RELACIÓN DE LA RACIÓN CONSUMIDA CON LOS ÁCIDOS GRASOS IMPARES Y RAMIFICADOS DE LA LECHE EN CABRAS

Relationship between the diet fed to goats and the odd and branched chain fatty acid contents in their milk

Los ácidos grasos impares y ramificados (AGIR) son componentes singulares de la grasa de la carne y la leche de los rumiantes, siendo estos alimentos los únicos aportes importantes de AGIR a la dieta humana. Los AGIR de cadena media y larga son sintetizados por los microorganismos ruminales a partir de ácidos grasos volátiles (AGV) producidos durante la degradación de los carbohidratos y los aminoácidos presentes en la ración suministrada a los animales [8]. Su bajo punto de fusión hace que sean incorporados preferentemente en las membranas celulares microbianas para contribuir al mantenimiento de su fluidez [20]. La mayoría de los AGIR microbianos absorbidos en el intestino delgado se incorporan a la grasa láctea (GL) sin modificaciones, pero en algunos casos puede ocurrir su Δ-9 desaturación y elongación [4, 22]. Adicionalmente, los ácidos grasos impares de cadena más corta (5 a 11 átomos de carbono) y los ácidos grasos ramificados con grupos metilo no terminales pueden ser sintetizados por la glándula mamaria, utilizando como sustratos el ácido propiónico y su derivado el ácido metilmalónico, respectivamente, en lugar de acetil-CoA [5, 17].

La cuantificación de los AGIR de la GL ha despertado gran interés en los últimos años. Debido a su origen y las relaciones encontradas con la dieta y la población microbiana ruminal, se considera que los AGIR pueden ser utilizados como indicadores biológicos de la función ruminal [4, 21]. Otro motivo de interés son los potenciales efectos inhibitorios de algunos de ellos sobre células tumorales [3, 23] y la relación de su consumo con el menor riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares [10]. Adicionalmente, los ácidos grasos con grupos metilo no terminales se consideran exclusivos de la leche de cabra (Capra hircus) y oveja (Ovis aries), ya que no aparecen en la leche de vaca (Bos taurus) [7, 15], y son relevantes por las propiedades organolépticas que confieren a los productos lácteos [24].

Es bien sabido que la adición de suplementos lipídicos a la ración de las hembras rumiantes puede modificar el perfil de ácidos grasos de la GL por diversos mecanismos a nivel ruminal y mamario [1]. Recientes estudios han reportado los efectos de la adición de aceites vegetales ricos en ácidos grasos insaturados a la dieta sobre los ácidos grasos de la leche caprina, incluyendo diversos AGIR [2, 11, 18, 19]. A pesar de lo anterior, no se han encontrado trabajos publicados en los que se hayan utilizado los contenidos de AGIR de la leche como indicadores de la adición de aceites vegetales a la dieta de cabras.

El análisis discriminante es un técnica estadística multivariada que puede utilizarse para construir un modelo predictivo de discriminación de grupos a partir de predictores observados y clasificar las observaciones en uno de los grupos identificados. El análisis discriminante lineal se ha utilizado con éxito para diferenciar la ración consumida por los animales a partir de determinados ácidos grasos identificados y cuantificados en la GL de vaca y cabra mediante cromatografía gaseosa [6, 12].

El objetivo del presente trabajo fue utilizar el análisis discriminante lineal para determinar la utilidad específica de los AGIR cuantificados en la GL como predictores de la inclusión de aceites vegetales de diferente grado de insaturación en la dieta suministrada a cabras.

En el presente trabajo se utilizaron los datos de composición de 94 muestras individuales de GL obtenidas en una serie de cinco experimentos que investigaron los cambios de los ácidos grasos de la leche en respuesta a la inclusión de aceites vegetales en la dieta de cabras [11, 13, 14]. Los procedimientos experimentales cumplieron con la normativa española vigente sobre protección de animales de experimentación. En todos los experimentos se utilizó una dieta basal común con heno de alfalfa (Medicago sativa) y un concentrado granulado, que sirvió de control, a la que se añadieron 48 gramos (g) / día (d) de aceite de girasol (Helianthus annuus), alto oleico o normal, o aceite de lino (Linum usitatissimum), de acuerdo con los tratamientos del diseño experimental (TABLA I). Todos los experimentos se llevaron a cabo en el Centro Usuario de Animales de Experimentación del Departamento de Producción Animal de la Universidad de Córdoba. Se utilizaron cabras de raza Malagueña en segunda lactación durante el experimento 1 (72 ± 26 d de lactación y 45,9 ± 3,7 kilogramos (kg) de peso vivo (PV) inicial) [11] y en tercera lactación durante el experimento 2 (45 ± 5 d de lactación y 47,2 ± 4,2 kg de peso vivo (PV) inicial) [14], así como en los experimentos 3, 4 y 5 (70 ± 5 d de lactación y 46,6 ± 3,7 kg de peso vivo (PV), al comienzo de la serie de experimentos) [13]. En los experimentos 1 y 2, las muestras de leche se recogieron tras 21 d de adaptación a las dietas experimentales [11, 14], mientras que en los experimentos 3, 4 y 5 se procedió a la recogida de muestras tras 15 d de adaptación [13]. Los animales se alojaron individualmente en jaulas de 1,0 x 1,4 metros (m) con suelo permeable a los excrementos y dotadas de comederos y bebederos independientes. La ración se preparó diariamente para cada una de las cabras y se repartió en dos comidas iguales a las 9:30 y 16:00 horas (h). El ordeño se realizó individualmente, una vez al día, a las 8:30 h utilizando el sistema de ordeño mecánico instalado en el alojamiento (DeLaval, Madrid, España) y apurado manual. Las muestras de leche individuales se recogieron en el último día de cada período experimental y se conservaron congeladas a -20ºC (BD-379RAA, Haier, España) hasta su análisis cromatográfico.

Los procedimientos de identificación y cuantificación de los ácidos grasos de la GL están detallados [13]. La grasa láctea GL se extrajo por doble centrifugación. La primera centrifugación se hizo a 17800 g durante 30 minutos (min) (Avanti 30, Beckman, Fullerton, EUA) y la segunda se hizo a 19300 g durante 20 minutos (5415D, Eppendorf, Hamburgo, Alemania). Los ésteres metílicos se obtuvieron por metilación básica (KOH/metanol). La composición de ácidos grasos de la grasa se determinó mediante cromatografía de gases (Agilent 6890 N Network System, Palo Alto, EUA), utilizando una columna capilar de sílice fundido CP-Sil 88 (100 m de longitud, 0,25 mm de diámetro interno y 0,20 mm de grosor de la película interna (Varian, Middelburg, Holanda). El gas portador (helio) operó a una presión constante de 236 kilopascales (kPa) y la temperatura del inyector y del detector fue 250 ºC. La temperatura inicial del horno fue 160 ºC durante 80 min, después se elevó 10 ºC/min hasta 210 ºC y se mantuvo constante durante 35 min. La cuantificación de los ésteres metílicos de ácidos grasos individuales se realizó con referencia a una GL de composición certificada (CRM 164; European Community Bureau of Reference, Bruselas, Bélgica). Los resultados se agruparon en cuatro clases de acuerdo con la ración suministrada a los animales: sin aceite añadido (CON), o con aceite de girasol alto oleico (GAO), aceite de girasol normal (GN) o aceite de lino (LIN).

Para el estudio se utilizó el programa SAS University Edition 3.5 (SAS Institute, Cary, NC, EUA). En primer lugar, los ácidos grasos y las relaciones entre ácidos grasos a incluir como variables predictoras en el modelo se seleccionaron con el procedimiento STEPDISC, con probabilidades para entrar y salir del modelo de 0,10 y 0,20, respectivamente. A continuación, se utilizó el procedimiento DISCRIM para determinar los coeficientes de las variables predictoras en las funciones discriminantes lineales. En este procedimiento, se incluyó la opción CROSSVALIDATE para comprobar la robustez de las funciones obtenidas. El procedimiento ANOVA se utilizó para la interpretación de los resultados.

Debido a que los animales se mantuvieron en las mismas condiciones de manejo y alojamiento y las raciones basales fueron prácticamente idénticas (TABLA I), todos los cambios en los contenidos de AGIR de la leche estarían relacionados con el efecto de los aceites añadidos a la ración sobre el metabolismo ruminal y/o mamario. Los ácidos oleico (C18:1 cis-9) y linoleico (C18:2 cis-9, cis-12) fueron mayoritarios en los tratamientos GAO y GN, respectivamente. El tratamiento LIN fue el único que aportó cantidades relevantes de ácido α-linolénico (C18:3 cis-9, cis-12, cis-15). El tratamiento CON no aportó otros ácidos grasos que los de la dieta basal, siendo mayoritario el ácido linoleico [9].

En las muestras de GL se identificaron 21 AGIR que eluyeron individualmente, de un total de 82 ácidos grasos. Tres AGIR individuales y una suma fueron seleccionados como variables predictoras en el análisis discriminante (TABLA II). La prueba de Wilks (λ = 0,40) fue altamente significativa (P < 0,001), indicando que el análisis discriminante era aplicable a los datos del presente estudio. La primera función discriminante canónica explicó el 90,9% de la varianza observada entre los grupos (FIG 1). Las correlaciones canónicas no fueron significativas en las funciones 2 y 3 (P = 0,12 y 0,88, respectivamente). Las distancias de Mahalanobis entre el tratamiento CON y los tratamientos con aceite fueron similares (5,1 a 6,6; P < 0,001). Entre los tratamientos con aceite, la mayor distancia se observó entre los tratamientos GN y GAO (0,95; P < 0,05). No hubo diferencias en las distancias del tratamiento LIN con los tratamiento GAO (0,27; P = 0,58) y GN (0,48; P = 0,28).

TABLA I
COMPOSICIÓN DE LAS RACIONES UTILIZADAS (CON, RACIÓN BASAL SIN ACEITE AÑADIDO; GAO, RACIÓN CON ACEITE DE GIRASOL ALTO OLEICO; GN, RACIÓN CON ACEITE DE GIRASOL NORMAL; LIN, RACIÓN CON ACEITE DE LINO)

^aLa dieta basal aportó 4,8, 0,7, 5,5, 14,2 y 3,0 g/d de C16:0, C18:0, C18:1cis-9, C18:2 cis-9,cis-12 y C18:3 cis-9,cis-12,cis-15, respectivamente.

^bLa dieta basal aportó 5,1, 0,8, 6,9, 14,4 y 3,4 g/d de C16:0, C18:0, C18:1cis-9, C18:2 cis-9,cis-12 y C18:3 cis-9,cis-12,cis-15, respectivamente.

^cComposición (g/kg): maíz, 375; cebada, 374,9; harina de soja, 200; premezcla de vitaminas y minerales (Maxi Nutral Ovejas, Nutral, Madrid, España), 30; aglomerante (Exal, Tolsa, Madrid, España), 20; antioxidante (Luctanox, Lucta, Barcelona, España), 0,1. dIncluido en el concentrado respectivo.

TABLA II
RESULTADOS DEL ANÁLISIS DISCRIMINANTE (CON, RACIÓN BASAL SIN ACEITE AÑADIDO; GAO, RACIÓN CON ACEITE DE GIRASOL ALTO OLEICO; GN, RACIÓN CON ACEITE DE GIRASOL NORMAL; LIN, RACIÓN CON ACEITE DE LINO)

De acuerdo con los valores de los centroides (TABLA II, FIG. 1), la función 1 discriminó el tratamiento CON de los tratamientos con aceite. Los coeficientes estandarizados indicaron que las variables con mayor capacidad discriminante en la función 1 fueron C7:0 en sentido negativo y metiltetradecanoato en sentido positivo. El análisis univariado de los datos mostró que no hubo diferencias en la suma de los contenidos de C7:0 y metiltetradecanoato (P=0,19) ni en la suma de los contenidos de los ácidos grasos impares de cadena corta (C5:0, C7:0 y C9:0) y los ácidos grasos con grupos metilos no terminales (metiloctanoato, metildecanoato, metiltetradecanoato y metildodecanoato) incluidos en el presente estudio (P = 0,38).

FIGURA 1
UNTUACIONES DISCRIMINANTES DE LAS OBSERVACIONES INDIVIDUALES PARA CADA UNO DE LOS TRATA- MIENTOS EN LAS DOS PRIMERAS FUNCIONES CANÓNICAS (CON, RACIÓN BASAL SIN ACEITE AÑADIDO; GAO, RACIÓN CON ACEITE DE GIRASOL ALTO OLEICO; GN, RACIÓN CON ACEITE DE GIRASOL NORMAL; LIN, RACIÓN CON ACEITE DE LINO)

Por tanto, los resultados obtenidos sugirieron que el ácido propiónico que escapó al metabolismo hepático y estuvo disponible para la síntesis de ácidos grasos en la glándula mamaria fue similar entre tratamientos, siendo incorporado a la GL, previa conversión a ácido metilmalónico, en mayor medida en las cabras que consumieron el tratamiento CON [5, 16, 17]. De acuerdo con lo anterior, los tratamientos con aceite pudieron modificar el aroma de la leche en comparación con el tratamiento CON [24].

Succinomonas amylolytica, Prevotella spp.

Las funciones discriminantes de Fisher y la tasa de acierto en la clasificación de las observaciones se muestran en la TABLA III. La tasa de acierto fue muy superior en las observaciones del tratamiento CON que en los tratamientos con aceite. En éstos, la mejor tasa de acierto se observó en el tratamiento GN y la peor en el tratamiento GAO. Las observaciones del tratamiento GAO se confundieron en gran medida con las del tratamiento LIN, y las de este se confundieron principalmente con las del tratamiento GN. El porcentaje de acierto global en la validación cruzada (53,2%) fue inferior a los encontrados en estudios previos [6, 12] (100 y 98,9%, respectivamente), pero en dichos trabajos no se investigó la habilidad discriminante de un grupo específico de ácidos grasos de la GL. En el presente trabajo, las variables predictoras se seleccionaron únicamente entre los AGIR. En el trabajo de Gaspardo y col. [6] todos los ácidos grasos identificados (un total de 53) se utilizaron como variables predictoras, mientras que en el trabajo de Martínez-Marín y col. [12] se seleccionaron hasta 20 variables predictoras de los 82 ácidos grasos identificados en total.

TABLA III
FUNCIONES DISCRIMINANTES DE FISHER Y TASAS DE ACIERTO CON LA MATRIZ ORIGINAL Y TRAS LA VALIDACIÓN CRUZADA (CON, RACIÓN BASAL SIN ACEITE AÑADIDO; GAO, RACIÓN CON ACEITE DE GIRASOL ALTO OLEICO; GN, RACIÓN CON ACEITE DE GIRASOL NORMAL; LIN, RACIÓN CON ACEITE DE LINO)

Se comprobó que el análisis discriminante lineal permitió separar de forma acertada las muestras de GL de cabras que consumieron raciones sin aceite de las de aquellas cuya ración incluyó aceites vegetales, a partir de los contenidos de tan solo cuatro AGIR (C7:0, metiltetradecanoato, C15:0 iso y la suma de C17:0 + C17:1 cis-9), identificados y cuantificados por cromatografía gaseosa. Sin embargo, la clasificación de las muestras de grasa láctea de acuerdo con el grado de insaturación de los aceites suministrados a los animales tuvo una baja tasa de aciertos. Los AGIR de la GL fueron mejores indicadores de la presencia de aceite vegetal en la ración que del tipo de suplemento lipídico incluido en la misma.