Análisis de los inhibidores de las α-amilasa y la tripsina contenidos en el trigo y otros cereales: potenciales promotores de la inflamación intestinal.

Proteínas de las plantas; Inhibidores de las proteasas; Hipersensibilidad al trigo; Enfermedad Celiaca; Espectrometría de Masas.

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Los cereales y las legumbres son la base alimentaria en nuestra dieta actual. Los cereales son la fuente más importante de nutrientes contribuyendo al 50% de las calorías de la dieta (Keraney, 2010). Las legumbres constituyen la fuente principal de proteínas en Latinoamérica, África y este de Asia (Flight y Clifton, 2006). Se han asociado varios compuestos de estos alimentos con mecanismos de defensa contra la depredación de insectos y la resistencia a la infección, como la familia de los inhibidores de las α-amilasas y las proteasas, proteínas que actúan inhibiendo las enzimas digestivas de los insectos y en algunos casos inhibiendo la de los mamíferos (Dang y Van Damme, 2015). Son moléculas tridimensionales formada por uniones disulfuro y se presentan como estructuras monómericas de 5 a 16 kDa, homodiméricas de 26 kDa o tetraméricas de 50 kDa (Franco et al., 2002). Debido a su naturaleza proteica son termolábiles, se desnaturalizan con el calor durante el cocinado, aunque se ha comprobado que no pierden totalmente la capacidad de inhibición (Zevallos et al., 2017; Pastorello et al., 2007).

Los primeros inhibidores aislados fueron el inhibidor Kunitz y Bowman-Birk de la soja en 1940 y el inhibidor de la α-amilasa de cereales (Kneen y Sandstedt, 1943; Kunitz, 1945; Bowman, 1946). Desde entonces se han identificado y caracterizado numerosos inhibidores en un amplio espectro de especies vegetales debido principalmente al interés en modificar su expresión para el control de las plagas o para tratar la diabetes y la obesidad (Vasil, 2007; Barrett y Udani, 2011; Dang y Van Damme, 2015). Recientemente se han vinculado los inhibidores de la α-amilasa y la tripsina (ATIs) del trigo y de otros cereales con diversas patologías gastrointestinales, como la Enfermedad Celíaca (EC) y la Sensibilidad al Gluten no Celíaca (SGNC), por ser fuertes activadores de la respuesta del sistema inmune innato (Junker et al. 2012; Zevallos et al., 2017; Reig-Otero et al., 2017).

En 1943 se observó por primera vez que una proteína del endospermo del trigo era capaz de inhibir la amilasa salival y desde que se aislaron en 1973, se han relacionado con reacciones de hipersensibilidad IgE, como el asma del panadero y la alergia al trigo, así como en reacciones alérgicas cruzadas entre el trigo y el arroz (Silano et al., 1973; Mills et al., 2004; Salcedo et al., 2011; Junker et al. 2012; Villalta et al., 2012). Desde entonces se han publicado estudios para entender su estructura, el mecanismo de inhibición y su efecto sobre el sistema inmunitario (Carbonero et al., 1999; Payan 2004; Salcedo et al., 2011; Altenbach et al., 2011; Huebener et al., 2015).

En base al estado de agregación se pueden encontrar varios tipos de inhibidores de la α-amilasa en el trigo (figura 1): monoméricos o proteínas 0.28, homodiméricos o proteínas 0.19 y 0.55, y los heterotetraméricos, referidos como proteínas CM. Los inhibidores de la tripsina son monoméricos o inhibidores CMx (Sherry y Casey, 1999).

Figura 1
Representación de las estructuras 3D de varios inhibidores de la familia de los cereales: Inhibidor de la amilasa y la tripsina del trigo A) 0.53 B) 0.28 C) CM3 D) 0.19. Fuente: Swiss-Model Repository https://swissmodel.expasy.org/repository.

La posible implicación de estas proteínas en la EC, la SGNC y otras enfermedades inflamatorias, precisa disponer de las mejores técnicas instrumentales para su detección y cuantificación, así como de mecanismos para medir la actividad proinflamatoria del SGI (sistema gastrointestinal) de los cereales crudos y de los alimentos que los contienen. El mayor problema que existe es la inexistencia de procedimientos fiables de análisis y la ausencia de estudios interlaboratorio que los validen.

El objetivo de este trabajo fue realizar una revisión de las técnicas más recientes de extracción, purificación, detección y cuantificación de los ATIs mediante espectrometría de masas (MS) principalmente del trigo y de otros cereales tanto en crudo como en alimentos procesados.

Se realizó una búsqueda sistemática de la literatura científica existente relacionada con los ATIs de cereales. Para la revisión se consideró artículos desde el año 2000, utilizando bases de datos documentales de revistas indexadas como Medline, Scielo, Science Direct y Scopus, con el diagrama de flujo y criterios de búsqueda según se muestra en la figura 2. Finalmente se utilizaron 26 artículos para esta revisión bibliográfica.

Figura 2
Diagrama de flujo y criterios de búsqueda utilizados para la revisión sistemática.

Existen dos técnicas para detectar y cuantificar las proteínas con propiedades alergénicas en alimentos: MS y enzimoinmunoensayos. De estos últimos, la más utilizada es el ensayo ELISA basado en el reconocimiento de anticuerpos monoclonales o policlonales de una o más proteínas alergénicas, no requiere instrumental sofisticado ni altos niveles de experiencia, pero tiene desventajas como falsos positivos y baja sensibilidad (Croote y Quake, 2016). La MS es óptima cuando se requiere la confirmación de la composición, estructura y secuencia de aminoácidos. Tiene gran selectividad y alta sensibilidad, hay escasa posibilidad de falsos positivos, pero el coste es elevado y necesita personal cualificado (Monaci y Visconti, 2009; Mari et al., 2010).

En esta revisión se distinguen dos estrategias de análisis mediante MS (figura 3), una identifica los ATIs con potencial alergénico por inmunotransferencia, se aíslan y posteriormente se caracterizan por MS (Pastorello et al., 2007; Akagawa et al., 2007; Šotkovský et al., 2011; Lang et al., 2013; Goliáš et al., 2013), la otra estrategia identifica y cuantifica los péptidos característicos resultado de la digestión de las proteínas por técnicas de MS (Fontanini et al., 2007; Prandi et al., 2013; Uvackova et al., 2013; Flodrová et al., 2015; Satoh et al., 2016).

En la primera (figura 3A), una vez extraídas las proteínas, purificadas y digeridas con tripsina, se realiza un ensayo de inmunotransferencia con suero de pacientes sensibles. Las proteínas reactivas se analizan por MS, se comprueba el % de cobertura con patrones y se obtiene la secuencia mediante espectrometría de masas en tándem (MS/MS). En esta estrategia la clave es disponer del biomarcador que indique una alteración del sistema gastrointestinal (SGI). En la alergia al trigo se utilizan los anticuerpos IgE y en la EC los anticuerpos IgG y IgA, en el caso de SGNC todavía no hay biomarcadores característicos.

En la segunda (figura 3B), se cuantifican por MS las mezclas de los péptidos resultantes de la digestión de las proteínas extraídas y purificadas. La cuantificación de proteínas en matrices complejas requiere la fragmentación en péptidos, esto trae consigo varias suposiciones: que el proceso de extracción y separación son óptimos, y que la digestión es completa y reproducible, es decir, existe una relación entre la concentración de los péptidos y de la proteína original (Ong y Mann, 2005; Li et al., 2017). Para dar valores cuantitativos del contenido en ATIs es necesario estándares semejantes a la muestra a analizar de los cuales se conozca su concentración en la matriz a estudiar, así como tener un criterio único en las unidades facilitando la comparación de los resultados de los diversos trabajos (Elliot et al., 2009; Sancho y Mills, 2010; Wang y Giese, 2017).

Figura 3
Estrategias de análisis utilizadas para la identificación y cuantificación de los ATIs en cereales.

Revisión de las técnicas de extracción de los ATIs

En cualquier proceso analítico la eficacia del análisis depende en gran medida del método de extracción y de la pureza de la fracción extraída. Se realiza sobre el cereal molturado por separación de las proteínas en base a diferencias de solubilidad en varios solventes hasta conseguir la máxima pureza de la fracción concreta. Como se detalla en las tablas 1, 2 y 3, son mayoritarios los trabajos que identifican los ATIs sobre la fracción de las albúminas/globulinas (85%), aunque se hayan identificado en la fracción de las gliadinas y gluteninas, como el estudio realizado por Pastorello et al. (2007), donde se detectaron en las tres fracciones, siendo en las albúminas/globulinas donde se encontró la concentración mayor.

Tabla 1
Métodos extracción, purificación e identificación de ATIs en distintas variedades de trigo.

Tabla 2
Métodos de extracción, purificación e identificación de ATIs en distintas variedades de arroz.

Tabla 3
Métodos extracción, purificación e identificación de ATIs en otros cereales

De acuerdo con la revisión realizada, la extracción se hace mayoritariamente de la fracción soluble en soluciones salinas (NaCl 1M, NaCl 0.5M, Tampón Fosfato Salino, etc.), albúminas/globulinas. Cuccioloni et al. (2016), optimizaron el método de extracción sobre las gliadinas usando un disolvente al 50% de isopropanol (1:5 p/v), seguido por una cromatografía de afinidad sobre metales inmovilizados (IMAC, por sus siglas en inglés) con columnas cargadas de iones Cu(II). Este método presentó un 95% de recuperación de los ATIs frente al uso de la mezcla acetona/isopropanol. Por otra parte, Flodrová et al. (2015), valoraron el potencial alergénico de las proteínas sobre la fracción de las albúminas del trigo y la cebada en crudo y procesada. Según estos autores la mayoría de los alérgenos en alimentos son proteínas solubles en agua (Robinson y Pongracic, 2012).

Otro trabajo estudió la solución más eficaz para la extracción de alérgenos del arroz, concluyendo que los ATIs se encuentran mayoritariamente en la fracción de albúminas/globulinas y que la mayor concentración se obtiene con la solución compuesta de NaCl 1M en Tris–HCl 30mM a pH 8.0 o pH 6.8 (Akagawa et al., 2007). La identificación mejor de los alérgenos del arroz sobre las proteínas totales fueron las basadas en una mezcla de Tris–HCl, SDS, 2-mercaptoetanol y urea porque generaban menores interferencias en la cuantificación.

Zevallos et al. (2017) utilizaron otros métodos de extracción para confirmar la activación del sistema inmune innato por parte de los ATIs donde utilizaron una solución de NH4HCO3 50mM sobre muestras de varios cereales y alimentos procesados y sin procesar. Tres extracciones consecutivas seguidas de la precipitación con (NH4)2SO4 y posterior diálisis consiguieron una pureza >60%.

La solución extractante afecta al método de análisis posterior, los agentes desnaturalizantes y concentraciones de sales elevadas para mejorar la extractabilidad son interesantes para el ensayo ELISA, pero tienen efectos negativos en la identificación por MS ya que influyen en la ionización del analito reduciendo considerablemente la intensidad de la señal (Kitta et al., 2006). En único ensayo interlaboratorio encontrado en esta revisión, Satoh et al. (2016), demostraron que, aunque la solución basada en urea (8 M Urea, 4% (3-[(3-Colamidopropil)-dimetilamonio]-propano sulfonato) CHAPS, 60 mM DTT) consigue una mayor extracción de proteínas de semillas de arroz, con soluciones salinas basadas en NaCl se consigue la mejor representación de las proteínas en las bandas de electroforesis.

Los ATIs del trigo son unidades de polipéptidos de 12-16kDa que tienen una estructura secundaria con 4-5 puentes disulfuro, confiriéndoles una estructura 3D (Izumi et al., 1999; Carbonero et al., 1999). Esta configuración contribuye a su estabilidad, tanto en forma nativa como desnaturalizada, y a su elevada resistencia a las condiciones extremas del tracto gastrointestinal (Mills et al., 2004; Breiteneder, 2005). En los estudios revisados, se observa que los ATIs del trigo y de otros cereales no desaparecen después del procesado, aunque disminuyen su actividad proinflamatoria. Esta capacidad inflamatoria es multifactorial y depende de la variedad de partida, las condiciones de cultivo, el pretratamiento y el tipo de procesado (cocción, horneado, adicción de sal) y condiciones (temperatura, humedad, tiempo de permanencia) (Mills et al., 2004; Pastorello et al., 2007; Prandi et al., 2013; Zevallos et al., 2016). Todas estas variables podían ser moduladas y predeterminadas para desarrollar alimentos a base de trigo con menor contenido de ATIs y con menor poder de activación del sistema inmune.

Conocer los factores desencadenantes de la activación de la inmunidad innata en la EC con el consumo de cereales con gluten, dio lugar a un estudio que describe el papel de los ATIs en este mecanismo (Junker et al., 2012; Reig-Otero et al., 2017). Se observó que estas proteínas son potentes estimuladoras de los receptores tipo Toll (TLR por sus siglas en inglés) en el intestino, concretamente el TLR4. Los TLR tienen un papel central en la detección de patógenos y en la iniciación de la respuesta inflamatoria innata. Para comprobar esta actividad proinflamatoria de los ATIs, otro estudio verificó que es cien veces superior en cereales que contienen gluten y que se mantiene en el alimento una vez procesado, aunque es reducida frente al cereal sin procesar (Zevallos et al., 2017). La acción de los ATIs del trigo podría ser relevante para la explicación de la activación de la inmunidad innata en la EC, también podría explicar la activación de los síntomas de la SGNC y, posiblemente, de otras patologías del SGI (Reig-Otero et al., 2017). Zevallos et al. (2016). demuestran in vivo un aumento de los niveles de las células dendríticas cuando los ratones son alimentados en concentraciones 12 veces menores que el valor medio de los ATIs ingeridos en la dieta normal de un individuo adulto, siendo estos niveles dependientes de la concentración de los ATIs, y que además tienen un efecto coadyuvante de los síntomas en modelos con inflamación intestinal previa.

Respecto a la avena, Gazza et al. (2016), identifican diferentes inhibidores en distintas especies de este cereal, algunas llegan a tener un 60% de similitud con los ATIs del trigo. Esta similitud podría ser la causa de que la avena aun siendo un cereal sin gluten, dependiendo de qué variedad o en qué condiciones se procese, exhiba distinta inmunoreactividad en pacientes con EC poniéndose en cuestión la seguridad del consumo de avena por enfermos celíacos.

Las técnicas de identificación de los ATIs durante estos últimos diez años se han ido optimizado. Un salto cualitativo se observa con la MS en la identificación inequívoca de las proteínas, y con MS en tándem, en la obtención de la secuencia de aminoácidos. El primer trabajo que utiliza la MS en un cereal es en 2000, a partir de entonces se utiliza como técnica imprescindible para análisis (Iulek et al., 2000). Gracias a la MS se han podido aislar nuevos ATIs en diversos cereales y cuantificarlos, aunque no haya un procedimiento único o estandarizado. De los resultados de esta revisión sería de especial interés proponer un estudio colaborativo con el objeto de alcanzar un consenso en los métodos de análisis, así de disponer de los patrones o materiales de referencia imprescindibles para validar cualquier método usado por los laboratorios.

Como se observa en las tablas 1, 2 y 3, la mayoría de los artículos revisados analizan solamente la fracción de las albúminas/globulinas cuando los ATIs se encuentran presentes en todas las fracciones. Esto podría llevar a una pérdida de información a la hora de obtener datos cuantitativos. El método de purificación y separación utilizado es la electroforesis en 1D o 2D combinada con LC, aunque en estudios comparativos en la 2D se observan variaciones de intensidad que impiden realizar medidas precisas de la concentración de los ATIs, pero no del resto de proteínas alérgenas del arroz. Esta inconsistencia se explica en la regeneración de los puentes disulfuro de los ATIs después de la 1D formándose macroagregados impidiendo que migren a su respectiva masa molecular en la 2D (Akagawa et al., 2007; Satoh et al., 2016).

La LC es una técnica que en combinación con la electroforesis se utiliza para la separación y purificación de los ATIs. Permite buenas separaciones en un amplio rango de pesos moleculares, polaridad y solubilidad, y se utiliza tanto de forma preparativa como en alta resolución previamente a su identificación por MS.

Se han encontrado pocos estudios específicos sobre la identificación de ATIs en alimentos procesados y menos de su bioactividad sobre el sistema inmunitario innato. La posible implicación de estas proteínas en la patogénesis de enfermedades gastrointestinales como la EC, la SGNC y otras enfermedades inflamatorias y autoinmunes, hacen necesario disponer de las mejores técnicas instrumentales para la detección y cuantificación de los ATIs, así como mecanismos para medir su actividad proinflamatoria tanto en cereales crudos como en los alimentos procesados.

En la última década han mejorado las técnicas de análisis de los ATIS gracias a la optimización de los procedimientos de extracción y purificación, y al uso de técnicas MS que han permitido su identificación inequívoca y su cuantificación.

Se ha utilizado mayoritariamente dos estrategias para aislar nuevos ATIs en diversos cereales. En la primera, se separan las proteínas reactivas de la fracción extraída mediante inmunoensayos, normalmente con anticuerpos IgE, para posteriormente separarlas y digerirlas con tripsina e identificar los péptidos característicos mediante MS. En la segunda estrategia, una vez extraídas, purificadas y digeridas, los péptidos se detectan con MS y, dependiendo el objetivo del trabajo, se cuantifican.

La extracción de los ATIs está basada en la solubilidad secuencial de las proteínas en diferentes solventes utilizándose mayoritariamente la fracción de las albúminas/globulinas (85%) aunque también están presentes en las gliadinas y gluteninas. Para la purificación se utiliza la electroforesis (69%), en una o dos dimensiones (31%) previamente a su detección en el MS con fuente de ionización MALDI de forma mayoritaria (42%).

No se existe todavía una metodología normalizada para disponer valores cuantitativos fiables del contenido de ATIs en alimentos, valores fundamentales dado su potencial efecto adverso para la salud. Se deberían realizar estudios interlaboratorio que permitan llegar a un consenso en los métodos utilizados, así como disponer de patrones de ATIs en diversas matrices, imprescindibles para validar cualquier método analítico.

Los autores declaran ningún conflicto de interés. Los autores agradecen a la Universitat de València el apoyo científico y económico de su investigación.