Prueba rápida modificada del ácido glutámico descarboxilasa para la identificación de Escherichia coli en aislados clínicos

Rapid Modified Glutamic Acid Decarboxylase Test for the Identification of Escherichia Coli in Clinical Isolates.

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Escherichia coli es un microorganismo patógeno que se encuentra con frecuencia en muestras obtenidas de aislados clínicos. Es el patógeno urinario más frecuente y ocupa de 60 a 80% de todos los aislamientos [4].

Desde hace mucho tiempo se han desarrollado métodos rápidos, sensibles y específicos para el diagnóstico de dicho microorganismo, los cuales en su mayoría son extremadamente costosos, es por ello que se hace necesario encontrar nuevas técnicas que además de poseer todas las características necesarias para la identificación del microorganismo, también sean lo suficientemente económicas y sencillas para que puedan ser incorporadas al diagnóstico clínico de rutina [2, 5, 6, 8, 9].

La enzima descarboxilasa de ácido glutámico (GAD), cataliza la descarboxilación de ácido glutámico produciendo ácido aminobutírico y dióxido de carbono, y esta ha sido reportada anteriormente en Escherichia coli [2], presentando rangos de especificidad que varían de 97 a 99%.

Un método rápido para la detección de esta enzima, es el uso de una solución hipertónica de cloruro de sodio y Tritón X que se emplean como agentes líticos para la liberación de la enzima, y esto posibilita que la reacción ocurra en un período no mayor de 4h [10]. Aunque las ventajas de empleo de esta prueba han sido reportadas por varios autores, su uso en la rutina en los laboratorios de microbiología diagnóstica no es común. La variante modificada, hace uso del Ácido dietilén diamín tetra acético (EDTA) el cual se utiliza como agente quelante de los iones de calcio, desestabilizando así la membrana externa bacteriana y facilitando la liberación del contenido citoplasmático [7].

Diversos autores reportaron respuestas positivas a la prueba rápida, obteniendo una sensibilidad diagnóstica para la identificación de E. coli de 100% en todos los tipos de muestras analizados. Aunque la especificidad diagnóstica resultó ser menor del 90% debido a la interferencia de cepas de Shigella en análisis de coprocultivos y la exactitud diagnóstica del método fue suficientemente alta (92,62 ± 2,97%) [9].

El objetivo de este trabajo consistió en la aplicación de la prueba rápida modificada del ácido glutámico descarboxilasa para la identificación de Escherichia coli en aislados clínicos.

Se le aplicó la prueba rápida del GAD a las cepas de E. coli, obtenidas de aislados de muestras clínicas.

Prueba de Ácido Glutámico Descarboxilasa Modificado.

Se le realizaron algunas modificaciones para el preparado del reactivo GAD [7], generándose una matriz para la estandarización del reactivo, presentada en la tabla 1.

Tabla 1
Matriz para la estandarización del reactivo

Datos en base a cada 100 mL de agua destilada con pH ajustado a 3,4. Una vez disueltos los componentes, las soluciones se esterilizaron en autoclave (sin el aminoácido) a 10lb por 15 min y posteriormente se añadió el ácido L-glutámico cerca del mechero. El reactivo preparado se almacenó en un frasco ámbar estéril en refrigeración, ya que de esta manera puede mantenerse por un período no mayor a dos meses.

Así mismo se variaron las concentraciones de reactivo-inóculo, generando de esta manera una matriz experimental de nueve posibilidades, cada formulación, numeradas como reacción 1, 2 y 3, se probó bajo las siguientes variaciones: a) una asada del microorganismo aislado a 0,2 mL de solución salina (0,9%) estéril, para lograr una suspensión microbiana equivalente al tubo 0,5 de la escala de MacFarland y se añadió 0,2 mL del reactivo estéril, b) una asada del microorganismo aislado de igual manera pero en 0,5 mL y se le añadió 0,2 mL del reactivo y c) Se aisló el microorganismo de la misma forma, en 0,2 mL y se añadió 0,5 mL del reactivo; generando de esta manera, una matriz experimental de nueve pruebas. Se incubó a 35 ± 2°C durante 4 h, observando los resultados cada 1 h. Un resultado positivo fue cualquier cambio del color del tubo de amarillo a verde o azul. La respuesta negativa corresponde al color amarillo (sin cambio).

Con respecto al establecimiento del tiempo de incubación, se observó que la incubación de 2 horas permitió la identificación de los aislados de Escherichia coli. Los protocolos estudiados proponen un tiempo de incubación de 4 horas máximo. Se reportó que el 95% de las reacciones positivas se dieron a la hora de incubación y el total de reacciones a las 2 horas [9].

A las dos horas del período de incubación, se evidenció un cambio de color en la reacción 3b, (concentración 1% del aminoácido, 0,5 mL del inóculo y 0,2 mL del reactivo) de amarillo a verde. Al finalizar el plazo de cuatro horas, dicho diseño fue el único en presentar cambio de color, mientras los restantes continuaron de color amarillo.

Las muestras restantes fueron tratadas con el reactivo y en cantidades que mostraron ser las más adecuadas, resultando positiva la prueba para Escherichia coli ATCC®35218, E. coli BLEE 270 y E. coli BLEE 85, evidenciando una elevada especificidad (100%) y sensibilidad (100%).

Modificando la prueba del GAD con EDTA, se obtuvo una sensibilidad de 100%, una especificidad de 100% y una exactitud de 100%, porcentajes similares fueron reportados en estudios donde se obtuvo una sensibilidad de 100%, una especificidad de 82,8% y una exactitud de 92%.

En este trabajo los elevados porcentajes se obtuvieron porque los aislamientos considerados provenían de urocultivos, mientras que en el estudio de Tsoravase y Muñoz, se consideraron muestras clínicas de coprocultivo, por lo que se manifestó la reacción positiva de especies de Shigella, afectando el porcentaje de especificidad [9]. En otro estudio [1] se reporta una sensibilidad de 96,87% para la prueba del GAD, debido a que dos aislamientos no mostraron actividad de esta enzima, así mismo en otra investigación se demostró una especificidad de 95% en aislamientos clínicos y ambientales [5].

La prueba rápida del GAD descrita por Tsoraeva y Muñoz [9] y la modificada, donde se cambió el Tritón X-100 por EDTA [7], resultan ser específicas para aislamientos de E. coli, lo cual genera resultados de identificación de esta bacteria en un mínimo de una hora (según lo reportado) y un máximo de 4 horas, acortando los tiempos de espera para el diagnóstico clínico debido a la alta sensibilidad (100%), especificidad (100%) y exactitud (100%) mostradas, por lo que el uso de esta prueba es altamente recomendable para el diagnóstico rápido y/o confirmación de E. coli.

De igual manera, se sugiere la aplicación de esta prueba modificada a una mayor cantidad de aislamientos para validarla.

Los autores agradecen principalmente a la Universidad del Zulia (LUZ) por abrirle las puertas a los trabajos de investigación, en especial a los laboratorios que conforman la Unidad de investigaciones en microbiología ambiental (UIMA) por prestar sus instalaciones, materiales y equipos.