Identificación del origen genético de un rodal semillero implantado de Nothofagus obliqua a través del análisis de dos regiones intergénicas de ADN de cloroplasto

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En planes de forestación, tanto con fines productivos como de conservación, la correcta elección de la fuente de semilla para utilizar es un factor clave. La semilla no solo debe presentar un alto potencial de adaptación al sitio de implantación, sino también garantizar el menor impacto de cambio sobre la diversidad genética de las poblaciones naturales locales o adyacentes. A los fines de desarrollar una silvicultura sustentable, muchos países han comenzado a reconocer la importancia del origen del material de propagación, tanto para acciones de plantación productiva o de restauración como también de control comercial. Para ello se han creado regulaciones que implementan procesos de trazabilidad, donde los análisis a partir de marcadores moleculares cobran cada vez mayor relevancia. Por ejemplo, Alemania implementó dos sistemas para dar trazabilidad al material de propagación en especies forestales, que incluyen la determinación del origen con base en análisis moleculares, en distintas etapas del proceso desde la colecta de la semilla hasta la producción de plantines en vivero (Finkeldey et al., 2010).

En restauración ecosistémica se promueve desde la literatura el uso de la fuente local de semilla (ej. Mc Kay et al., 2005), ya que en general esa estrategia ha presentado mejores resultados (Vander Mijnsbrugge et al., 2009). La demanda de adaptación del material vegetal a nuevas condiciones del sitio que impone el cambio climático abre interrogantes en relación con este paradigma. Broadhurst et al. (2008) proponen la inclusión de procedencias adicionales a la local, con el fin de aumentar la variación genética del germoplasma y así maximizar el potencial de adaptación de la población implantada. En esta línea, y sobre todo cuando no es posible cosechar semilla local como material para realizar la intervención, el concepto de “zona genética” (ZG) adquiere relevancia.

Una ZG se define por contener un acervo genético homogéneo y por lo tanto, cada una de las poblaciones que la conforman resultan fuentes de semilla apropiadas para intervenir dentro de la propia ZG. Para su definición se utiliza información genética obtenida con distintos marcadores moleculares, como regiones del ADN de cloroplasto (cpADN) (ej. Bucci y Vendramin, 2000), regiones microsatélites (ej. Honjo et al., 2009), isoenzimas (ej. Pastorino y Gallo, 2009), así como combinaciones entre dichos marcadores (ej. González Martínez et al., 2004; Azpilicueta et al., 2013; Soliani et al., 2017). Por ser el cpADN una molécula de herencia clonal y uniparental (ej. se transmite de una generación a la siguiente sin mediar la recombinación de genes), representa una herramienta de gran utilidad en la definición de grandes grupos de poblaciones con un acervo genético en común. En la mayoría de las angiospermas, este marcador posibilita la identificación de linajes (ej. Marchelli et al., 1998; Marchelli y Gallo, 2006; Soliani et al., 2012) por herencia materna (Harris y Ingram, 1991).

El conocimiento del patrón de diversidad genética natural de una especie, más aún si incluye inferencias filogeográfícas, es clave para identificar el origen de un material vegetal. Este conocimiento posibilita comparar la genética de un material de origen desconocido con la de grupos de poblaciones con un patrón genético modelado por la historia evolutiva de la especie, incluyendo procesos de flujo génico y deriva génica, así como también efectos antrópicos, entre otros. Las finalidades de identificar el origen desconocido de un material vegetal (vivo o no) pueden ser diferentes. Así, Lowe et al. (2004) identifican el origen autóctono o introducido de los bosques de roble en Gran Bretaña, con base en un estudio previo de reconstrucción de historia glaciaria en esa región basado en el análisis de su cpADN (Cottrell et al., 2002). Asimismo, Deguilloux et al. (2004) demuestran la posibilidad de determinar el origen de la madera usada para la fabricación de toneles de vino en bodegas francesas, a partir de un extenso estudio de variación genética a nivel del cpADN de las poblaciones de distribución europea de roble (Petit et al., 2002).

El roble pellín, Nothofagus obliqua Mirb. (Oerst.), es una especie decidua, anemófila y anemocórica de los bosques templados andino patagónicos de Argentina. Sus poblaciones se extienden desde los 36° 40’ S en las Lagunas de Epulauquen hasta los 40° 11’ S en la costa sur del lago Lácar, en el Parque Nacional Lanín (Sabatier et al., 2011). Es una especie de importancia ecológica y económica dada la calidad de su madera. Si bien su cultivo aún es muy incipiente, los conocimientos generados para su domesticación (Donoso et al., 2004, 2006; Azpilicueta et al., 2010) alientan a posicionarla como una opción productiva forestal en la diversificación de la actividad en la región, mayormente enfocada en la producción de especies de rápido crecimiento como el pino ponderosa (Pinus ponderosa) y el pino oregón (Pseudotsuga menziesii).

El cpADN de N. obliqua fue secuenciado y descripto por El Mujtar et al. (2014), y además se estudió su variación a nivel poblacional (Azpilicueta et al., 2009). La identificación de dos linajes maternos principales en los bosques argentinos de N. obliqua posibilitó la definición de dos grandes áreas latitudinales con una identidad genética distintiva (Azpilicueta et al., 2009). Mediante el análisis de cpADN los bosques argentinos de N. obliqua fueron ordenados genéticamente según dos grandes linajes maternos, separados latitudinalmente al norte y sur del volcán Lanín (39° 40′ S), conformados respectivamente por dos y tres haplotipos de cpADN en diferentes frecuencias. A su vez, la información generada con marcadores nucleares polimórficos permitió la distinción de tres Zonas Genéticas dentro de estas grandes áreas (tabla 1) (Azpilicueta et al. 2009, Azpilicueta et al., 2013, Azpilicueta et al., 2017).

Con el fin de contar con rodales proveedores de semilla de N. obliqua en Argentina existen áreas productoras de semilla (APS) inscriptas en el Instituto Nacional de Semillas en Argentina (INASE) para los dos grandes linajes definidos en la especie. Por una parte, el APS “Lagunas de Epulauquen” (código de inscripción 18Q7334KNo) fue inscripta en 2010 por la Dirección Provincial de Áreas Naturales Protegidas de Neuquén y conforma una fuente de semilla adecuada para acciones de restauración y enriquecimiento de la ZG 1 (linaje norte). Por otra parte, el APS “Yuco Alto”, en el Parque Nacional Lanín fue inscripta en 2008 por el INTA (código 11Q5513KNo) y conforma una fuente de semilla segura para acciones de plantación en los bosques de la ZG 3 (linaje sur). Recientemente (2017) se ha realizado una incorporación como APS de un rodal de N. obliqua plantado en 1997 en dependencias del INTA, en la Estación Agroforestal Trevelin (EAFT). Esta APS “Trevelin” de 2,35 ha (y de aproximadamente 1200 individuos), inscripta en el INASE por la Asociación Cooperadora de INTA Esquel (código de inscripción 26U7519JL) está conformada por plantas cuyo origen correspondió a una mezcla de proporciones desconocidas de dos fuentes:

1) Origen y procedencia bosque natural del paraje Hua Hum, Parque Nacional Lanín correspondiente a la ZG 3, dentro del linaje sur (haplotipo i en tabla 1).

2) Procedencia EAFT, de origen desconocido. En este caso se trata de un rodal de menos de 0,10 ha implantado en el año 1956 en el vivero de la EAFT, que a los 50 años tenía una altura media de 31,9 m. Este rodal ha sido raleado fuertemente y hoy se mantienen en pie unos 20 árboles, que actúan como cortina cortavientos.

La falta de identificación del origen de una proporción de los individuos que conforman esta APS genera dudas respecto del alcance de la utilización de su semilla. Para plantaciones fuera del área de distribución de la especie, su utilización está prescripta, asumiendo que exista una buena adaptación de este germoplasma al ambiente de cultivo. Pero para acciones de restauración o enriquecimiento de bosques dentro del rango natural de distribución de N. obliqua, no se podría promover su utilización. Este trabajo tiene el objetivo de avanzar en la identificación del origen de los árboles de esta APS. Esto posibilitaría ampliar la prescripción sobre el uso y aplicación de esta APS. Como el presente estudio se basó en análisis de secuencias, la homologación entre resultados de esta técnica y la usada anteriormente para establecer los haplotipos de referencia (técnica PCR-RFLP) se constituyó en un objetivo secundario en este trabajo.

Se cosecharon yemas de invierno de 12 individuos que conforman una cortina de 20 individuos en pie de N. obliqua (procedencia EAFT). De estas se extrajo ADN según el protocolo descripto en Dumolin et al. (1995), con modificaciones según Marchelli y Gallo (2006). En el caso de los controles se recurrió a muestras de ADN conservadas a -80 ºC en el Laboratorio de Genética Molecular del INTA Bariloche. El ADN se chequeó en gel de agarosa al 0,8% para cuantificarlo y conocer su calidad.

Se analizaron dos regiones intergénicas de cloroplasto: trn-D y trn-T (Demesure et al., 1995) y ath-H y atp-i (Grivet et al., 2001). El análisis de estas dos regiones es suficiente para identificar todos los haplotipos hallados en Argentina (Azpilicueta et al., 2009). Existe una excepción en el caso del haplotipo exclusivo xiii hallado en baja frecuencia (y junto al haplotipo mayoritario i) en una población de la cuenca Lácar identificada como linaje sur, pero que conforma la misma zona genética (ZG 3) que el resto de las poblaciones de la cuenca. La distinción entre ambos haplotipos se basa en el análisis de la región intergénica trnF-trnV de 3000 pb, que no fue analizada en el presente estudio por no considerarlo necesario según el objetivo planteado. Como controles se tomaron individuos que representan los haplotipos previamente hallados en la distribución de la especie (Azpilicueta et al., 2009) como se muestra en la tabla 1. La amplificación de los fragmentos se realizó con los protocolos descriptos en Azpilicueta et al. (2009) para cada primer. El producto de amplificación purificado con método de precipitación en acetato de sodio e isopropanol se chequeó y cuantificó en gel de agarosa al 1,2%. La secuenciación de los fragmentos se realizó en un equipo ABI 3730 XL DNA Analyzer (Applied Biosystems) en el Servicio de Secuenciación y Genotipado del Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias (CNIA, INTA).

Para la edición y el alineamiento de las secuencias se utilizaron los programas Bioedit v.7.0.5.3 y Aliview (Larsson, 2014). El programa Network (www.fluxus-engineering.com) se utilizó para la construcción de la red de haplotipos a partir de un algoritmo de median joining. La definición de cada haplotipo se basa en la combinación de los polimorfismos obtenidos en cada región del ADN de cloroplasto analizada. Se homologaron los resultados de la técnica anterior (PCR-RFLP) con los datos de la secuenciación actual analizando cada fragmento por separado.

Tabla 1

Linajes maternos identificados para las regiones intergénicas de ADN de cloroplasto trn-D trn-T y atp-H atp-I en la distribución argentina de Nothofagus obliqua; zonas genéticas (ZG) definidas y haplotipos que los conforman según la técnica de PCR-RFLP en análisis previos (Azpilicueta et al., 2009, 2013). Entre paréntesis se indica el número de individuos controles utilizados.

Referencias: ZG: zona genética; la codificación de los fragmentos de restricción se realizó según su peso molecular (Azpilicueta et al., 2009).

Análisis de la región inter-génica trn-D/trn-T

La longitud del fragmento trn-D/trn-T secuenciado es de 960 pb, similar al tamaño reportado para la especie en aproximadamente 1000 pb (Azpilicueta et al., 2009). Tomando los controles analizados se detectaron tres secuencias diferentes que se correspondieron con las variantes halladas en los haplotipos I/XIII, II-IV para este fragmento (Azpilicueta et al., 2009). Las 12 muestras problema (procedencia EAFT) mostraron una misma y única secuencia, coincidente con la hallada para el haplotipo i/xiii (figura 1).

Figura 1

Polimorfismos detectados en cada una de las regiones intergénicas de ADN de cloroplasto analizadas (trn-D/trn-T y atp-H/atp-I). Se muestran los controles (haplotipos i/xiii, ii, iv, xiv) e individuos de la procedencia EAFT (que corresponden a las secuencias de los individuos 1 al 12) analizados. Referencias: A: adenina, T: timina, C: citosina, G: guanina, -: deleción.

Análisis de la región inter-génica atp-H/atp-I

El tamaño del fragmento secuenciado de la región intergénica atp-H/atp-I fue de 823 pb, similar al estimado para el producto de amplificación en la técnica PCR-RFLP en 800 pb (Azpilicueta et al., 2009). Los controles de los haplotipos i, ii y xiv mostraron una única variante como era esperable según análisis previos. Mientras que los controles del haplotipo iv mostraron una inserción de 16 pb en relación con la otra variante hallada (para el resto de los haplotipos). Los 12 individuos problema (EAFT) mostraron la misma secuencia de los controles de la variante de los haplotipos I/XIII, ii y xiv (figura 1). A partir del análisis de esta región se descarta al haplotipo iv (Lagunas de Epulauquen) como origen del rodal con procedencia EAFT.

Análisis a nivel de haplotipo (combinación de las regiones intergénicas trn-D/trn-T y atp-H/atp-I)

A partir del análisis combinado de las dos regiones intergénicas estudiadas en el presente trabajo, con una longitud de fragmento de 1783 pb, se construyó la red de haplotipos. Las 12 muestras problema (procedencia EAFT) mostraron el haplotipo i/xiii (linaje sur). La relación entre los haplotipos según la cantidad de pasos mutacionales se muestra en la figura 2. Los cuatro haplotipos control se representaron con un solo (1) individuo, respectivamente.

Figura 2

Red de haplotipos construida a partir del análisis conjunto de las dos regiones intergénicas de ADN de cloroplasto trn-D/trn-T y atp-H/atp-i. El diámetro de los círculos es proporcional a la cantidad de individuos que presentaron ese haplotipo. Los haplotipos control se representaron con un único individuo, mientras que se incluyeron en el análisis los 12 individuos problema. Se muestran los pasos mutacionales entre los distintos haplotipos hallados; el indel de 16 pb se resalta con rojo.

El haplotipo i/xiii hallado en las muestras problemas (procedencia EAFT) permite inferir al linaje sur (cuenca Lácar) de N. obliqua en Argentina como su origen. Como a su vez la fracción de árboles de origen conocido de la APS “Trevelin” también corresponde al linaje sur (población Hua Hum, cuenca Lácar), la semilla producida por el APS podría ser utilizada en acciones de restauración dentro de la cuenca Lácar.

Es probable que los plantines utilizados para establecer la procedencia EAFT, implantada en 1956, hayan sido provistos por el vivero ubicado en la Estación Forestal en Puerto Anchorena, Isla Victoria, ya que en aquella época era un centro de provisión de plantines de especies leñosas a escala utilizados en la región. Lamentablemente no se consigna en esos registros el origen utilizado (fuente consultada Boletín Forestal, Estación Forestal Puerto Anchorena, isla Victoria, 1942), lo que nos habría permitido contar con un mejor indicio del probable origen de la procedencia EAFT. Sin embargo, consideramos altamente probable que en aquella época se utilizara semilla proveniente del Parque Nacional Lanín, creado en 1937, dada la fácil disponibilidad de estas en diversos bosques, como por ejemplo en los alrededores de San Martín de los Andes.

Adicionalmente a este resultado, se pudieron establecer asociaciones directas entre los haplotipos hallados por la técnica de PCR-RFLP (utilizada en estudios previos) y la secuenciación (utilizada en el presente estudio) para ambas regiones intergénicas del ADN de cloroplasto analizadas, lo que permitirá continuar usando el método de secuenciación en futuros análisis sin perder la homología con la información obtenida por medio del método más antiguo.

El presente estudio fue financiado con fondos del proyecto PNFOR1104063 “Mejoramiento Genético de Especies Forestales Nativas para Usos de Alto Valor” (Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria). Queremos agradecer a Ana Delia Torres quien ayudó gentilmente en la recolección de las muestras en la EAFT INTA Esquel, y a Teresa Schinelli, Lidia Lugano, Santiago Quiroga y Adolfo Moretti por su apoyo en la búsqueda de información sobre el origen de la cortina de robles en la EAFT, INTA Esquel.