INTRODUCCIÓN

Desde finales del pasado siglo se han realizado infinidad de estudios de la micobiota ambiental tanto de interiores como de exteriores. Se han descrito varios géneros y especies en ambientes domiciliarios y ocupacionales, así como la dinámica de la micobiota atmosférica en diferentes regiones del planeta.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7

A diferencia de los estudios de caracterización fisiológica profunda realizados a cepas de interés clínico (patógenos primarios), biotecnológico e industrial, la mayoría de las investigaciones se han enfocado en la cuantificación y clasificación taxonómica. Dicha información ha sido útil para diversos fines como diagnosticar la calidad ambiental (hongos como bioindicadores), predecir la aparición de plagas agrícolas, evaluar el riesgo potencial de afectaciones a alimentos y materiales o dar seguimiento a los propágulos de determinados hongos alergénicos.8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 Son minoritarios aquellos estudios donde se ha llevado a cabo una caracterización fisiológica de la micobiota ambiental que permita relacionar de forma precisa su impacto en el deterioro de materiales así como en la calidad de vida.

En investigaciones relacionadas con la conservación de patrimonio documental y museológico, la micobiota contaminante igualmente se ha estudiado mayoritariamente desde el punto de vista cuantitativo y cualitativo. Resultan aún escasos los trabajos de caracterización fisiológica de plagas fúngicas en archivos, museos y bibliotecas y la realización de los mismos se centra mayoritariamente en países desarrollados.16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 El elevado costo de materiales, equipamiento e infraestructura, la carencia de metodologías y la falta de expertos (biólogos, microbiólogos o micólogos) en las instituciones son algunos de los principales obstáculos para las investigaciones.

Los hongos presentes en instituciones de interés patrimonial constituyen un serio problema para la conservación de las colecciones al ser capaces de colonizar una amplia variedad de sustratos si las condiciones de temperatura y humedad relativa son propicias. El papel, la madera y los textiles están entre los materiales más abundantes en las obras y más afectados por el biodeterioro fúngico.

La exposición durante la jornada laboral a altas dosis de propágulos fúngicos puede causar en el equipo de trabajo reacciones alérgicas, asma, micosis oportunistas y otras enfermedades ocupacionales mediadas por diversos factores de virulencia propios de cada grupo, taxón o cepa.23,24

Entre las especies más representativas del bioaerosol y los sustratos en archivos y museos cubanos se han reportado representantes de los géneros Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, Nigrospora, Chaetomium, Paecilomyces . Alternaria; siendo los representantes de los tres primeros géneros los de mayor prevalencia.15, 16, 17, 18, 25, 26, 27, 28, 29, 30

La amplia diversidad de la micobiota en estos ambientes, su dinámica y su respuesta fisiológica ante condiciones ambientales cambiantes, evidencia la necesidad de realizar estudios de caracterización fisiológica que permitan esclarecer la fenomenología del biodeterioro, obtener datos de rigor científico comparables entre sí para minimizar el impacto de los hongos contaminantes en el deterioro de las colecciones y la salud del personal implicado en su salvaguarda. 23, 24, 25, 28, 31

El objetivo de este estudio fue evaluar potencialidades biodeteriorantes y patogénicas de cepas de hongos anemófilos correspondientes a taxones aislados frecuentemente en instituciones patrimoniales cubanas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Cepas de estudio

Se seleccionaron 27 cepas de hongos filamentosos pertenecientes a la Colección de Cultivos Microbianos del Laboratorio de Conservación Preventiva del Archivo Nacional de la República de Cuba (ARNAC). Estas fueron aisladas a partir de estudios realizados en archivos y museos cubanos durante el año 2015. En aquel momento fueron identificadas taxonomicamente y depositadas en la colección. Todas las cepas son de especies de los géneros: Aspergillus P. Micheli ex Haller, Cladosporium Link y Penicillium Link.Para la selección, se tuvo en cuenta que en estudios realizados en varias instituciones patrimoniales cubanas, representantes de estas especies y géneros se han reportado entre los más abundantes del ecosistema. 5, 15, 18, 26, 27, 28

Determinación semicuantitativa de la actividad biodeteriorante

Actividad exoenzimática

Para cuantificar la actividad exoenzimática (Ae) celulolítica, amilolítica, proteolítica, así como la actividad hemolítica y fosfolipasa se utilizó la siguiente fórmula:32

Ae = 1- Dc / Dca

Donde Dc es el diámetro de la colonia y Dca es la suma de Dc y el diámetro del halo de hidrólisis. Los valores entre 0,5 y 0,59 se clasificaron como Ae baja, entre 0,6 y 0,69 Ae moderada y por encima de 0,7 de alta.

Actividad celulolítica

Se inocularon las cepas en placas Petri que contenían un medio agarizado, cuya composición salina para un litro fue: nitrato de sodio 2 g, fosfato de potasio 1 g, sulfato de magnesio 0,5 g, sulfato ferroso 0,01 g, cloruro de potasio 0,5 g y extracto de levadura 0,5 g. Como fuente de carbono se añadió carboximetilcelulosa (1 %) y se incubaron a 28 °C. Transcurrido siete días, se agregó a cada una de las placas una solución de rojo congo (0,05 gL-1) durante una hora, luego se decantó esa solución y se añadió NaCl al 1 Mol\L por 10 min. 33 La actividad celulolítica se evidenció por la formación de un halo blanco alrededor de la colonia.

Actividad amilolítica

Se preparó en placas Petri un medio agarizado de composición salina similar al empleado en la prueba anterior. Como fuente de carbono se adicionó almidón (1 %). Después de incubar durante 7 días a 28 ºC, se vertió sobre cada placa de cultivo una solución de reactivo Lugol. La presencia de un halo incoloro alrededor de las colonias evidenció la hidrólisis del almidón. 34 ,35

Actividad proteolítica

Las cepas se inocularon en placas que contenían un medio de cultivo agarizado de composición salina similar al empleado para la determinación de la actividad celulolítica, con gelatina como fuente de carbono (1 %). Las cepas se incubaron a 28 ºC, la lectura de la prueba se realizó a los siete días de incubación con la adición del reactivo de Frazier. Un precipitado blanco alrededor de la colonia (halo) indicó la presencia de gelatina no hidrolizada y la ausencia de este, hidrólisis de la gelatina.36

Excreción de ácidos orgánicos

Se inoculó 0;1 ml de una suspensión de conidios de cada cepa en un caldo de cultivo de composición salina similar al medio empleado para determinar actividad celulítica. Como fuente de carbono se utilizó glucosa (1%), el pH se ajustó a 7 y se adicionó 0,3 gL-1 de rojo fenol como indicador. Los cultivos se incubaron a 28ºC por 3 días y posteriormente se midió el pH del caldo con un pH metro (Pacitronic MV 870, USA), cuya precisión es de ± 0,2 unidades. El resultado positivo se corroboró por el cambio de coloración del indicador rojo fenol (de rojo a amarillo) y la detección de valores de pH menores que 7.35

Determinación semicuantitativa de la actividad patogénica

Actividad hemolítica

Las cepas fueron sembradas en un medio de cultivo base de Agar Czapeck suplementado con cloranfenicol (0,05 %). Una vez dicho medio estuvo estéril y fresco (45 ºC), se agregó en forma aséptica por cada 95 ml del mismo, 5 mL de sangre de carnero desfibrinada y se vertió la mezcla en placas Petri. Las placas inoculadas se incubaron a 28 ºC durante siete días. La actividad hemolítica se evidenció por la aparición de un halo verdoso o transparente alrededor de la colonia en el medio de color rojo.32

Actividad fosfolipasa

Las cepas en estudio se sembraron en un medio de cultivo agarizado cuya composición para 500 mL fue peptona bacteriológica 5 g, glucosa 10 g, cloruro de sodio 29,25 g y cloruro de calcio 2,28 g. Se ajustó el pH del medio a 4 y luego de esterilizado, se añadieron dos yemas de huevo en forma aséptica. Posteriormente se incubaron las placas a 28 ºC durante siete días. La actividad se evidenció mediante la aparición de un halo transparente alrededor de la colonia en el medio amarillo claro, producto del precipitado que forman las sales.32

Potencialidad de crecimiento radial a 37 °C

Cada cepa se inoculó en una placa Petri de 90 mm que contenía Agar Dextrosa de Saboraud como medio de cultivo, luego se incubó durante siete días a 28 y 37 °C 37. Concluido el período de incubación, se midió el diámetro de las colonias a las dos temperaturas.

Análisis Biométricos

Todos los análisis se realizaron por triplicado y los resultados se procesaron con el programa estadístico Statgraphics Centurion XV. Las variables de repuesta fueron los valores promedio (n=3) de índices de actividad exoenzimática, pH y crecimiento a 28 y 37 ºC. Se hizo análisis de probabilidad mediante prueba de Kolmogorov-Smirnov y se compararon los resultados por el método de Múltiples Rangos por diferencias mínimas cuadradas (LSD) para un 95% de confianza (p ≤ 0,05). Posteriormente se buscó la similitud entre las cepas de las especies fúngicas por análisis de conglomerados con distancia euclidiana aplicando el método del vecino más cercano.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Atributos biodeteriorantes de las cepas

Los principales atributos biodeteriorantes de las cepas fúngicas para afectar las colecciones documentales y museológicas fueron evaluados in vitro. Para ello se determinó de forma semicuantitativa la Ae de cada una de ellas sobre las principales biomoléculas que conforman los materiales. Además, se evaluó la capacidad de excretar al medio metabolitos biodeteriorantes, en este caso ácidos orgánicos y pigmentos difusibles (Tabla 1).

El análisis de la Ae evidenció que existen diferencias estadísticamente significativas entre géneros, especies e incluso cepas de una misma especie (Tabla 1). La micobiota ambiental es diversa y dinámica, así como amplia y versátil es la maquinaria metabólica de cada uno de sus integrantes. Por ello los estudios de caracterización de la misma enfocados al biodeterioro deben realizarse de forma puntual y sistemática.

La carboximetilcelulosa y la gelatina fueron las biomoléculas más asimiladas al evaluarse como únicas fuentes de carbono (96 % de las cepas). Se evidenció así la notable capacidad de estos hongos ambientales para secretar complejos enzimáticos de celulasas y proteasas. Varios autores cubanos, que han estudiado la micobiota de interiores, plantearon que entre las cepas caracterizadas (provenientes de ambientes donde abundan los sustratos celulósicos), los representantes de los géneros Aspergillus, Cladosporium y Penicillium tuvieron la capacidad de crecer utilizando la celulosa como única fuente de carbono. 25, 26, 27, 28, 38, 39

El empleo en este estudio de un método semicuantitativo para evaluar la Ae permitió determinar que de forma general los representantes de Penicillium spp. mostraron una actividad celulolítica significativamente mayor que las cepas de Aspergillus . Cladosporium (Tabla 1).

Específicamente destacaron Penicillium wortmannii . Aspergillus chevalieri, ambos con un índice de actividad celulolítica (IAC) de 0,72, clasificada como como Ae alta sobre dicho polímero. En contraparte, Cladosporium oxysporum no mostró la capacidad de secretar celulasas. El resto de las cepas mostraron Ae celulasa entre moderada y baja.

En el caso de la actividad gelatinasa sobresalieron Cladosporium cladosporioides 2 y C. oxysporum, con un índice de actividad proteolítica (IAP) en ambos casos de 0,70 (Ae alta). Mientras que Aspergillus chevalieri fue la única cepa que resultó negativa a esta prueba, el resto de los aislados mostraron Ae proteolítica entre moderada y baja (Tabla 1). Parece ser que bajo determinadas condiciones algunas especies de Cladosporium (entre ellas varias predominantes en el aire) pudieran ser mejores degradadores de gelatina que Aspergillus . Penicillium que usualmente suelen sobresalir en estudios similares a este, tal es el caso de representantes de los grupos taxonómicos Aspergillus flavus . A. niger además de las especies Penicillium citrinum . P. chrysogenum. 25, 26, 34, 40

En condiciones ambientales adecuadas de temperatura y humedad, Cladosporium puede crecer y colonizar una amplia variedad de sustratos, entre ellos los de naturaleza proteica. Además, debe tenerse en cuenta que estos hongos se encuentran entre los predominantes en ambientes exteriores e interiores de Cuba durante gran parte del año, de este hecho no están exentos los locales de archivos y museos. Esto implica que los representantes del género pueden constituir una seria amenaza para las colecciones de fotografía y otros documentos que estén conformados por materiales de naturaleza proteica.

En general estos resultados coinciden con lo referido por Borrego y Rodríguez 40 quienes al caracterizar fisiológicamente varias cepas de Aspergillus, Cladosporium y Penicillium reportaron la producción de proteasas. Otros autores reportan la actividad proteolítica en hongos filamentosos como una de las más frecuentes. 25, 26, 41

La celulosa se encuentra entre los componentes principales del papel, el cartón, los textiles y la madera; brinda rigidez y resistencia en estos materiales. Mientras la gelatina, es constituyente de muchos materiales que conforman los documentos, tal es el caso de las encuadernaciones de libros en cuero, el pergamino, las fotografías y las películas cinematográficas. La capacidad de los hongos contaminantes para utilizar estas biomoléculas como fuente nutricional causa daños graves en colecciones documentales y museológicas en todo el mundo. 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,29, 30, 31, 42, 43, 44

El almidón es otro componente importante del papel, la madera y algunos textiles, se encuentra además en la goma y los aprestos que se suelen utilizar en las encuadernaciones de los libros, en las labores de restauración de los documentos y montaje de instalaciones 45 La degradación de este polímero se evidenció en un 92 % de las cepas estudiadas. En este caso la cepa que mostró mejor producción de amilasas fue Cladosporium tenuissimum con un índice de actividad amilolítica (IAA) de 0,65 (Ae media). Por el contrario, Aspergillus chevalieri . A. niger no mostraron actividad alguna. Entre las Ae biodeteriorantes evaluadas, la actividad amilolítica fue la menos evidente (Tabla 1).

Las actividades exoenzimáticas evaluadas sobre las principales biomoléculas que conforman los soportes de origen orgánico, demostraron que las cepas caracterizadas en este estudio, cuentan con un amplio potencial enzimático biodegradador. Materiales como el papel, cartulina, textiles, madera y cuero que conforman documentos y piezas museológicas pueden ser afectados seriamente por estos hongos si entran en contacto con ellos y existen condiciones idóneas para su desarrollo. Rodríguez y cols.26 quienes realizaron una caracterización fisiológica cualitativa similar a la llevada a cabo en este trabajo en aislados de Aspergillus, Cladosporium y Penicillium, apuntaron que constituyen géneros fúngicos con un potencial enzimático muy amplio, lo cual además está en correspondencia con los resultados obtenidos por otros autores. 21, 25, 30,36, 38, 46, 47

Cuando crecen sobre un sustrato, la mayoría de los hongos filamentosos liberan ácidos orgánicos que hidrolizan los enlaces β-1,4-glicosídicos (hidrólisis ácida) desintegrando las fibras de celulosa. Lo anterior contribuye de forma significativa al amarillamiento y debilitamiento de materiales como el papel.42 Además, en presencia de ácidos se potencia la Ae de muchas enzimas como celulasas, amilasas y proteasas.47 Desde el punto de vista ecológico, la acidificación del soporte por especies colonizadoras primarias de los géneros estudiados facilita la colonización por otros hongos (generalmente acidófilos) propiciando que ocurran sucesiones ecológicas y se formen biopelículas que deteriorarán el material hasta destruirlo completamente.48 Los resultados de este estudio mostraron que el 100% de los hongos excretaron ácidos orgánicos al medio de cultivo líquido donde se realizó la prueba (Tabla 1).

En este aspecto destacaron las cepas del grupo taxonómico Aspergillus niger con una disminución del pH del medio por debajo de 4. Algunos autores han referido que los representantes del género Aspergillus son buenos productores de ácidos.49, 50 Además, el crecimiento en forma de microcolonias (tal y como crecen sobre materiales como el papel) favorece la producción de ácidos en especies de Aspergillus como las de la sección Nigri.51

Entre los atributos biodeteriorantes evaluados en este estudio, la excreción de pigmentos fue el menos evidenciado (30 % de las cepas). La producción de pigmentos difusibles por parte de los hongos, debe tenerse en cuenta como un factor deteriorante importante. Las afectaciones estéticas que causan en las colecciones son casi siempre irreversibles y constituye uno de los problemas más graves que origina la contaminación microbiológica.52 Se ha relacionado además este fenómeno con la resistencia de determinadas cepas a métodos de desinfección físicos y químicos53. En este aspecto destacaron cepas de los géneros Cladosporium y Penicillium, reportados ampliamente en la bibliografía como productores de pigmentos.54, 55, 56

Atributos patogénicos de las cepas

La capacidad individual de un microorganismo para causar afecciones en otros organismos depende de una serie de mecanismos conocidos como factores de virulencia o atributos patogénicos.37 Tales atributos van a determinar el grado de patogenicidad de determinado agente microbiano. Algunas de las principales potencialidades patogénicas de las cepas fúngicas estudiadas que pueden afectar la calidad de vida del personal que labora en archivos y museos (expuestos a altas concentraciones de propágulos fúngicos durante la jornada laboral) se evaluaron in vitro.

El crecimiento de los hongos a 37 ºC, es un factor de virulencia necesario e imprescindible para considerar una cepa fúngica potencialmente patógena, debido a que esta es la temperatura corporal del hombre y otros animales homeotermos 37. El desarrollo bajo esta condición posibilita la invasión de superficies epiteliales, endoteliales y vasos sanguíneos. Según Rementería y cols. 57 la expresión de algunos genes que intervienen en mecanismos invasivos ocurre a dicha temperatura. De las 27 cepas evaluadas 16 crecieron a 37 °C lo que representó un 59% del total. No crecieron a esta temperatura Aspergillus chevalieri. Penicillium wortmannii, además de ninguna de las especies del género Cladosporium. Este resultado concuerda con lo reportado por Molina y cols.28 y Borrego y cols.41 en estudios realizados con cepas provenientes de ambientes interiores de archivos. La mayoría de los hongos ambientales, no son capaces de desarrollarse a temperaturas superiores a los 32°C 53. No obstante, existen algunas especies cuyas temperaturas óptimas de crecimiento incluyen los 37 °C. Es probable que estas especies desplieguen todo su potencial fisiológico a temperatura corporal, cuestión que sin duda alguna los convierte en patógenos oportunistas con potencialidades invasivas, más peligrosos que aquellos que a pesar de desarrollarse bajo dicha condición no lo hagan de forma óptima (Fig. 1).

Los propágulos fúngicos en el aire pueden ser inhalados y causar micosis sistémicas oportunistas y endémicas, así como alergias.23 El personal que permanece en depósitos de archivos, bibliotecas y museos durante la jornada laboral, puede estar expuesto a gran cantidad de esporas fúngicas sobre todo por la tendencia de éstas a adherirse a las partículas de polvo. Especialmente aquellas capaces de alcanzar los sacos alveolares (diámetro inferior a 3-4 µm) pueden germinar, atravesar su pared y dar lugar a un proceso invasivo, siempre y cuando sean capaces de resistir a los mecanismos de defensa del huésped. 53, 58 Es, por tanto, el tamaño de esporas y conidios un importante factor de virulencia, especialmente en cepas de Aspergillus y Penicillium (Tabla 2). El 70 % de las cepas estudiadas produjeron conidios que pueden ser arrastrados durante la inspiración hasta los alvéolos pulmonares. En este aspecto destacaron las cepas de Penicillium donde las ocho especies tienen un diámetro conidial inferior a los 4 μm. Algunas de ellas como Penicillium citrinum . P. griseofulvum se han relacionado con episodios de queratitis, infecciones en el tracto urinario y en pacientes leucémicos e inmunocomprometidos complicaciones con micosis sistémicas .55

En el caso de Aspergillus spp., especies como A. parasiticus . A. flavus, de notable capacidad invasiva en hospederos humanos susceptibles, presentaron esta característica (conidios ≤ 4 μm). Debe considerarse que son especies que se detectan con alta frecuencia y de forma predominante en el aire y sobre las superficies de ambientes interiores en Cuba .5

Las hemolisinas son exotoxinas formadoras de poros que reconocen y se unen a sitios estructurales específicos en la superficie de los glóbulos rojos.59 Son secretadas al medio extracelular y pueden producir ruptura de eritrocitos.

El desbalance en la presión osmótica de la célula debido a los poros formados por estas proteínas se ha sugerido como el principal mecanismo de hemólisis.60 La principal función reconocida de estas enzimas en el proceso infeccioso es la lisis de los glóbulos rojos, lo cual provoca la liberación del hierro contenido dentro de estas células. Este importante ión es requerido por los microorganismos en muchos procesos metabólicos como cofactor enzimático. 59 Vesper y Vesper61 reportaron que las hemolisinas pueden jugar un rol importante en afectaciones a la salud producto del Síndrome del Edificio Enfermo (SBS, por sus siglas en inglés), pues estas exotoxinas se han detectado en la orina y otros fluidos corporales de pacientes que han estado expuestos a ambientes con alta carga fúngica.

En este estudio se detectaron 19 cepas de hongos hemolíticas, lo que representó un 70 % del total (Tabla 2). Las cepas de mayor Ae fueron: Aspergillus niger . A. phoenicis, ambas del grupo A. niger las cuales no mostraron diferencias estadísticamente significativas entre sí para un índice de 0,57. Nayak y cols.59 reportaron la detección de más de un tipo de hemolisina en cepas de Aspergillus flavus, A. oryzae . A. niger, especies productoras por excelencia de este tipo de micotoxinas y de importancia clínica ampliamente citada. 53, 55, 62

Las fosfolipasas son un grupo de enzimas secretadas por varios microorganismos patógenos que pueden dañar las membranas celulares del huésped. La capacidad de producir y secretar enzimas con actividad fosfolipasa de ciertos hongos, ha sido considerada por varios autores como factor de virulencia que contribuye de forma significativa a su patogenicidad. 63 Bomogolova y Kirtsideli32 estudiaron la actividad fosfolipasa en hongos aislados de ambientes exteriores de la ciudad de San Petersburgo; detectaron que representantes del género Penicillium, entre ellos P. chrysogenum, mostraban Ae positiva lo cual concuerda con este estudio. Estas enzimas están implicadas en importantes procesos fisiológicos como la diseminación fúngica en el hospedero y la defensa o evasión ante mecanismos del sistema inmune. 64

Consideraciones Finales

A partir de esta investigación se han podido establecer diferencias cuantitativas entre importantes potencialidades biodeteriorantes y patogénicas de 27 cepas de hongos ambientales de taxones aislados frecuentemente en archivos y museos cubanos. Como se comprobó, aunque existen similitudes entre cepas de un mismo género o grupo desde el punto de vista fisiológico, no siempre pueden agruparse como se haría desde el punto de vista taxonómico (Fig. 2).

El desarrollo, morfología, actividad enzimática, producción de metabolitos secundarios entre otros aspectos, pueden variar notablemente entre cepas y ecosistemas para representantes de una misma especie. Los estudios de la micobiota ambiental enfocados al biodeterioro de materiales y a la salud humana, deben realizarse de forma puntual y sistemática, además de incluir una buena identificación taxonómica y caracterización fisiológica de las cepas más abundantes.

Estas investigaciones entre otras finalidades, aportan información valiosa acerca de la microbiota de este tipo de ecosistema, facilitan la elaboración y actualización de los planes de conservación preventiva para las colecciones, contribuyen a esclarecer la fenomenología del biodeterioro de los materiales y tributan a la prevención de enfermedades ocupacionales.

CONCLUSIONES

El 100 % de las 27 cepas evaluadas mostraron potencialidades biodeteriorantes para afectar varios materiales; las más peligrosas para las colecciones archivísticas y museológicas correspondieron a las especies: Aspergillus flavus var. columnaris, Cladosporium chlorocephalum, C. cladosporioides, Penicillium janczewskii . P. citrinum. Se detectaron atributos patogénicos en el 92 % de las cepas, representaron un mayor riesgo para la salud humana como patógenos oportunistas: Aspergillus flavus, A. niger, A phoenicis, Penicillium chrysogenum, P. waksmanii . P. griseofulvum.

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Notas