Primer aislamiento de Leptospira borgpetersenii de un feto de jabalí (Sus scrofa)

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La leptospirosis es la enfermedad zoonótica más extendida en el mundo. Es causada por una bacteria perteneciente al orden de las espiroquetas. Las cepas patógenas del género Leptospira spp. encuentran su nicho ideal para la transmisión en regiones subtropicales y tropicales. No hay datos disponibles sobre la incidencia de leptospirosis en varios países y, además, la enfermedad con frecuencia es subdiagnosticada y subnotificada, en consecuencia es considerada una enfermedad descuidada severamente (Hartskeerl et al., 2011). Las cepas patógenas de leptospira infectan principalmente a los mamíferos, pero también se pueden encontrar en reptiles y anfibios (Levett, 2001, Adler y Peña, 2010). Esta zoonosis se mantiene en la naturaleza por la infección renal crónica de los animales portadores; los roedores y otros mamíferos pequeños son los reservorios más importantes. Además, fuentes importantes de infección humana son el ganado y los animales domésticos, como los perros. En Argentina, esta enfermedad es endémica y aún no se han implementado programas de control o prevención epidemiológica. Hasta la semana epidemiológica 51 del año 2019 se notificaron 2976 casos humanos al Ministerio de Salud Nacional en el país; la región del centro (Buenos Aires, CABA, Córdoba, Entre Ríos y Santa Fe) es la que cuenta con la mayor cantidad de casos notificados (2019) (Ministerio de Salud Nacional, 2019).

Por un lado, en Ellis et al. (1986) se establecieron cerdos domésticos como anfitriones de mantenimiento para el serogrupo Australis y en Jansen et al. (2007) para el serogrupo Pomona. Por otro lado, los jabalíes se clasifican como hospedadores accidentales para el serovar Grippothyphosa en Treml et al. (2003) y en Jansen (et al.) 2007 para el serogrupo Pomona y Bratislava. Slavica et al. (2010) realizaron un estudio serológico en jabalíes en Croacia utilizando MAT, en este estudio los serovares más frecuentes fueron Australis (33,3%), Pomona (21,8%) y Tarassovi (14,3%) de un total de 351 muestras de suero, el título más alto obtenido fue 1/3200 para serovar Pomona. En un estudio serológico reciente de jabalíes (Sus scrofa) en Polonia (Zmudzki et al., 2016) analizaron 3621 muestras de sangre de jabalíes en busca de Leptospira spp. serovars/serogroup: Icterohaemorrhagie, Grippothyphosa, Sejore, Tarassovi, Pomona, Canicola, Bratislava, Autumnalis, Hardjo y Ballum. El serogrupo Ballum no dio títulos en las muestras de suero analizadas . Los serovares Pomona y Sejore se informan como los más comunes en cerdos domésticos en Polonia; sin embargo, (Zmudzki et al., 2016) estos serovares fueron poco frecuentes. En el mismo estudio se menciona el aumento de la población de jabalíes de vida libre en Europa en las zonas urbanas y suburbanas, y la amenaza de una posible diseminación de cepas patógenas de leptospiras es preocupante. La necesidad de controlar la población también constituye un riesgo para los cazadores de infectarse con Leptospira spp. (Richard et al., 2015; Jensen et al., 2007).

Además, la expansión geográfica de los humanos hacia áreas no urbanizadas está causando que los animales silvestres tengan que vivir en las cercanías de los habitantes de estos pueblos y ciudades. En el 2006, relacionaron un caso humano de leptospirosis en Berlín con la posible infección por agua dulce contaminada con orina de jabalí (Jansen et al., 2006). En una revisión de los jabalíes como fuentes de infecciones en humanos y ganado (Meng et al., 2009), solo se enumeran tres estudios de seroreactividad positiva: Alemania (Jansen et al., 2007), California (EE. UU.) (Clark et al., 1983) e Italia (Ebani et al., 2003). En Jansen et al. (2007) las muestras de suero de jabalíes de las zonas urbanas de Berlín fueron analizadas por MAT, los serovares Pomona y Bratislava fueron los más frecuentes, estos resultados y la demostración de que se encontraron leptospiras utilizando la tinción de plata en muestras de riñón de jabalíes indicaron que estos animales son animales de mantenimiento (reservorios) también en áreas urbanas. En Eslovenia (Vengust et al., 2003) en un estudio de seroprevalencia de Leptospira spp. en 437 muestras de suero de jabalí se encontró que la prevalencia de anticuerpos de este estudio fue mayor (45,5%) que la prevalencia determinada en estudios previos: Italia (6%; Ebani et al., 2003), República Checa (16,9%; Treml et al., 2003), Alemania (24%; Schönberg et al., 1999), Polonia (25,2%; Krawczyk, 2000), Croacia (26%; Cvetnic et al., 2003), Austria (30%; Deutz et al., 2002) y Australia (20%; Mason et al., 1998).

En Sudamérica no se han realizado muchos estudios de seroprevalencia en jabalí, sin embargo, en Brasil (2011) se realizó un estudio serológico con MAT en una población cautiva de jabalíes para consumo humano. En este estudio, 63 animales fueron positivos a Leptospira spp., los serovares mejor representados fueron: Hardjo, Copenhageni y Pomona (Fornazari et al., 2011).

Hasta donde sabemos, este es el primer aislamiento de L. borgpetersenii de fetos de jabalíes (Sus scrofa). Existen muchos estudios sobre prevalencia en jabalíes a nivel mundial, sin embargo, aparentemente no existen estudios sobre aislamientos de cepas patógenas en este grupo animal. El objetivo de este trabajo fue aislar y genotipificar la cepa aislada a partir de los fetos recibidos en el laboratorio de Leptospirosis, Centro de referencia de la OIE, perteneciente al Instituto de Patobiología del CICVyA, INTA Castelar.

Aislamiento de Leptospira spp.: se realizaron las necropsias de los 4 fetos, provenientes del parque nacional Nahuel Guapi (Patagonia), utilizando el protocolo descrito por Faine et al. (1999), y se cultivaron las muestras de riñones, hígado, bazo y pulmón en medios Fletcher y EMJH. Los cultivos se incubaron a 28 °C hasta que se determinó el desarrollo, cada 15 días se observaron los cultivos bajo microscopía de campo oscuro.

Inmunofluorescencia: la tinción de inmunofluorescencia directa de las muestras de hígado, bazo, pulmón y riñón se realizó con un conjugado multivalente FA, LEP-FAC (Seasinglab, Argentina) específico para Leptospira spp.

Caracterización molecular: las cepas de referencia y la cepa aislada se cultivaron en medios Fletcher (Laboratorios Difco) a 28 ºC. Para las extracciones de ADN se usó el protocolo utilizado con la resina Chelex-100 (Bio Rad). Se usó el análisis de repeticiones en tándem de número variable de locus múltiples (MLVA) para caracterizar la cepa aislada con 1 conjunto de oligonucleótidos específicos para las cepas patógenas de L. interrogans, L. kirschneri y L. borgpetersenii, se usaron los siguientes loci: VNTRS: 4, 7, 10, Lb4 y Lb5 (Salaün et al., 2006). El volumen final (50 µl) de cada mezcla de reacción contenía PCR Buffer (Tris-HCL 20 mM, pH 8.4; KCl 50 mM), desoxinucleósidos trifosfatos 200 µM, cada cebador correspondiente 2 µM, MgCl₂ 2 mM, ADN polimerasa Taq 1.25U (Invitrogen) y plantilla de ADN 5 µl. Las PCR se llevaron a cabo en un termociclador Thermo Scientific PxE 0,2 de la siguiente manera: 94 ºC durante 5 minutos, seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 94 ºC durante 30 segundos, recocido a 55 ºC durante 30 segundos y extensión a 72 ºC durante 90 segundos, con un ciclo final a 72 ºC durante 10min. Las muestras amplificadas (15 µl) se revelaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2% en tampón TAE (Tris-acetato 40 mM, EDTA 1 mM) con 0,2 ul µg/ml de bromuro de etidio a 100 V durante 50 minutos. Las bandas de ADN amplificadas se visualizaron tras la exposición a la luz UV (transiluminador Uvi Tec BTS-20.M). Los tamaños de amplicón se estimaron usando CienMarker (Biodynamics) y el programa GelAnalyzer 2010a. Para calcular el número de copias repetidas se utilizó la siguiente fórmula: Número de repeticiones (pb) = [Tamaño de fragmento (pb) - Regiones de flanqueo (pb)] / Tamaño de repetición (pb). Los números de copia repetidos se redondearon a los números enteros más cercanos. Si el número de copia era menor que uno, se redondeó a cero.

La inmunofluorescencia directa fue positiva en el hígado, el bazo y el riñón de los fetos. Se aisló una cepa de Leptospira spp. de riñones e hígado en medio Fletcher después de 47 días de incubación a 28 ºC. El genotipo del aislamiento determinado por MLVA, coincide con el perfil genético de Leptospira borgpetersenii serovar Castellonis Castellon 3 (-, -, 1,4,6) del serogrupo Ballum (figura 1).

Figura 1

Genotipificación MLVA.

Hasta donde sabemos, esta es la primera cepa de Leptospira borgpetersenii aislada de jabalíes en América del Sur obtenida de fetos abortados (figuras 2 y 3). Este hallazgo sugiere que los jabalíes son susceptibles a L. borgpetersenii serovar Castellonis Castellon 3 del serogrupo Ballum. Este genotipo se caracterizó previamente en poblaciones de ratones en Argentina (Grune et al., 2013). La misma especie L. borgpetersenii se aisló en muestras de agua en un río urbano en Argentina (Francoise et al., 2013) y se aisló en casos clínicos de animales domésticos (Grune et al., 2016) y humanos (Goncalves et al., 2010). Varios estudios sobre seroreactividad realizados en poblaciones de jabalíes (Europa, EE. UU., y Australia) (Clark et al., 1983; Deutz et al., 2002; Ebani et al., 2003; Fornazari et al., 2011; Jansen et al., 2007; Krawczyk et al., 2000; Manson et al., 1998; Meng et al., 2009; Saliki et al., 1998, Schönberg et al., 1999; Slavica et al., 2010; Treml et al., 2003; Vengust et al., 2003; Zwdzki et al., 2016) muestran la exposición en el medioambiente y nichos ecológicos donde viven las poblaciones de jabalíes a cepas leptospiras patógenas. En este estudio se logró aislar una cepa a partir de un feto abortado de Sus scrofa, genotipificada molecularmente empleando MLVA, demostrando la importancia que presentan los animales silvestres en la diseminación de cepas patógenas al medioambiente. Este hallazgo también refleja la posibilidad de infección en jabalíes, ya que la cepa fue aislada en fetos, sin embargo, no se encontraron restos de la madre en el lugar. Es importante profundizar estudios epidemiológicos no solo en jabalíes, sino también en otros animales silvestres y en el medioambiente, para poder conocer la casuística actual presente en el país y así poder tomar medidas de prevención en las zonas de mayor riesgo de contagio.

Figura 2

Feto jabalí abortado.

Figura 3

Feto jabalí abortado.

Este estudio fue financiado por el Proyecto Nacional INTA, AESA 202821.