INTRODUCCIÓN

Desde hace unos años, la inseminación artificial caprina se ha difundido mundialmente, sin embargo, sus resultados son muy variables. Los espermatozoides tienden a sufrir daños y deterioros durante la dilución y preservación a las temperaturas bajas. Roy [56] describe como la criopreservación seminal caprina tiene inconveniente al utilizar la yema de huevo (YH), ya que, la glándula bulbo uretral aporta al plasma seminal una enzima fosfolipasa (EYCE) que coagula la (YH) al hidrolizar la lecitina de soya (LS), ocasionando un efecto tóxico para el espermatozoide caprino [20]. Autores como Purdy [51] y Leboeuf y col. [36], han mostrado que al realizar el lavado del semen caprino mejora la sobrevivencia espermática post descongelación. De esta forma, Cabrera y col. [11] concluyeron que el lavado del material seminal es necesario realizarlo cuando la concentración de la (YH) es mayor al 10 %. Por lo tanto se debe remover el plasma seminal en ésta especie, para incrementar motilidad y vitalidad espermática [6, 24, 26, 34,35, 46].

La deshidratación progresiva de los espermatozoides, la alta proporción de células con daño acrosomal, cambios en la distribución de enzimas en las membranas o diferencias en la estructura de la cromatina se pueden inducir en la criopreservación [39]. La vitalidad espermática después de la descongelación depende de muchos factores como: la técnica de congelación, la composición de los diluyentes, dilución, tiempos de congelación y método de descongelación [1], esto puede ser atribuido al estrés oxidativo por la producción de radicales libres [7], lo cual se incrementa al tener mayor número de espermios muertos en el semen, los cuales liberan radicales libres que modifican la función de la membrana de los espermatozoides vivos. Durante la fase de equilibrio, después de la adición del medio crioprotector, pero antes de la fase de congelación, las células inicialmente se deshidratan y disminuyen sutilmente sus dimensiones, lo cual es debido a que el agua fluye del compartimiento intracelular al medio extracelular, luego las células se rehidratan e incrementan sus dimensiones debido a la entrada del agua y el crioprotector al interior celular. Todo este mecanismo propicia a que los espermatozoides vivos se encogen al llegar al equilibrio osmótico, dando como resultado en daños morfológicos en la cola, afectando la motilidad, viabilidad y fertilidad de la célula espermática [2, 13, 32, 52, 60, 61].

Técnicas como la citometría de flujo he estado involucrada en estudios de biología, inmunología, oncología y desde hace un tiempo en la reproducción animal destacando el área de Espermiología. Este sistema permite evaluar un gran número de células (generalmente entre 10,000 células por muestra). Gracias a marcadores fluorescentes se puede conocer las características de cada célula, como su tamaño y complejidad, además de su estructura (superficie, citoplasma, mitocondria y núcleo); logrando obtener resultados con gran especificidad y sensibilidad [8]. La integridad de la membrana espermática en caprinos puede ser observada usando diferentes pruebas de fluorescencia como: Diacetato de carboxyfluorescencia (CFDA) asociado a Yoduro de Propidium (PI: >620 nm) [59], SRBY-14 con PI, CArboxy-SNARF con PI [25, 42]. El PI emite fluorescencia roja cuando se asocia a los ácidos nucleicos del espermatozoide con la membrana celular dañada [10]. Para evaluar el daño mitocondrial varios autores han reportado diferentes tinciones como: JC-1 [41, 47, 50], Rhodamine 123 [17], Mito-Tracker Green FM (MITO), [14, 18, 21] y DiOC₆[40]. Los estudios de Marchetti y col. [38] reportaron correlación (r: 0,48; P≤0,005) entre DiOc6 y PI, por lo que es una de las tinciones más utilizados para monitorear los cambios mitocondriales. El acrosoma puede ser evaluado con lectinas, como la PNA (aglutinina de cacahuete de Arachis hypogaea) o PSA (aglutinina de Pisum sativum), al estar conjugado con tinciones fluorescentes como isotiocianato de fluoresceína (FITC) [22, 31, 45, 48, 49, 53]. La ausencia de la fluorescencia en el espermatozoide es un indicativo de un daño o reacción acrosomal y la fluorescencia es un indicativo de un cromosoma intacto [59].

El objetivo del presente estudio que se dividió en dos fases tuvo como fin evaluar los efectos del método de extracción seminal, de tres diluyentes comerciales y dos razas caprinas sobre integralidad estructural-funcional y la motilidad de los espermatozoides sometidos al proceso de criopreservación. La integridad fue medida cuantificando los cambios derivados sobre la vitalidad, daño acrosomal y mitocondrial y la motilidad al cuantificar la progresión del movimiento espermático y motilidad total porcentual.

MATERIALES Y MÉTODOS

Primer experimento. Se utilizaron 4 machos cabríos adultos mestizos, con edades entre los 15 y 36 meses (mes) de edad y de fertilidad conocida. Los animales fueron sometidos a un ritmo de recogidas de dos veces por semana (sem). En total se recolectaron 64 eyaculados (16 eyaculados por macho) durante un periodo experimental de tres mes. Empleando un electroeyaculador (EE) (Electroyac 5®, Neogen Corporation, Lexinton, KY, EUA) durante las primeras 4 sem del estudio y una vagina artificial (VA) (MINITÜB, 11320, Tiefenbach, Alemania) durante otras 4 sem Las muestras fueron mantenidas en baño maría (modelo YCW-03S, Gemmy Industrial Corp., Taipei, Taiwan), a 37 °C hasta su valoración.

Evaluación y criopreservación de las muestras seminales

Inmediatamente tras la recogida de semen, muestras de esperma fueron evaluadas para determinar el volumen (mL), el pH mediante tiras reactivas, la motilidad masal (%) e individual (%), la concentración espermática (spz/mL y la morfología (%). Para la concentración se prepara una alícuota a dilución 1:200, con formalina al 10%, utilizando una cámara de recuento celular (Neubaüer®). A continuación se homogeneiza la muestra de esperma mediante oscilaciones cuidadosas y tras desechar las 5-10 primeras gotas, se llena la cámara por capilaridad.

Tras la evaluación rutinaria, se centrifugaron a 800 x g durante 5 minutos (min) (Centrifuga Dynac III®, Becton Dickinson, EUA). A continuación, se retiró el sobrenadante y el pellet de espermatozoides fue re-diluido en alícuotas para tres diluyentes, el primero contiene LS, citrato de sodio, fructosa y glicerol al 7%; el segundo consta de YH al 6%, Tris-citrato, fructosa, y glicerol al 6% y un tercer diluyente a base de LS con un porcentaje de 3,5% de glicerol (LSbG). Una vez diluidas hasta una concentración final aproximada de 100 x106 de espermatozoides/mL, las muestras fueron refrigeradas a 4°C durante 2 horas (h), envasadas en pajuelas de 0,5 mL y selladas por ultrasonido con un equipo automático (MPP Quatro, Minitüb, Alemania) y refrigeradas (Equitainer I, Hamilton Research Inc., EUA) nuevamente a 4°C por 20 min. Finalmente, las pajuelas de cada tratamiento fueron congeladas en vapores de nitrógeno líquido, colocándolas a 4 centímetros (cm) de la superficie del nitrógeno, durante 15 min para seguidamente sumergirlas en nitrógeno líquido a -196°C.

Análisis de la vitalidad (V) y daño mitocondrial (DM)

Las muestras congeladas fueron transportadas al laboratorio de Citometría de flujo de la SUI de la Universidad de Antioquia (Colombia) en un tanque de nitrógeno líquido (Taylor-Wharton®, XTL3, 4075 Hamilton Blvd. Theodore, AL 36582), donde se procedió a realizar la valoración de los parámetros en el citómetro de flujo (BD FACSCanto II). Se evaluó un total de 50 pajuelas, previamente elegidas al azar y descongeladas en baño maría a 37ºC durante 5 min. Para esta prueba se utilizó una doble tinción DiOc6/PI, en una alícuota de 250 µL de semen (se preparó 1 x 106 células/mL) se mezcló con DiOC6 (Invitrogen, Eugene, OR) y yoduro de propidio (PI) (Sigma–Aldrich, Inc. 3050 Spruce Street St. Louis, MO 63103, EUA). Las suspensiones celulares se tiñeron con 2,5 µL de DiOC6 a una concentración de 4 µM y 2,5 µL de PI a una concentración de 50 µg/mL (1:200). Las células se incubaron a 20°C 25 min a 37°C. La lectura se realizó inmediatamente en el citómetro de flujo FACS Canto II (Becton, Dickinson), con un láser de argón de longitud de onda de 488 nm. Los resultados fueron analizados usando el programa Flow Jo ® V 10.0.

Análisis de la motilidad espermática

Para la valoración de la motilidad (MOT) y progresividad (PROG) se tomaron 5Μl de semen y se colocaron en cámaras Leja® (Nieuw Vennep, Holanda) de 20µ. Posteriormente se capturaron los espermatozoides en movimiento en el microscopio (Olympus BX40, Olympus Optical Co., Ltda., Tokio, Japón) con objetivos de contraste de fases a 200X con el fin de guardarlos como imágenes digitalizadas. La valoración de los parámetros cinéticos fue realizada mediante el sistema CASA (Sperm Class Analyzer (SCA® versión 2002, Microptic, Barcelona, España). Se evaluaron un total de 280 pajuelas, según la metodología descrita por Grajales y col. [23] para el macho cabrío, previamente elegidas al azar y descongeladas en baño maría (modelo YCW- 03S. Taipei, Taiwan) a 37ºC durante 5 min. En cada análisis, los campos microscópicos fueron aleatoriamente capturados en 2 gotas, empleando un microscopio de contraste de fases negativo (Olympus BX40, Olympus Optical Co., Ltda., Tokio, Japón) a 200 X. Por cada muestra de semen evaluado fueron tomados como mínimo 5 fotografías, contabilizándose como mínimo 1000 espermatozoides por muestra.

Segundo experimento. Se utilizaron 7 machos cabríos adultos mestizos, con edades entre los 12 y 36 mes de edad y de fertilidad conocida. Los animales fueron sometidos a un ritmo de recogidas 1 vez por semana. En total se recolectaron 56 eyaculados (8 eyaculados por macho) durante un periodo experimental de tres mes. Con vagina artificial (VA) (MINITÜB, 11320, Tiefenbach Alemania). Las muestras fueron diluidas 1:1 en Biladyl ® (Fracción A) y mantenidas a 37°C hasta su valoración.

Las evaluación, la criopreservación de las muestras seminales junto con los análisis de la vitalidad, daño mitocondrial y motilidad espermática se hicieron con igual metodología del experimento uno. Solo que se utilizaron dos diluyentes del primer experimento: uno a base LS y otro de YH al 6%.

Integridad de la membrana Acrosomal (IMA). Una alícuota de (5µL) de semen de cada tratamiento fueron colocados en un portaobjetos y secados al aire y con un lavado de 2 mL de alcohol industrial (95 %), luego se le agrega 20 µL de FITC-PNA (Sigma, L7381, lote #102M4102V, EUA) trabajando con una solución (100 µg/mL) se incuba por un periodo de 20 min (en la oscuridad), luego se llevan para su evaluación a un microscopio de fluorescencia (X 1000, MVX10, Olympus, EUA) se realizó el conteo de 100 espermatozoides, los cuales fueron clasificados en intactos y reaccionados. Aquellos que se teñían de verde fluorescente tenían el acrosoma intacto (ACI) y como (ACR) acrosoma reaccionado cuando el verde fluorescente no estaba presente en la región de la cabeza, o cuando estaba presente en la región ecuatorial de la cabeza del espermatozoide.

Análisis estadístico. Se aplicó un diseño Factorial (A*B), en el primer experimento se tiene en cuenta la forma de toma del semen y los diluyente, en el segundo experimento se tiene en cuenta los diluyente y la raza de los animales, los datos obtenidos fueron procesados mediante el procedimiento Lineal General (PROG GLM) del paquete estadístico SAS (Statistical Analysis System Institute, versión 9.1, 2002). Cuando se observaron diferencias significativas (P<0,05), las medias fueron comparadas mediante la prueba de Tukey.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Motilidad y progresividad. En el primer experimento se observa que la motilidad y progresividad espermática postdescongelación presentan los mejores valores al utilizar VA que EE (P≤0,05), en los diluyentes LS y YH no existió diferencias significativas (P≥0,05), en el segundo experimento no existieron diferencias (P≥0,05) entre las razas de los animales y los diluyentes para la variable de motilidad, mientras que la variable progresividad la LS mostró mejores valores (P≤0,05) para las muestras refrigeradas a 2h (4°C). En el semen postdescongelado la LS evidencia mejores resultados (P≤0,05), la variable raza no muestra diferencias estadísticas (P≥0,05).

Daño mitocondrial y viabilidad. En la primera investigación se muestra como los daños mitocondriales se presentaron en los dos factores método de extracción y diluyentes (P≥0,05). Pero la viabilidad demuestra diferencias significativas (P≤0,05), para las muestras tomadas con EE y el diluyente YH. Para el segundo experimento el daño mitocondrial es menor con LS y los espermios de la raza Saanen (P≤0,05).

Integridad de la membrana acrosomal. En el segundo experimento no se evidencia daños en la membrana acrosomal en ninguno de los factores estudiados (P≥0,05).

En la FIG. 1 se observa la metodología usada para observar el tamaño (FSC) y granularidad (SSC) de los espermatozoides y los controles para las tinciones.

FIGURA 1
EJEMPLO DE LA ESTRATEGIA PARA LA MEDICIÓN DEL DAÑO MITOCONDRIAL DEBIDO AL CAMBIO EN EL ESTADO DE TRANSICIÓN (∆ΨM) CON DIOC6 (700 NM) Y EL DAÑO EN LA MEMBRANA CELULAR CON PI (10 ΜG/ML) EN ESPERMATOZOIDES, EN EL PANEL (A) SE OBSERVA LA DISTRIBUCIÓN DE LOS ESPERMATOZOIDES DE ACUERDO CON SU TAMAÑO (FSC) Y GRANULARIDAD (SSC). EN (B) LA ESTRATEGIA PARA EXCLUIR AGREGADOS CON LOS PARÁMETROS FSC- AREA Y FSC-HEIGHT. CON LOS CONTROLES POSITIVOS PARA PI (C) Y POSITIVOS PARA DIOC6 (D).

TABLA I

EFECTO DE MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y DILUYENTE SEMINAL SOBRE LA VITALIDAD ESPERMÁTICA Y DAÑO MITOCONDRIAL EN SEMEN POST DESCONGELADO DE CAPRINOS. (PRIMER EXPERIMENTO)

(a, b; A, B): Letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas (P<0,05).

TABLA II

EFECTO DE DILUYENTE SEMINAL Y LA RAZA EN LA VITALIDAD ESPERMÁTICA Y DAÑO MITOCONDRIAL (SEGUNDO EXPERIMENTO)

(a, b; A, B): Letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas (P<0,05).

FIGURA 2
A. MORTALIDAD Y VIABILIDAD DE LOS ESPERMATOZOIDES Y LA INTERACCIÓN ENTRE SUS DILUYENTES Y LA RAZA (EXPERIMENTO 2), B. MOTILIDAD Y PROGRESIVIDAD DE LOS ESPERMATOZOIDES A REFRIGERACIÓN POR 2 HORAS (4°C) Y POSTDESCONGELACIÓN, C. INTEGRIDAD DE LA MEMBRANA ACROSÓMICA (FICT-PNA).

TABLA III

INTEGRIDAD DE LA MEMBRANA ACROSOMAL

(a, b; A, B): Letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas (P<0,05).

Es el primer trabajo donde se valora parámetros de viabilidad, actividad mitocondrial y mortalidad espermática por medio de tinciones como DiOC6 y PI comparando el método de extracción seminal y el efecto de tres diluyentes (primer experimento), donde el mejor método colecta seminal fue vagina artificial, junto con los medios LS y YH, el efecto del EE se ve marcado en la MOT (EE: 20,35±2,98 % Vs VA: 47,41±4,28 %) y Progresividad. En éste experimento el centrifugado se hizo directamente con los medios de congelación (1:1), extrayendo el plasma seminal. Es importante comentar que este manejo induce una disminución en la actividad antioxidante e incremento de los ROS, lo cual contribuye a la generación de sustancias tóxicas que causan daño de integridad acrosomal y mitocondrial afectando el ADN, disminuyendo la viabilidad espermática, según lo expuesto por Aitken y Kopper [3], Ferreira y col. [19] y Ledesma y col. [37]. Eso podría explicar los resultados obtenidos con ambos métodos al evaluar el daño mitocondrial (EE: 83,40±4,26 % Vs VA: 71,63±4,93 %).

Al observar los resultados de citometria se tiene en cuenta el índice de fluorescencia (MFI) y el coeficiente de variación (CV). Cambios en la MFI, pueden indicar algún efecto, lo mismo que incrementos en el CV. Éstos pueden ser interpretados como variaciones en la captación del DIOC6 que pueden ser debidas a disfunción mitocondrial. Incrementos en la captación del DIOC6 se asocian con estrés oxidativo o con hiperpolarización mitocondrial como se observó en estos espermatozoides caso igual fue reportado por Yang y col. [62].

En el segundo experimento, se trabajó con VA y la toma seminal se hizo con un diluyente sin glicerol (Biladyl® A) 1:1, el diluyente LS mostró espermatozoides con mejor viabilidad, motilidad y progresividad, los daños mitocondriales en éste experimento a pesar de ser significativos, mejoran por lo que se evidencia que el problema deriva de la toxicidad al glicerol en los espermatozoides del primer experimento, que tenían el desde la toma contacto con criopreservante [5]. Estos resultados son consistentes con aquellos obtenidos por Sariözkan y col. [58] y Roof y col. [55] corroborando que la composición de diluyente es crucial para la protección de los espermatozoides contra la criopreservación [27]. Bathgate y col. [9]. Demostraron que, a medida que aumenta el porcentaje de yema de huevo en los diluyentes para caprinos, decrece la motilidad y la viabilidad. Los cambios estructurales que suceden en el proceso de criopreservación, a nivel celular causan daños irreversibles en los espermatozoides y afectan la motilidad [15, 16]. Según Krishnakumara y col. [33] concluyeron que el uso de un medio diluyente libre de proteína animal (LS), presenta mejor respuesta dado a que su contenido de fosfolípidos es derivado a partir de extracto de soya. Sus lipoproteínas de baja densidad son mediadas por la colina [57], protegiendo a la célula espermática durante la criopreservación, otro mecanismo de la lecitina es la capa que forma sobre la superficie de la membrana espermática para evitar los daños de los cristales de hielo [44], sustituyendo algunos fosfolípidos en la membrana de este modo disminuye la fase transición en el momento de la criopreservación.

Con relación a los parámetros de esperma evaluados por citometría de flujo en el presente estudio, los valores más altos de espermatozoides vivos (P≥0,05) y con mitocondrias activas (P≥0,05) se encontraron en muestras criopreservadas en el diluyente YH, pero hay que tener en cuenta los altos CV (P≤0,03) encontrando resultados diferentes a los reportados por Jimenez- Rabayan y col. [28].

Sin embargo, el mecanismo por el cual el glicerol y YH podrían reducir la integridad de la membrana acrosomal queda por esclarecer. Sin embargo se podría sugerir que, el tiempo de incubación los espermatozoides con este diluyente antes de la congelación podrían desempeñar gran parte del aumento en el porcentaje de espermatozoides sometidos a la reacción acrosomal, resultando después de la descongelación una alta proporción de daño en la membrana del acrosoma.

Otra particularidad del segundo experimento tiene que ver con el efecto raza donde los machos de la raza Saanen (S), supera a los alpinos (A) en los parámetros evaluados (P≤0,05). Chandler y col. [12] encontraron diferencias espermáticas (volumen, progresividad, concentración y anormalidades) entre la raza A y S. mostrando que los animales S fueron superiores, Karagiannidis y col. [30] evaluaron la motilidad espermática con valores de 59,8 y 64,4 %, para A y S respectivamente. Zamfirescu y Nadolu [63]; compararon las dos razas y obtuvieron motilidades postdescongelación de 46,34 y 56,12 %. Kamal y col. [29] encontraron diferencias espermáticas entre las razas Saanen y Nubiana, presentando similitud a los datos obtenidos en el presente estudio. Sin embargo, hay muy poca la información sobre la fisiología del plasma seminal, no se sabe si la fructosa, el ácido cítrico o la actividad de la fosfatasa alcalina es afectada por la condición racial como sucede en los estudios de Ali y Mustafa.; [4], Mendoza y col. [43], Roca y col. [54] y Zamiri y Heidaari, [64].

En conclusión la LS es un buen medio de criopreservación, al observar la viabilidad, integridad de la membrana, la integridad mitocondrial, la motilidad y la progresividad para la congelación de semen caprino. Sin embargo, es necesario evaluar antioxidantes con el fin de mejorar la efectividad en el proceso de criopreservación de espermatozoides caprinos para ser incorporados en programas de inseminación artificial o para la conservación en bancos de germoplasma. Resultados del presente estudio contribuyen a la estandarización y al proceso de evaluación de semen en la especie caprina.

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Notas