopio en muestras de micelio de la región de interacción entre los dos microorganismos en cada tratamiento, se debió a micoparasitismo y competición directa por espacio y nutrientes, respectivamente, lo cual ha sido descrito en varias investigaciones de antagonismo in uitro [18], [21], [23]. En las observaciones microscópicas, las hifas de Trichoderma sp. (T9), caracterizadas por ser hialinas y con septos [12], colonizaron el soma y estructuras reproductivas del oomycete, reprimiendo, de esta manera, su crecimiento, mientras que, en el caso de Aspergillus niger (T3) se evidenció la formación de un soma denso, con un rápido crecimiento micelial y la generación de halos de inhibición sobre el medio de cultivo que restringieron el crecimiento de Phytophthora sp. en los platos Petri.
Los resultados encontrados en esta investigación con respecto a la actividad de la cepa de Trichoderma sp. frente a Phytophthora sp. (T9) muestran concordancia con los hallazgos de [24], quienes reportaron grados de inhibición similares, entre el 50 y 70 %, al enfrentar ocho aislados de Trichoderma frente a un aislado de Phytophthora, atribuyendo el antagonismo in vitro, principalmente, a la acción micoparasítica del antagonista. Asimismo, se ha reportado que las especies del género Trichoderma se caracterizan por tener una rápida velocidad de crecimiento micelial que puede afectar negativamente el crecimiento de cepas fitopatógenas cuando se exponen en cultivos duales [25].
Respecto a Aspergillus niger (T3), los resultados muestran concordancia con los aportes de [21], quienes al evaluar mediante enfrentamientos in vitro la acción de seis cepas del género Aspergillus (A. niger, A. nidulans, A. ocraceus, A. wentii-11 y A. wentii-22) frente a dos cepas de hongos fitopatógenos, encontraron que la inhibición antagónica ejercida por A. niger se debió a la competencia por nutrientes y espacio, tal como se observó en esta investigación.
Las investigaciones sobre Aspergillus niger como antagonista o biocontrolador de microbios patógenos han sido escasas [26], [27], [28], y un mayor número de estudios se han enfocado en evaluar el riesgo que puedan representar especies como estas, y en general del género Aspergillus, sobre la inocuidad de alimentos y la salud humana. En especial se resalta la capacidad de algunas especies de Aspergillus para producir aflatoxinas, un grupo de sustancias químicas que resultan tóxicas para varios grupos de seres vivos, entre ellos los mamíferos [29], [30]. Por lo anterior, la aplicabilidad de cepas de Aspergillus como agentes antagónicos sobre microrganismos perjudiciales en la actividad agrícola estará sujeta al desarrollo de investigaciones que demuestren, además de su eficiencia biológica como biocontrolador, su seguridad para el proceso productivo.
La prueba de la distancia de Gower y el método de agrupamiento jerárquico de Ward, aplicado a la interacción de las tres variables analizadas (CMR, TCM y GI), como medida del desempeño antagónico global, permitió la formación de tres conglomerados entre las nueve cepas evaluadas: C-I (Penicillium sp. - 01, Penicillium sp. - 02, Aspergillus glaucus, Aspergillus terreus y Aspergillus clauatus), C-II (Aspergillus nidulans y Paecilomyces variotii) y C-III (Trichoderma sp. y Aspergillus niger), con un coeficiente de correlación cofenética de 0,96 (figura 2). Esto indica la existencia de similitudes y diferencias entre algunos aislamientos por su capacidad controladora frente a Phytophthora sp.
El C-I representa a los morfotipos con un bajo a nulo GI sobre Phytophthora sp., es decir, inferior al 38 %, con TCM inferiores a 1 cmdía-1 y que permitieron el mayor CMR de Phytophthora sp., siendo igual al testigo (T10) en algunos casos. El C-II está formado por cepas con un nivel medio de GI sobre Phytophthora sp., o sea, mayor que 38 % pero menor que 70 %, con TCM entre 1 y 2 cmdía-1 y reduciendo entre un 40 a 50 % el CMR de Phytophthora sp. respecto al control. El C-III representa a los morfotipos que mostraron un alto GI sobre Phytophthora sp., es decir, superior al 70 %, con TCM mayores que 2 cmdía-1 y restringiendo el CMR de Phytophthora sp. hasta en 90 % con respecto al testigo (T10).
Estos resultados permiten enfocar esfuerzos y direccionar futuras investigaciones en evaluar la capacidad antagónica de las cepas agrupadas en los conglomerados más sobresalientes, C-I y C-II, sobre su efecto en otros microrganismos fitopatógenos, en condiciones in uitro, estudiando diferentes tipos de medios de cultivo, y a nivel de campo en condiciones semicontroladas.
Las cepas de Trichoderma sp. y Aspergillus niger ofrecen potencial como antagonista de Phytophthora sp., mostrando actividad antagónica micoparasitica y de competencia sobre el oomycete.
Trichoderma sp. y Aspergillus niger se perfilan como agentes promisorios para el control de la pudrición del cogollo en cultivos de palma aceitera de la región norte de Colombia.
Es necesario estudiar la naturaleza de las interacciones microbiales y los diferentes factores que permitan niveles más satisfactorios de colonización de los antagonistas frente a Phytophthora sp.
Al Departamento Administrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación (Colciencias), actualmente Ministerio de Ciencia Tecnología e Innouación (Minciencias), por el finan-ciamiento. Al laboratorio de Fitopatología de la Universidad del Magdalena por el apoyo técnico e insumos suministrados.
Correspondencia: Alberto Rafael Páez Redondo. Universidad Del Magdalena, Carrera 32 No. 22 - 08 Sector San Pedro Alejandrino, Santa Marta, Colombia. Teléfono: (605) 42l7940 y (605) 438l000. apaez@unimagdalena.edu.co
