Se colectaron muestras de raíces con nódulos de las leguminosas Phaseolus vulgaris L. (1), Cajanus cajan (2), Vigna sp. (3) y Leucaena leucocephala (4) localizadas en los campus de prácticas agrícolas de la Universidad Estatal Península de Santa Elena: Río Verde (-2.31096, -80.7056), Manglaralto (-1.937, -80.71689) y La Libertad (-2.24887, -80.858), las cuales fueron guardadas y rotuladas en bolsas estériles. En el laboratorio fueron lavadas cuidadosamente con agua corriente y destilada estéril (mapa 1) (Madigan et al., 2004; Zúñiga, 2012).

Mapa 1
Localización de los sitios de muestreo en la provincia de Santa Elena, Ecuador
Fuente: elaboración propia.

Los nódulos se desinfectaron en alcohol de 95% y solución de cloro al 5% por 5 min respectivamente. Se enjuagaron también con agua destilada, macerados y sembrados por triplicado en cajas Petri con medio de cultivo extracto de levadura-manitol-agar rojo-congo (LMARC) (Zúñiga, 2012). Luego fueron rotulados, incubados y codificados por 72 horas a 27 ˚C (tabla 1).

Tabla 1
Origen y codificación de los aislados bacterianos

Fuente: elaboración propia.

Se emplearon microscopios de luz, objetivo 100x inmersión en aceite para observar la forma y coloración de las bacterias (tinción Gram). La ultramicroscopía se realizó en el Instituto de Investigaciones en Salud Pública (INSPI) (Guayaquil, Ecuador) con un microscopio electrónico de barrido (MEB), en muestras del interior de los nódulos y cultivadas en cajas Petri. La descripción macroscópica también incluyó la producción de goma y velocidad de crecimiento de los aislados en los platos de cultivo (Ferrera y Alarcón, 2001).

La extracción del ADN se realizó suspendiendo de una a dos colonias aisladas en 500 μl de medio PBS 1x (Phosphate Buffered Saline, pH 7.4) en tubos de 1.5 ml y centrifugados por 3 min a 10 000 rpm, formando un pellet. Se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el pellet en 200 μl de solución TE (Solución Tris-EDTA). La suspensión se llevó a ebullición por 10 min colocado sobre hielo por 5 min. Luego se centrifugó por 2 min a 10 000 rpm y se transfirieron 10 μl del sobrenadante a un nuevo microtubo que contenía 90 μl de agua ultra pura, desechando el pellet. Se aplicó 1 μl de ARNasa a cada tubo. La concentración y calidad del ADN de las muestras fue calculada por absorbancia a longitud de onda 260 y 280 nm con un Nanodrop 2000 C (Thermo, USA). La concentración de trabajo para las amplificaciones se calculó en 10 ng/μl diluyendo el ADN puro con agua Milli-Q (Zúñiga, 2012).

La amplificación de las muestras se realizó en un termociclador Biometra, con un volumen de reacción de 25 μl, conteniendo 12.5 μl de Master mix (Thermo Scientific Taq DNA Pol. with KCL Buffer), 9.3 μl de agua Milli-Q, 0.6 μl de primer 27F, 0.6 μl de primer 1492R y 2 μl de ADN bacteriano; la secuencia de los primeros universales: 27F-5¹AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3¹ y 1492R-5¹ GGTTACCTTGTTACGACTT3¹. El procedimiento se inició rotulando los tubos de las muestras y luego mezclando la reacción Master Mix que contiene Buffer KCL, MgCl², dNTPs, primer fD1, primer rD1, Taq ADN Polimerasa, ADN (muestras) y agua Milli-Q. Se depositó en tubos limpios y estériles de primer uso para la PCR en el termociclador programado (Quatrini et al., 2001), que amplificó la región de 1 500 pb correspondientes al gen 16S ARNr (cuadro 1). El resultado fue observado en gel de electroforesis al 1.5% de agarosa y buffer TBE 1x con 6 μl de bromuro de etidio a través del transiluminador (Lane, 1991).

Cuadro 1
Ciclos y temperaturas empleados en PCR del gen 16S ARNr de los aislados bacterianos de nódulos de leguminosas

Fuente: Quatrini et al., 2001.

Una vez verificada la presencia de las bandas de 1 500 pb de todos los aislados bacterianos, se rotularon con el código y fecha respectiva. Se empleó el servicio de secuenciación de Macrogen Inc. y se adjuntó la muestra de los primers 27F y 1492R. Luego todas las secuencias generadas por la secuenciación de cada cepa fueron alineadas y corregidas manualmente empleando el software BioEdit y Chromas Lite. Para finalmente ser comparadas con la base de datos del National Center for Biotecnology Information^[1] empleando BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Zúñiga, 2012).

La microscopía de luz y electrónica, coloración y velocidad de crecimiento de los aislados mostraron la presencia de bacterias bacilares Gram negativas blanquecinas, transparentes-cremosas y mucoproductoras entre uno y siete días de crecimiento en todos los cultivos aislados en medio LMARC, típicos de la mayoría de rizobacterias (figuras 1 y 2) (Colwell, 1970; Ferrera et al., 1993; Somasegaran y Hoben, 1994; Mantilla et al., 2009).

Figura 1
Caracterización fenotípica de los aislados bacterianos a partir de nódulos de leguminosas en la provincia de Santa Elena

Nota: (A) Corte transversal de nódulos de Cajanus cajan con coloración rojiza (leghemoglobina). (B) Aislados de nódulos sembrados en medio LMARC. (C) Bacilos Gram (-) observados con objetivo100x (inmersión en aceite).

Fuente: elaboración propia.

Figura 2
Microfotografías de cortes histológicos del interior de los nódulos

Nota: (A) Microfotografías en secuencia de microscopía electrónica de barrido (SEM) del interior de un nódulo de Leucaena leucocephala con presencia de bacilos. (B) Bacterias bacilares con flagelos mezclados con fibras a 15 000x de un aislado en medio LMARC.

Fuente: elaboración propia.

Las pruebas bioquímicas de catalasa y crecimiento en PGA confirman características bacterianas metabólicas apartadas del grupo Rhizobium. En tanto la prueba de ketolactosa descarta la presencia del género Agrobacterium (Bernal y Graham, 2001; Toniutti et al., 2015). Ocho de las diez cepas aisladas son ácido productoras, al cambiar el color del medio de púrpura al amarillo. Las cepas LEUPSE 1 y LEUPSE 3 se pueden considerar neutras o alcalino productoras (figura 3).

Las pruebas de crecimiento en cloruro de sodio (NaCl) y Co⁺² indican que las cepas FPMG2, FPMG3 y FPMG4 poseen muy alto crecimiento y resistencia para ambas sales. FPRV y FPMG1 presentan mediano crecimiento en NaCl y alta resistencia en Co⁺², las cepas LEURV, LEUPSE1 y LEUPSE3 mostraron de bueno a muy poco crecimiento en Co⁺² respectivamente y sin tolerancia a la sal. TUMRV resultó con mediano crecimiento en NaCl y muy poca resistencia al Co⁺². La cepa VAIRV evidenció muy poco crecimiento en ambos.

En la prueba antimic con los pesticidas Aminaroc 6 (herbicida), Semevin 350 (plaguicida) y Demoledor (herbicida-glifosato), las cepas VAIRV, LEURV, FPMG1, FPMG4 y LEUPSE3 destacan en la resistencia a dos de tres pesticidas (figura 3).

Figura 3
Caracterización bioquímica de los aislados obtenidos

Nota: (A) Prueba de crecimiento en PGA, en color amarillo las cepas ácido productoras. (B) Prueba catalasa positiva. (C) Prueba de cetolactasa, descartando presencia de Agrobacterium.

Fuente: elaboración propia.

Los resultados de la caracterización fenotípica y bioquímica de los aislados (cuadro 2), como coloración, consistencia, mucoproductoras, velocidad de crecimiento, producción de ácido-álcali y crecimiento a diferentes porcentajes de salinidad y en presencia del metal pesado coinciden con la identificación clásica para rizobacterias, pero no del grupo Rhizobium, lo cual muestra la utilidad de complementar las pruebas morfo-bioquímicas y los análisis moleculares mencionadas por Cuadrado et al., 2009, Zúñiga, 2012, Moreno y Galvis, 2013.

Cuadro 2
Resultado de las pruebas fenotípicas y bioquímicas

Pruebas bioquímicas: buen crecimiento (+++), mediano crecimiento (++), poco crecimiento (+), sin crecimiento (-). Antimic: Sensible (s), tolerante (t), resistente (r). Demoledor (D), Aminaroc (A), Semevin (S). Caracterización morfológica: Translúcida (T), Gomosa (G), Poco gomosa (F).

Fuente: elaboración propia.

Una vez extraído el ADN genómico de los diez aislados bacterianos, se realizaron las respectivas amplificaciones en PCR del gen 16S ARNr, con los primers universales 27F y 1492R, luego verificadas en gel de electroforesis al 1.5% de agarosa. La figura 4 muestra los productos de 1 500 pb esperados.

Figura 4
Amplificación del gen 16S ARNr de los 10 aislados asociados a nódulos de leguminosas de la península de Santa Elena, Ecuador
Fuente: elaboración propia.

Los cromatogramas obtenidos de la secuenciación de los genes 16S ARNr de las 10 cepas fueron depurados y ensamblados empleando la herramienta CAP contig del software BioEdit y Chromas (v 2.5.1). Luego, se compararon con la base de datos del GenBank mediante el programa BLAST 2.2.20 (Basic Local Aligment Search Tool) (Yoon et al., 2017) (cuadro 3). Las cepas FPRV y FPMG3 obtuvieron la mayor similitud, 99% con Pseudomonas putida y Enterobacter sp. respectivamente, reportadas también por Shakirov et al. (2010). Los demás porcentajes oscilan entre 88 y 96% de similitud, con mayor presencia el género Pseudomonas, en seis de los diez aislados, y Pseudomonas putida la más frecuente (FPRV, TUMRV y FPMG1), lo cual coincide con Issar et al. (2012) y Noreen et al. (2015), quienes reportan la presencia de este género en nódulos de varias leguminosas de la India y Pakistán empleando el gen 16S. Lo anterior acorde con Larsen et al. (1993) y Perret et al. (2000) referente a la existencia en el suelo y raíces de las plantas de grandes comunidades interespecíficas microbianas cuyas interrelaciones determinan cuál es la comunidad dominante, reprimida o inhibida e incluso aquellas que coexisten sin afectar positiva o negativamente la producción agrícola y con habilidad para degradar herbicidas en condiciones in vitro (Elzanaty et al., 2015).

Cuadro 3
Identificación molecular de los aislados bacterianos asociados a nódulos de leguminosas de tres zonas de la Península de Santa Elena, Ecuador

Fuente: elaboración propia.