Actualidad Química

La Revolución de la Resolución: la Criomicroscopía Electrónica de partículas aisladas resuelve la estructura atómica de biomoléculas en solución

The Revolution of the Resolution: the Cryo-electronic Microscopy of isolated particles solves the atomic structure of biomolecules in solution.

Fernando Mendoza
Thermo Fisher Scientific, México
Raúl Padrón
Centro de Biología Estructural Humberto Fernández-Morán, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas , Venezuela

La Revolución de la Resolución: la Criomicroscopía Electrónica de partículas aisladas resuelve la estructura atómica de biomoléculas en solución

Avances en Química, vol. 13, núm. 1, pp. 7-13, 2018

Universidad de los Andes

Recepción: 23/04/2018

Aprobación: 30/04/2018

Resumen: Luego de la invención del microscopio electrónico (ME) de transmisión en 1934 se iniciaron esfuerzos para corregir los problemas asociados a la observación de biomoléculas en medio acuoso debidos al alto vacío y daño por radiación electrónica. Una solución fue usar temperaturas criogénicas lo cual condujo a la ME de baja temperatura para observar biomoléculas congelado-hidratadas y a la invención del crio-ME en 1966. El desarrollo de la incipiente crio-ME fue lento hasta el 2014 cuando el desarrollo de las técnicas de reconstrucción 3D de partículas aisladas y de los detectores de electrones directos revolucionaron el campo convirtiendo la crio-ME de partículas aisladas en la técnica que permite la determinación directa –sin requerir cristalización- de la estructura atómica de biomoléculas en solución. La resolución atómica alcanzada junto al desarrollo de poderosos crio-MEs produjo un incremento explosivo en la determinación de estructuras de biomoléculas cuyas consecuencias médicas y farmacológicas estamos presenciando.

Palabras clave: criomicroscopía electrónica, criomicroscopía electrónica de partículas aisladas.

Abstract: After the invention of the transmission electron microscope (EM) in 1934 efforts started to address the problems associated with the observation of biomolecules in water solution due to the high vacuum and associated electron radiation damage. One solution was to use cryogenic temperatures leading to the low temperature EM to observe frozen-hydrated biomolecules and to the invention of the cryo-EM in 1966. The development of cryo-EM since then was slow till 2014 when single-particle 3D reconstruction techniques and the direct electron detectors revolutionized the field converting single-particle cryo-EM in the technique that allows the direct determination –without crystallizationof the atomic structure of biomolecules in solution. The atomic resolution achieved together with the development of powerful cryo-EM lead to an explosive increase on the determination of biomolecule structures whose important medical and pharmaceutical consequences we are attending.

Keywords: Cryo-electron microscopy, Single-particle cryo-electron microscopy.

Introducción

Luego de la invención del microscopio electrónico (ME) de transmisión en 1934 por Ruska1 que le valió el Premio Nobel de Física en 1986; Marton, quién construyó un ME horizontal2, arguyó que dichos microscopios no podrían ser usado para el estudio de especímenes biológicos ya que el intenso haz electrónico los destruiría3, proponiendo soluciones a dicho problema como enfriar el espécimen o usar técnicas alternativas para preparar estos especímenes. El nuevo instrumento presentaba serios problemas para observar especímenes biológicos, que contienen agua, y que reducen la resolución a solo decenas de Å debido a: (1) bajo contraste de las imágenes, (2) destrucción del espécimen por la radiación del haz electrónico, (3) evaporación del agua del espécimen por el alto vacío, (4) el espécimen debe ser muy delgado y (5) el espécimen se mueve al interaccionar con los electrones del haz electrónico y por variaciones térmicas.

La ingeniosidad de los microscopistas e inventiva de los ingenieros permitió resolver estos cinco problemas en los siguientes 80 años con el desarrollo sistemático de nuevas técnicas para la preparación de especímenes biológicos y de nuevos microscopios electrónicos, lográndose en el 2014 la determinación de la estructura atómica de biomoléculas (“partículas”) aisladas sin necesidad de cristalizarlas como requiere la cristalografía de rayos-X. Esta gesta científicotecnológica, se resume en la figura 1, basada - en parte - en la argumentación del Premio Nobel de Química 20174, y que fue bautizada como la “Revolución de la Resolución”5.

 Desarrolló de la Criomicroscopía Electrónica de
partículas aisladas. Los rectángulos coloreados resaltan los hitos alcanzados
con su referencia bibliográfica y resolución alcanzada (en rojo). Arriba se
muestran los microscopistas participantes en la primera GRC 3DEM en 1985. Tres
participantes, Henderson, Frank y Dubochet (Medalla Nobel), fueron galardonados
con el Premio Nobel de Química 2017 por su contribución al desarrollo de la
crio-ME de partícula aislada. Otros participantes contribuyeron a diferentes
hitos y se muestran en círculos con el color correspondiente en la fotografía.
A la derecha se grafica - antes y después de la “Revolución de la Resolución”5
del 2014 - el número acumulado de mapas 3D liberados (curva azul) depositados
en el Protein Data Bank in Europe (PDBe) EM Resources (EMDB), de publicaciones
asociadas a estos mapas (curva verde), y mayor resolución alcanzada cada año
(curva roja). En las abscisas se indican los crio- MEs desarrollados
sinérgicamente por Thermo Fisher Scientific, señalándose los equipados con
detectores directos de electrones (DED) para observar y analizar partículas
aisladas (ver figura 2b-d). Hasta el 2017 se instalaron en el mundo 160 Titan™
Krios™ (figura 2c) y 70 TalosTM Arctica™ (Figura 2d), aunque solo dos en
Latinoamérica (Brasil). Puntos amarillos, azules y rojos: ver texto. Imágenes
reproducidas con permiso de The Nobel Foundation (© ® Medalla Nobel) y Thermo
Fisher Scientific (logos).
Fig. 1:
Desarrolló de la Criomicroscopía Electrónica de partículas aisladas. Los rectángulos coloreados resaltan los hitos alcanzados con su referencia bibliográfica y resolución alcanzada (en rojo). Arriba se muestran los microscopistas participantes en la primera GRC 3DEM en 1985. Tres participantes, Henderson, Frank y Dubochet (Medalla Nobel), fueron galardonados con el Premio Nobel de Química 2017 por su contribución al desarrollo de la crio-ME de partícula aislada. Otros participantes contribuyeron a diferentes hitos y se muestran en círculos con el color correspondiente en la fotografía. A la derecha se grafica - antes y después de la “Revolución de la Resolución”5 del 2014 - el número acumulado de mapas 3D liberados (curva azul) depositados en el Protein Data Bank in Europe (PDBe) EM Resources (EMDB), de publicaciones asociadas a estos mapas (curva verde), y mayor resolución alcanzada cada año (curva roja). En las abscisas se indican los crio- MEs desarrollados sinérgicamente por Thermo Fisher Scientific, señalándose los equipados con detectores directos de electrones (DED) para observar y analizar partículas aisladas (ver figura 2b-d). Hasta el 2017 se instalaron en el mundo 160 Titan™ Krios™ (figura 2c) y 70 TalosTM Arctica™ (Figura 2d), aunque solo dos en Latinoamérica (Brasil). Puntos amarillos, azules y rojos: ver texto. Imágenes reproducidas con permiso de The Nobel Foundation (© ® Medalla Nobel) y Thermo Fisher Scientific (logos).

Para la concreción de dicha gesta fue crucial la realización de las Gordon Research Conferences (GRC) on Three Dimensional Electron Microscopy of Macromolecules (GRC 3DEM) iniciadas en 1985 (Fig. 1) y que se siguen realizando actualmente reuniendo microscopistas electrónicos de muchos países. Estos participantes tenían intereses muy diferentes: unos querían resolver problemas biológicos con microscopía electrónica mientras otros querían desarrollar las técnicas de vitrificación, de registro de imágenes a baja dosis electrónica y reconstrucción tridimensional de biomoléculas, así como desarrollar nuevos criomicroscopios electrónicos, crio-portaespecímenes, detectores directos de electrones y programas computacionales asociados. La figura 1 muestra que esta gesta incluyó cinco etapas previas que permitieron el desarrollo de: (1) microscopios electrónicos y accesorios para baja temperatura, (2) técnicas para la preparación de especímenes biológicos, (3) técnicas de reconstrucción tridimensional y programas computacionales asociados, (4) la criomicroscopía electrónica (crio-ME) de alta resolución per se, y (5) detectores de electrones directos que condujeron finalmente a la (6) crio-ME de partículas aisladas actual.

La tinción negativa, introducida en 1945 y desarrollada en los 16 años siguientes6,7,8, resolvió el problema del daño por radiación y el bajo contraste de los especímenes biológicos mediante el uso de sales de metales pesados como el acetato de uranilo.

El uso de bajas temperaturas para la observación directa de especímenes biológicos congelados-hidratados con moléculas de agua “vitrificadas” fue propugnado ávidamente desde 1960 por Fernández-Morán9 (ver10,11,12,13,14), quién introdujo en 1952 la crio-ultramicrotomía15, en 1960 la crio-substitución16, avanzando en 1963 el concepto de la criomicroscopía electrónica17,18. En 1966 construyó el primer criomicroscopio electrónico con lentes superconductoras a temperatura de helio líquido19 en la Universidad de Chicago (EE.UU.).

 Criomicroscopios electrónicos precursores y de
última generación: (a) primer crio-ME experimental con un conjunto de lente
objetiva superconductora en un criostato plano19 (Cryo-Electron Microscope
Laboratories, University of Chicago, EE.UU.); (b) Crio-MEs Thermo Fisher
Scientific Glacios™; (c) Krios™ G3i y (d) Talos™ Artica™. Imágenes reproducidas
de: (a) Fernández-Morán10 con permiso de Elsevier y (b-d) Thermo Fisher
Scientific.
Fig. 2:
Criomicroscopios electrónicos precursores y de última generación: (a) primer crio-ME experimental con un conjunto de lente objetiva superconductora en un criostato plano19 (Cryo-Electron Microscope Laboratories, University of Chicago, EE.UU.); (b) Crio-MEs Thermo Fisher Scientific Glacios™; (c) Krios™ G3i y (d) Talos™ Artica™. Imágenes reproducidas de: (a) Fernández-Morán10 con permiso de Elsevier y (b-d) Thermo Fisher Scientific.

Este prototipo de crio-ME experimental le permitió registrar las primeras criomicrografías electrónicas de cristales de catalasa congelado-hidratados a 80 Å de resolución, espécimen que se convirtió en la referencia usada en los años subsiguientes para evaluar la resolución alcanzada por los nuevos crio- ME.

La observación de biomoléculas a temperatura ambiente en el microscopio electrónico intentando preservar intacta su hidratación condujo a Parson en 1972 al desarrollo de cámaras ambientales con atmosfera húmeda mantenidas a temperatura ambiente en el microscopio electrónico20,21, y a Unwin y Henderson en 1975 a reemplazar el agua de hidratación por una solución de glucosa22,23 alcanzando una sorprendente resolución de 7Å.

La observación de biomoléculas congelado-hidratadas permitió a Glaeser en 1971 estimar y minimizar el daño por radiación24, sugiriendo que se podía incrementar la relación señal/ ruido promediando conjuntos de partículas aisladas irradiadas a dosis electrónicas bajas. Taylor y Glaeser en 1974 registraron patrones de difracción de electrones de cristales de catalasa a una resolución de 3,4 Å25 obteniendo en 1976 criomicrografías electrónicas a 11,5 Å de resolución de cristales de catalasa efectivamente congelados-hidratados26. A partir de 1981 Dubochet y colaboradores desarrollaron el método actualmente en uso para congelar rejillas de cobre conteniendo biomoléculas en solución acuosa sumergiéndolas rápidamente en etano líquido, logrando alcanzar rutinariamente el estado congelado-hidratado27,28,29.

Klug (Premio Nobel de Química 1982) y sus colaboradores diseñaron métodos para analizar ópticamente micrografías electrónicas de estructuras periódicas teñidas negativamente30,31 o directamente por difracción de electrones32, para calcular modelos 3D de partículas no-helicales33,34. Hoppe estableció nuevos métodos en cristalografía de electrones para analizar la estructura de proteínas35 incluyendo biomoléculas no cristalinas36. Frank, en 1975, encaró el problema de alinear y promediar partículas asimétricas en solución no cristalinas y sin teñir orientadas al azar37. Van Heel y Frank desarrollaron en 1981 un método para clasificar imágenes en clases en base a su orientación38,39. En 1987 Radermacher y colaboradores desarrollaron un método general para determinar la orientación relativa 3D de clases de proyecciones 2D de partículas asimétricas40. A partir de 1996 se desarrollaron programas computacionales para el análisis de partículas aisladas como por ejemplo SPIDER41, IMAGIC42, EMAN43 y RELION44.

Un hito muy importante ocurrió en 1990 cuando Henderson y colaboradores demostraron que podían determinar la estructura a 3,5 Å de resolución de bacteriorodopsina mediante el uso de crio-ME promediando muchas imágenes del mismo objeto45, avance que disparó una secuela de varios estudios de similar alta resolución46,47,48.

Faruqi introdujo en 2003 los detectores de electrones directos basados en tecnología CMOS para registrar directamente las micrografías electrónicas49,50, pero tan solo estuvieron disponibles para los crio-MEs en 2012-2013. Su velocidad permitió un aumento importante en la relación señal/ruido, resolución espacial y el contaje de electrones solucionando el quinto problema de la ME al compensar el movimiento del espécimen causado por la irradiación de electrones y las variaciones de temperatura concomitantes51,52,53. Estos detectores han sido producidos mayormente por Thermo Fisher Scientific y Gatan, Inc.

Los avances en el diseño de los microscopios electrónicos, incluyendo crio-porta-especímenes estables por Heide54 (ver55), permitieron construir los nuevos criomicroscopios electrónicos requeridos para la “Revolución de la Resolución”. La tecnología actual incluye además óptica electrónica con lentes de poder constante para garantizar la máxima resolución de imagen, la optimización del sistema de transferencia libre de contaminación al robot que transfiere hasta 12 muestras de forma automatizada hacia la columna, el Autoloader™.

La compleja saga que condujo a la “Revolución de la Resolución” y la crio-ME de partículas aisladas (figura 1), fue posible gracias a la importante contribución de tres participantes y sus colaboradores al 3DEM GRC en 1985: Dubochet por desarrollar métodos para preparar especímenes congeladoshidratados27,28,29, Frank por desarrollar métodos de partículas aisladas para determinar la estructura de biomoléculas en solución37,38,39,40,41,56, y Henderson por lograr alcanzar resolución atómica en estructuras de biomoléculas por crio-ME22,23,45,50,57. La Academia Real Sueca de Ciencias decidió otorgarles a los tres el Premio Nobel de Química 2017 por “desarrollar la crio-ME para la determinación de la estructura a alta resolución de biomoléculas en solución”4.

Los limites alcanzables actualmente con la crio-ME de partículas aisladas se muestran en la figura 3. Al observar la misma biomolécula congelada-hidratada por crio-ME convenciónal58 (resolución ~20 Å, figura 3a) y por crio-ME de partículas aisladas59 (~6 Å, figura 3b) se observa que en el último caso se disciernen sus tres complejos componentes y las cadenas laterales aminoacídicas de sus contactos interfaciales (figura 3c). La importancia relativa de la resolución alcanzable en una misma biomolécula60 se muestra en la figura 4d. Esta biomolécula es una pequeña enzima soluble implicada en el metabolismo del cancer60 (figura 3eA) cuyo estudio por crio-ME de partículas aisladas reveló que es posible cruzar la barrera de 2 Å de resolución (figura 3eB,C) y obtener estructuras de proteínas de <100 kDa para el estudio de interacción fármaco-blanco (figura 3eD) así como sus estados conformacionales dinámicos (vg. registro de películas a resolución atómica, figura 3eE) facilitando el descubrimiento y optimización de nuevos fármacos.

Estructura del supercomplejo mitocondrial I1III2IV1
determinada por crio-ME58 (a) o crio-ME de partícula aislada59 (b), mostrando
sus complejos I (azul), III (verde) y IV (morado) y la interface III-IV (c);
estructura de glutamato deshidrogenasa60 a una resolución progresiva desde ~20
Å (izquierda) hasta ~1,8 Å (derecha) (d). Mapa 3D del dímero (amarillo/azul)
isocitrato deshidrogenasa apo-IDH1 (eA) mostrando las densidades de las cadenas
laterales en una región α-helical (eB) y otra β-laminar (eC). El mapa de IDH1
acomplejado con el inhibidor ML309 (inserto) se muestra con densidades rojas en
(eD) cercano a la interface del dímero. En (eE) se muestra la superposición de
apo-IDH1 (gris) y las estructuras del IDH1 (amarillo/azul) con el inhibidor
enlazado mostrando los cambios que produce en la estructura terciaria (flechas
negras) y los movimientos globales de la estructura cuaternaria (flechas
amarillas/azules). Imágenes reproducidas de: (a) Althoff et al.58 con permiso
de EMBO y Wiley; (b,c) Letts et al.59 con permiso de
Springer Nature; (d) Merk et al.60, con permiso de ©Martin Höghbom (Universidad
de Estocolmo), Dr. P. Brzezinski (Royal Swedish Academy of Science), Cell y
Elsevier; (e) Merk et al.60 con permiso de Cell y Elsevier.
Fig. 3:
Estructura del supercomplejo mitocondrial I1III2IV1 determinada por crio-ME58 (a) o crio-ME de partícula aislada59 (b), mostrando sus complejos I (azul), III (verde) y IV (morado) y la interface III-IV (c); estructura de glutamato deshidrogenasa60 a una resolución progresiva desde ~20 Å (izquierda) hasta ~1,8 Å (derecha) (d). Mapa 3D del dímero (amarillo/azul) isocitrato deshidrogenasa apo-IDH1 (eA) mostrando las densidades de las cadenas laterales en una región α-helical (eB) y otra β-laminar (eC). El mapa de IDH1 acomplejado con el inhibidor ML309 (inserto) se muestra con densidades rojas en (eD) cercano a la interface del dímero. En (eE) se muestra la superposición de apo-IDH1 (gris) y las estructuras del IDH1 (amarillo/azul) con el inhibidor enlazado mostrando los cambios que produce en la estructura terciaria (flechas negras) y los movimientos globales de la estructura cuaternaria (flechas amarillas/azules). Imágenes reproducidas de: (a) Althoff et al.58 con permiso de EMBO y Wiley; (b,c) Letts et al.59 con permiso de Springer Nature; (d) Merk et al.60, con permiso de ©Martin Höghbom (Universidad de Estocolmo), Dr. P. Brzezinski (Royal Swedish Academy of Science), Cell y Elsevier; (e) Merk et al.60 con permiso de Cell y Elsevier.

Para resolver la estructura atómica de una biomolécula por crio-ME de partículas aisladas en la actualidad primero es necesario caracterizar el espécimen por tinción negativa a fin de obtener un mapa 3D de baja resolución. Solamente cuando las imágenes teñidas negativamente muestran partículas monodispersas con poca agregación y un grado controlable de heterogeneidad, se puede pasar efectivamente a su análisis por crio-EM de partículas aisladas. Este análisis comienza con la vitrificación de la biomolécula para la obtención de imágenes 2D para seleccionar las partículas congeladashidratadas y calcular los promedios 2D que conducen a un mapa 3D inicial, el cual se refina para obtener el mapa 3D final de cuya evaluación se decide si la preparación requiere mejoras adicionales para poder alcanzar resolución casiatómica. Una vez logrado un mapa 3D de resolución casiatómica se procede a su interpretación que conduce al modelo atómico61.

 (a) Centro de Biología Estructural “Humberto
Fernández-Morán” del Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas
(I.V.I.C.) fundado en 1997, sede del Centro Latino-Americano FEI de
Criomicroscopía (CLAFCME) desde 1999 y uno de los nodos del Centro de Biología
Estructural del Mercosur (CeBEM). (b) Primer criomicroscopio electrónico
(Philips CM-120) instalado en Latinoamérica en 1997. (c) Mapa 3D de filamentos
gruesos de músculo de tarántula (resolución 25 Å, ver 20 Å EMD-1950). (d) Modelo
cuasi-atómico de dos motivos de cabezas interactuantes de miosina (IHM) (PDB
3DTP, 3JBH, 3JAX y 5TBY). Imágenes reproducidas con permiso de: (a)
Departamento de Fotografía Científica, I.V.I.C.; (b) Thermo Fisher Scientific;
(c,d) Reimpreso de Woodhead et al.63 con permiso de
Springer Nature.
Fig. 4:
(a) Centro de Biología Estructural “Humberto Fernández-Morán” del Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (I.V.I.C.) fundado en 1997, sede del Centro Latino-Americano FEI de Criomicroscopía (CLAFCME) desde 1999 y uno de los nodos del Centro de Biología Estructural del Mercosur (CeBEM). (b) Primer criomicroscopio electrónico (Philips CM-120) instalado en Latinoamérica en 1997. (c) Mapa 3D de filamentos gruesos de músculo de tarántula (resolución 25 Å, ver 20 Å EMD-1950). (d) Modelo cuasi-atómico de dos motivos de cabezas interactuantes de miosina (IHM) (PDB 3DTP, 3JBH, 3JAX y 5TBY). Imágenes reproducidas con permiso de: (a) Departamento de Fotografía Científica, I.V.I.C.; (b) Thermo Fisher Scientific; (c,d) Reimpreso de Woodhead et al.63 con permiso de Springer Nature.

En Latinoamérica el primer crio-ME (Philips CM-120) se instaló en 1997 en el Centro de Biología Estructural “Humberto Fernández-Morán” del I.V.I.C. de Venezuela (figura 4a,b), sede del Centro Latino-Americano FEI de Criomicroscopía (CLAFCME) desde 1999 y uno de los nodos del Centro de Biología Estructural del Mercosur (CeBEM). El primer mapa 3D de filamentos gruesos de músculo de tarántula teñidos negativamente62 (resolución 50 Å) fue presentado en la 3DEM GRC de 1985 (figura 1) por Crowther, Craig y Padrón (figura 1, puntos amarillos). La estructura cuasi-atómica ajustada rígidamente a un mapa 3D de filamento gruesos de músculo de tarántula congelados-hidratados63 (resolución 25 Å) (figura 4c) condujo al hallazgo del motivo de cabezas interactuantes de miosina (IHM)64,65 (PDB 3DTP66 y 3JBH67 basadas en el mapa 3D de 20 Å de resolución EMD-1950. La figura 4d muestra dos motivos IHM en hélice. Tres autores de este trabajo asistieron a la 3DEM GRC de 1985 (figura 1, Craig, Egelman y Padrón, puntos rojos). Solo dos microscopistas ligados a Latinoamérica estuvieron presentes, van Heel38,39,42 de de los Países Bajos y Padrón de Venezuela (figura 1, puntos azules). Van Heel, con raíces en Brasil desde su niñez, fue galardonado con el Premio Wiley en Ciencias Biomédicas 2017 junto con Frank y Henderson, otorgado por sus “desarrollos pioneros en microscopía electrónica que estan transformando los estudios estructurales de biomoléculas y sus complejos”. Van Heel actualmente esta colaborando con el Laboratorio Nacional de Nanotecnología (LNNano) del Centro Nacional de Investigaciones en Energía y Materiales (CNPEM) de Brasil en el cual se están instalando dos crio-MEs Thermo Fisher Scientific (Talos™ Arctica ™ G2 y Krios™ G3i) que entrarán en operación junto al nuevo sincrotrón SIRIUS, convirtiendo al CNPEM en el laboratorio más avanzado de Biología Estructural en Latinoamérica y permitiendo la realización expedita de estudios por crio-ME de partículas aisladas en Latinoamérica.

Agradecimientos

Las investigaciones de Raúl Padrón han sido financiadas por el Howard Hughes Medical Institute (EE.UU.) y CONICIT (Venezuela) que aportaron el crio-porta-espécimen Gatan 626-DH y el crio- EM Philips CM-120 (figura 4b), y el Centro de Biología Estructural del Mercosur (CeBEM). Agradecemos al Lic. Lorenzo Álamo por su ayuda con las figuras, al Dr. Julio Ortiz por precisar el origen del concepto de crio-ME17,18 y al Lic. Saúl Castro Gómez por sus comentarios sobre Fernández-Morán, la crio-ME y la adjudicación del Premio Nobel de Química 2017.

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