Resumen: Esta revisión ofrece una visión general sobre reportes de evaluación de la actividad biológica in vitro de extractos vegetales sobre hongos fitopatógenos. Se presentan los métodos experimentales para la obtención de extractos vegetales y la caracterización de metabolitos, así como los métodos de inhibición del hongo mediante macro y micrométodos. Por último, se presentan las recomendaciones para clasificar la potencialidad de un extracto vegetal sobre un hongo fitopatógeno con el fin de establecer un enfoque prometedor para el descubrimiento de nuevos agentes antifúngicos en el control etológico y manejo integrado de hongos.
Palabras clave:hongos fitopatógenoshongos fitopatógenos,extractos vegetalesextractos vegetales,metabolitosmetabolitos,antifúngicosantifúngicos.
Abstract: This review offers an overview of reports evaluating the in vitro biological activity of plant extracts on pathogenic fungi. We present the experimental methods for obtaining plant extracts and the characterization of metabolites, as well as the methods of inhibition of the fungus by means of macro and micro methods. Finally, we present the recommendations to classify the potentiality of a plant extract on a pathogenic fungus, in order to establish a promising approach for the discovery of new antifungal agents for the ethological control and integrated management of phytopathogenic fungi.
Keywords: phytopathogenic fungi, plant extracts, metabolites, antifungal.
Revisión
Fungicidas a partir de extractos vegetales: una alternativa en el manejo integrado de hongos fitopatógenos
Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria
Recepción: 22 Noviembre 2017
Aprobación: 06 Julio 2018
Publicación: 13 Marzo 2019
Durante los últimos años, los sistemas agrícolas se han visto afectados por el uso de agroquímicos para controlar el ataque de malezas, plagas y enfermedades, lo que ha generado graves problemas sobre la salud humana y de carácter ambiental; entre estos problemas, se cita la reducción de la biodiversidad como uno de los más importantes, seguido de la pérdida en la salud del suelo (Gan y Wickings, 2017). Este tipo de agricultura cada vez es más insostenible debido a la presión ejercida por otro tipo de prácticas y manejos con enfoques sostenibles, mercados diferenciados y exigentes, los cuales a través de organismos reguladores hacen cumplir estándares de producción específicos, además de que existe un creciente problema de resistencia a los plaguicidas que están forzando a la industria a buscar alternativas diferentes de manejo (Gavrilescu y Chisti, 2015; Shahid et al., 2017).
Algunos autores señalan que las pérdidas directas en rendimiento en productos agrícolas causadas por patógenos, animales y malezas oscilan entre el 20% y el 40%; mientras que otros estiman que al discriminar por continentes las pérdidas pueden variar entre el 29% y el 43% (Castaño-Zapata, 2015). Aunque las cifras anteriores corresponden a intervalos muy amplios, en general los autores citan que existen otras pérdidas tanto directas como indirectas las cuales hacen que estos porcentajes pueden ser más elevados cuando se contempla todo el sistema productivo y sus interacciones; algunas son, por ejemplo, la pérdida en calidad del producto final, infestación del suelo, pérdidas y producción de toxinas en poscosecha por parte de algunos patógenos presentes en productos almacenados, incrementos en costos de producción, de manejo e incluso la predisposición de las plantas a otras enfermedades (Savary et al., 2012).
Entre los hongos y oomycetos fitopatógenos más significativos tanto en pre como en poscosecha en distintos cultivos se encuentran algunos géneros como Botrytis, Puccinia, Rhizoctonia, Cladosporium, Fusarium, Colletotrichum, Aspergillus, Penicillium, Alternaria, Mycosphaerella, Hemileia, Tilletia, Ceratocystis, Cochliobolus, Sclerotium, Sclerotinia, Erysiphe, Sphaerotheca, Phytium, Plasmopara, Peronospora, Phytophthora, entre otros (Hosni et al., 2013; Castaño-Zapata, 2015); y durante los últimos años, los fungicidas de síntesis han sido una de las estrategias más utilizadas por los agricultores para controlar las enfermedades causadas por estos; los más comunes en su composición química son compuestos fosforados, clorados, carbamatos, nitroderivados y derivados aromáticos (Martínez-Romero et al., 2008; Cantrell et al., 2012). Sin embargo, en los últimos años el uso de fungicidas de síntesis química ha aumentado la preocupación del consumidor y se ha visto cómo su uso es cada vez más restrictivo debido a efectos carcinógenos, problemas de toxicidad residual, contaminación ambiental como disminución de la biodiversidad y contaminación del suelo y aparición de resistencia microbiana. No obstante, estos productos no garantizan la exitosa erradicación del agente etiológico, dado que pequeñas poblaciones del patógeno pueden sobrevivir por diferentes razones como: aplicaciones deficientes o inadecuadas del fungicida, resistencia, individuos de la población que son menos sensibles y que no pueden ser controlados, o inóculos procedentes de cultivos vecinos, por lo que hoy en día se ha requerido nuevas alternativas de manejo que sean amigables con el ambiente para controlar los microorganismos fitopatógenos (Koul et al., 2008; Kavitha y Satish, 2011; Céspedes et al., 2014).
En la actualidad, nuevas iniciativas y tendencias tecnológicas se están presentando en el desarrollo de bioinsumos como bioinsecticidas, bioherbicidas, bioacaricidas, bionematicidas y biofungicidas; estas alternativas incluyen estimulantes de la defensa en las plantas, técnicas de control biológico y derivados de productos naturales obtenidos a partir de plantas y microorganismos (Sharma y Malik, 2012; Isman y Grieneisen, 2014; Ordanza-Beneitez, 2017). Para el control y la conservación biológica de los cultivos se están empleado este tipo de bioinsumos, los cuales son eficaces cuando existe una comprensión del agroecosistema y sus limitaciones. Gran variedad de investigaciones se centra en estudios sobre la formulación de productos naturales con algún tipo de actividad biológica sobre hongos fitopatógenos con una eficacia y una acción cada vez mayor y más rápida, lo que está generando que estas prácticas sean más eficaces en un amplio rango de condiciones ambientales, de especies de plagas y de sistemas de cultivos (Adekambi et al., 2010; Gakuya et al., 2013). Debido a lo anterior, la EPA (Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos) tiene en sus registros información donde claramente se ha demostrado que los productos naturales juegan un papel importante en el descubrimiento y desarrollo de nuevos productos y cada vez más, se reconoce la importancia de las especies vegetales y sus derivados (extractos, aceites esenciales, decocciones, metabolitos secundarios) en la protección de cultivos bajo el concepto del Manejo Integrado de Plagas y Enfermedades (MIPE) (U.S. EPA (a,b); Cantrell et al., 2012; Leahy et al., 2014; Sparks et al., 2017).
El objetivo de la presente revisión es exhibir el avance en el desarrollo de fungicidas a partir de extractos y aceites esenciales obtenidos de especies vegetales y evaluados in vitro contra hongos fitopatógenos como un paso inicial al desarrollo de las alternativas tecnológicas prometedoras en el uso de bioproductos disponibles a partir de plantas. Estos potenciales productos pueden retardar la reproducción de microorganismos indeseables, y sería un método realista y ecológicamente sólido para la protección de los cultivos transitorios o temporales, lo que permitiría sustituir con éxito a los agroquímicos de síntesis, sin las restricciones de uso que distingue a los productos sintéticos.
La tendencia mundial muestra que el uso de las plantas y los derivados obtenidos a partir de estas está aumentando de manera considerable en el control de plagas y enfermedades importantes (Cavaliere et al., 2008). El conocimiento tradicional expresa la necesidad de trabajar en la búsqueda de nuevas opciones terapéuticas a partir de plantas reconocidas (Cordell, 2000). Las plantas tienen la capacidad de sintetizar una gran diversidad de metabolitos secundarios relacionados con diferentes mecanismos de defensa, entre los que se encuentran compuestos químicos como terpenos, fenoles, compuestos nitrogenados como alcaloides y compuestos azufrados, muchos de estos con propiedades antimicrobianas. Estos metabolitos tienen una función importante en la protección ante depredadores, microorganismos patógenos y herbívoros, así como diversos tipos de estrés abiótico (por ejemplo, exposición UV) (Cowan, 1999; Ávalos-García y Carril, 2009). Durante los últimos años, se ha evidenciado que las plantas tienen funciones biológicas y químicas de defensa, por lo que gran variedad de estos compuestos pueden tener actividad biológica sobre hongos (Mazid et al., 2011; Saravanakumar et al., 2015).
Por ejemplo, los terpenos (mono, sequi, di, tri y politerpenos) participan en la defensa de las plantas como toxinas y elementos de disuasión de la alimentación de una gran cantidad de insectos y mamíferos, se postula que actúan disminuyendo la permeabilidad de membrana celular, causando una drástica reducción en el número de mitocondrias y las vesículas generadas en el complejo de Golgi, lo que perjudica la respiración y el trafico vesicular. Compuestos de tipo fenólico como las cumarinas, ligninas, flavonoides y taninos están presentes en el sistema de defensa de las plantas mediante la modificación de tejidos o pared celular proporcionando dureza o rigidez a estos, toxinas capaces de unirse a proteínas que actúan como repelentes, la inhibición enzimática por oxidación, algunas implicadas en procesos de transcripción y reparación del ADN, generando muerte celular. Los compuestos azufrados como GSH, GSL, fitoalexinas, tioninas, tienen una directa o indirecta relación con los mecanismos de defensa de las plantas contra patógenos microbianos y los compuestos nitrogenados en los que se incluyen alcaloides, glucósidos cianogénicos, y aminoácidos no proteicos que se sintetizan a partir de aminoácidos comunes, se postula que se intercalan en el DNA debido a su papel en la defensa contra los herbívoros y toxicidad sobre microorganismos (Gershenzon y Croteau, 1992; Dixon y Paiva, 1995; Kuc, 1995; Cowan, 1999; Dixon, 2001; Wuyts et al., 2006; Ávalos-García y Carril, 2009; Chong et al., 2009; Saravanakumar et al., 2015).
El proceso para obtener extractos vegetales es variable, todos estos componentes se obtienen en conjunto cuando se extraen de los diferentes órganos tanto vegetativos como reproductivos, tales como raíces, hojas, brotes, tallos, flores y frutos previamente triturados con un tamaño de partícula determinado y en contacto con cantidad suficiente de solvente. Entre las técnicas de extracción se encuentra la percolación, el arrastre con vapor, en la extracción soxhlet se emplean distintos solventes donde se pueden obtener extractos acuosos, etanólicos, aceites esenciales o utilizar otros solventes para obtener diversos compuestos, acorde a su polaridad. Posterior a la extracción, la mezcla es filtrada, el material insoluble es lavado con el mismo solvente y los filtrados se mezclan para concentrar el extracto, y secarlos hasta sequedad. Según el tipo de método empleado se pueden presentar altos rendimientos de extracción y presentar una versatilidad en la separación de componentes por sus características polares, además de poder obtener extractos para el fraccionamiento y aislamiento de las sustancias marcadoras que son separadas por técnicas de cromatografías que permiten aislar los componentes principales a través de métodos de fraccionamiento guiado por bioensayo y técnicas de alta resolución para su caracterización como la cromatografía de alta resolución acoplada a espectrofotometría de masas (HPLC-DAD-MS) y la resonancia magnética nuclear (RMN) (Maldoni, 1991; García et al., 1995; Pardo et al., 2011; Mesa-Vanegas et al., 2015).
A los extractos vegetales y compuestos obtenidos se les evalúa su potencial biológico en los diferentes modelos biológicos a nivel in vitro e in vivo. En su mayoría los métodos de evaluación biológica sobre hongos fitopatógenos consisten en la exposición del hongo a diferentes concentraciones de extracto en medio agar papa dextrosa (PDA) (Nene, 2002; Castillo et al., 2010). Los macrométodos generalmente son basados en el análisis de difusión en disco en agar determinando el halo de inhibición en presencia de una concentración determinada del extracto vegetal y empleando como control positivo un fungicida agrícola sistémico. Otro de los métodos comúnmente empleados es el envenenamiento del medio de cultivo en el cual se adiciona una concentración conocida de extracto disuelta en el medio de cultivo junto con un testigo absoluto y posteriormente se adiciona el inóculo del patógeno para evaluar. Los micrométodos permiten determinar la concentración mínima inhibitoria (MIC) de un extracto mediante microplatos estériles, el crecimiento del patógeno se sigue por la variación de la densidad óptica (DO) de una suspensión de esporas de cada uno de los hongos en una concentración aproximada de 2,5x104 esporas/mL y se realiza la lectura inicial a los 30 minutos y pasadas las 48 horas a 25 °C. Múltiples reportes en la literatura expresan la acción de un extracto vegetal sobre hongos fitopatógenos con una estimulación biológica hasta una inhibición total (García et al., 1995; Rojas et al., 2005; Pardo et al., 2011).
La actividad biológica de un extracto con respecto a un hongo varía en función de la metodología de preparación (solvente, seco, fresco, tiempo de almacenamiento, etc.), especie botánica, órgano de la planta (raíces, hojas, semillas, etc.), fecha de cosecha, entre otras. Singh (2014) y De Alameida et al. (2016) reportaron que hasta la fecha se habían explorado más de 6.000 especies de plantas y más de 2.500 especies de estas (pertenecientes a 235 familias) poseían actividad biológica contra algún tipo de plaga y enfermedad; así mismo, este número es bajo conforme se analiza la diversidad total de plantas en el planeta, por lo que algunos autores sugieren que entre el 1 y 10% de las plantas descubiertas y evaluadas tienen un potencial de producir metabolitos secundarios biológicamente activos contra plagas y enfermedades (Benner, 1993; Prakash y Rao, 1997; Singh, 2000; Koul y Walia, 2009; Bettiol et al., 2014; Jeyalakshmi et al., 2015).
En la tabla 1 se presentan los reportes encontrados en las distintas bases de datos (Science Direct, PUBMED, Scielo; consultadas en noviembre 2017), libros especializados y demás reportes bibliográficos relacionados con distintas especies de plantas con actividad inhibitoria sobre los diferentes fitopatógenos específicamente de los géneros Botrytis, Rhizoctonia, Cladosporium, Fusarium, Colletotrichum, Aspergillus, Penicillium, Gaeumannomyces, Helminthosporium, Septoria, Alternaria, Phytophthora, Pyricularia, y las concentraciones inhibitorias con sus efectos obtenidos.
Tabla 1 parte 1
Especies vegetales con actividad biológica sobre hongos fitopatógenos.
*Actividad biológica sobre la esporulación del hongo in vitro.
Tabla 1 parte 2
Tabla 2
Clasificación de actividad biológica sobre hongos fitopatógenos.
Entre las especies de vegetales más reconocidas por sus propiedades plaguicidas se encuentra el Neem (Azadirachta indica A. Jussieu, Meliaceae), el cual se ha utilizado ampliamente contra una serie de especies de plagas (Gahukar, 2014; Jeyalakshmi et al., 2015), al igual que cinnamon (Cinnamomum zeylanicum Blume), orégano (Origanum vulgare L.) (García-Camarillo et al., 2006), tabaco (Nicotiana tabacum L.), crisantemo (Chrysanthemum cinense Sabine), flor de muerto (Tagetes erecta L.) (Granada, 2002). La actividad fungistática de muchas especies vegetales difiere entre los tipos de extractos acuosos, etanólicos, metanólicos y aceites esenciales, lo que se ha comprobado por varios investigadores es el marcado efecto de los aceites esenciales sobre patógenos, dado que en gran parte los resultados son favorables en varios agentes patógenos con un efecto selectivo que depende de la especie de planta y del patógeno (Singh, 2014).
La evaluación de extractos vegetales sobre la inhibición de patógenos a nivel in vitro es la primera fase que indica el potencial prometedor de una planta para ser usada en tratamientos pre y poscosecha. La mayor parte de los estudios son básicos y solo se reporta la concentración en la cual se presenta un efecto inhibitorio, sin embargo es necesario indagar sobre el efecto de los extractos vegetales en aspectos moleculares, bioquímicos, morfológicos del hospedero y del patógeno para conocer el modo y mecanismo de acción, el efecto toxicológico y así determinar cuáles son los compuestos responsables de la actividad antifúngica y de esta manera aislar e identificar los compuestos activos y los cambios moleculares, morfológicos y bioquímicos que estos compuestos causan sobre el patógeno. A pesar de los múltiples reportes aún no existe un consenso en las concentraciones de evaluación que permitan clasificar la respuesta biológica en activos e inactivos, lo que conlleva a que no haya un rango de concentraciones definido entre autores para clasificar un extracto vegetal como antifúngico promisorio. De acuerdo a una exhaustiva revisión en la literatura se recomienda establecer un consenso de clasificación según el efecto del extracto como: activo, moderadamente activo, ligeramente activo e inocuo, según la tabla 2.
La rigurosidad en las técnicas de evaluación in vitro permitirá clasificar el potencial de extractos vegetales como un punto de partida en el desarrollo de productos cuyo principio activo es un extracto vegetal y que podría tener la propiedad de contribuir a aminorar los costos de producción de los agricultores debido a que se biodegradan rápidamente, no contaminan el ambiente y presentan un bajo costo. De esta manera el desarrollo de biofungicidas requiere equipos multidisciplinarios para optimizar la producción, la eficacia, el almacenamiento y la estabilidad de un producto para que esta tecnología pueda evolucionar y satisfacer las demandas agrícolas de hoy en día.
Los autores agradecen el apoyo financiero de Colciencias del proyecto código: 111577657130 y a la Universidad de Antioquia.
Tabla 1 parte 1
Especies vegetales con actividad biológica sobre hongos fitopatógenos.
*Actividad biológica sobre la esporulación del hongo in vitro.
Tabla 1 parte 2
Tabla 2
Clasificación de actividad biológica sobre hongos fitopatógenos.
