Estudio exploratorio sobre Mycoplasma hyopneumoniae en granjas porcinas del norte de la provincia de La Pampa, Argentina, utilizando PCR como metodología de diagnóstico

Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyopneumoniae) es el agente causal de la neumonía enzoótica porcina (NEP) y es el principal agente involucrado en el complejo respiratorio porcino (Maes et al., 2017; Thacker y Minion, 2012; Tamiozzo, et al., 2009). Las infecciones de M. hyopneumoniae son ampliamente distribuidas y conocidas en el mundo por las pérdidas económicas debido a los costos sanitarios, disminución del crecimiento y desarrollo de la piara y alta mortalidad causada por la asociación de agentes etiológicos secundarios (Maes et al., 2017; Holst et al., 2015; Clark, 1999).

La transmisión del agente ocurre por contacto directo entre animales que comparten el mismo corral, como también indirectamente mediante el contacto con aerosoles ambientales contaminados hasta 9,5 km de distancia (Otake et al., 2010). Los lechones al nacimiento son considerados libres de infección mientras que, su primer contacto con la bacteria ocurriría durante el periodo de la lactancia (Calsamiglia y Pijoan, 2000; Nathues et al., 2013). Ibarra et al. (2000) reconocen que la mayor incidencia clínica y patológica de la NEP se da en el rango de edades 20 y 50 kg PV. Se supone que estos animales colonizados tempranamente son la fuente de infección para animales de mayor edad (Nathues et al., 2013). El contagio de la bacteria en estas edades es de gran importancia en los sistemas de producción intensivos donde los animales se transfieren a instalaciones limpias para su terminación (Fano et al., 2007). La dinámica de infección del M. Hyopneumoniae es muy variable y depende de varios factores tales como el sistema de producción, presión de infección, condiciones de manejo y época del año (Segalés et al., 2012).

El monitoreo de la presencia de M. hyopneumoniae en cerdos vivos proporciona información útil sobre la dinámica de infección dentro de la piara, los factores influyentes y las estrategias de prevención y control empleadas correctamente (Fablet et al., 2010). El aislamiento de la bacteria es complicado debido a las exigencias de preparación del medio y de control para lograr el desarrollo de colonias. Además, la posibilidad de que otras especies contaminen el cultivo e impidan su crecimiento sería una restricción importante del método (Sibila, 2013). Fablet et al. (2010); Sibila et al. (2009); Thacker, (2006) han utilizado la técnica molecular PCR (reacción en cadena de la polimerasa) para la determinación de la presencia o no del ADN del M. hyopneumoniae en animales vivos.

En Argentina, estudios realizados por Tamiozzo et al. (2011) determinaron la presencia de varios genotipos de M. hyopneumoniae en diferentes granjas del país e incluso en animales de una misma granja. En la provincia de La Pampa hay un total de 145.000 cerdos de los cuales no existen registros de la existencia de la enfermedad, pero se presume su presencia por ser tan ubicua en el resto del país. El objetivo del presente trabajo fue realizar un estudio epidemiológico de campo para determinar la prevalencia de M. hyopneumoniae en granjas porcinas de la provincia de La Pampa.

Se seleccionaron al azar 20 establecimientos porcinos del norte de la provincia de La Pampa (figura 1). De acuerdo a May et al. (2012), fueron clasificados según la cantidad de cerdas reproductoras que integraban la actividad en criaderos semiintensivos o criaderos extensivos. Los establecimientos sumaron una existencia total de 5450 cerdos (272 cerdos/granjas). Se muestrearon aleatoriamente el 10% de los animales entre 20 y 50 kg PV de cada uno de los establecimientos, obteniendo un total de 218 muestras. Los hisopados nasales se tomaron utilizando hisopos con vástago de plástico (deltalab). Las muestras se colocaron en 3 ml de PBS. Fueron conservadas en un frezzer a -70 ºC hasta el momento de ser procesadas en el laboratorio molecular de la EEA del INTA Anguil.

Figura 1

Localización de las granjas muestreadas en el norte de la provincia de La Pampa.

La extracción de ADN se realizó a partir de 300 µl de muestra con un método tradicional con proteinasa k de acuerdo a lo descripto por Pulido et al. (2006). Se corroboró la concentración del ADN extraído utilizando un espectrofotómetro de nano volumen marca Denovix.

El PCR se realizó utilizando dos pares de cebadores para el gen ribosomal 16 S (16S rRNA) en el ADN del M. hyopneumoniae; los cebadores externos utilizados fueron los descriptos por Mattsson et al. (1995) y los iniciadores para la reacción interna fueron los reportados y utilizados por Calsamiglia et al. (1999). Las reacciones fueron llevadas a cabo de acuerdo a lo propuesto por Calsamiglia et al. (1999). La primera reacción amplificó un fragmento de 649 pb, y la segunda amplificó un fragmento de 352 pb (Pulido et al., 2006; Ruiz y Pijoan, 2002; Calsamiglia et al., 1999). El programa de ciclado fue establecido por Mattsson et al. (1995) y por Calsamiglia et al. (1999). Por último, los productos obtenidos en ambas reacciones fueron analizados por electroforesis en 1% de gel agarosa teñido con 5 µl de gel red. Se visualizó en transluminador de luz UV, Dyna Light Dual Intensity (Labnet). La siembra se realizó durante 80 min, 70 voltios. El control positivo fue donado por la Universidad Nacional de Río Cuarto.

El propósito de esta investigación fue generar información sobre M. hyopneumoniae en las granjas porcinas de la provincia de La Pampa bajo un estudio exploratorio de campo. Las muestras de hisopados nasales procesadas bajo la metodología utilizada arrojaron resultados negativos a la presencia de M. Hyopneumoniae.

Tamiozzo et al. (2011) determinaron la presencia de varios genotipos de M. hyopneumoniae en diferentes granjas de Argentina, e incluso en animales de una misma granja. Pero en los criaderos muestreados al azar en la provincia de La Pampa no se detectó la presencia del agente. Esta diferencia puede deberse a que Tamiozzo et al. (2011) muestrearon criaderos intensivos en zonas del país donde la distancia entre criaderos es inferior a 9,5 km entre sí, límite de distancia propicia para la diseminación de la enfermedad (Otake et al., 2012). A diferencia de Tamiozzo et al. (2011) las granjas muestreadas en el presente estudio se caracterizaron por ser sistemas semiintensivos y extensivos y estaban ubicadas en un radio superior al establecido por Otake et al. (2012).

Los resultados preliminares de este estudio concuerdan con Pulido et al. (2006) que no lograron determinar la presencia de M. hyopneumoniae a partir de hisopados nasales de cerdos de 20 a 50 kg de PV con la técnica de PCR, y aseguraron que el resultado se debía a la baja carga bacteriana de las muestras clínicas obtenidas. Estos resultados coinciden con el reporte de Pieters et al. (2017) quienes han demostrado que el diagnóstico por PCR tiene baja sensibilidad en muestras de hisopados nasales en comparación con muestras de lavajes bronquio traqueales. Sin embargo, Zeeh et al. (2008) reportan que la detección de M. hyopneumoniae por PCR se caracteriza por tener alta sensibilidad y arroja resultados positivos con poca carga bacteriana en la muestra. Por un lado, Nathues et al. (2012) lograron determinar la presencia de la bacteria por medio de PCR en hisopados de mucosa nasales de operarios de galpones de posdestete de granjas porcinas ubicadas en el norte-oeste de Alemania. Por otro lado, Pieters et al. (2014) correlacionaron los animales de 5 a 8 semanas de vida positivos con el porcentaje de cerdas positivas. La prevalencia a M. hyopneumoniae al destete aumentó con la edad del animal en los grupos donde al menos una cerda era positiva. En el presente estudio se remarca la necesidad de reforzar las muestras tomadas como también ampliar el rango de categorías animales muestreadas. Los resultados presentados se remiten solo a la metodología utilizada.

Los resultados obtenidos en este estudio brindan información preliminar al sector porcino de la provincia de La Pampa sobre la prevalencia de una enfermedad de importancia mundial para la producción porcina. Si bien, este estudio abarca un número limitado de muestras, remarca la necesidad de continuar con una investigación más exhaustiva en cuanto a categorías de animales y muestras tomadas.

Los autores de esta comunicación agradecen a los productores porcinos del norte de la provincia de La Pampa por su colaboración en la realización de los muestreos del estudio.