INTRODUCCIÓN

Escherichia coli .E. coli) es el agente etiológico más frecuente en infecciones del tracto urinario y una de las principales causas de meningitis neonatal, además de ocasionar infecciones intestinales, en el sitio quirúrgico, infección de la piel y tejidos blandos, neumonía, bacteriemia, etc.1 El aislamiento de E. coli portadora de Beta- Lactamasas de Espectro Extendido (Ec-BLEE) tanto en la comunidad como en el hospital se ha convertido en un problema creciente, responsable de la morbilidad y mortalidad de los pacientes hospitalizados.2

Los fenotipos más comunes de Beta-lactamasas de Espectro Extendido (BLEE) surgen de mutaciones puntuales en los genes blaTEM, blaSHV o blaCTX-M que alteran el centro activo de la enzima.3 Estas enzimas hidrolizan las cefalosporinas de tercera y cuarta generación y el aztreonam. Son inhibidas por los inhibidores de betalactamasas (ácido clavulánico, sulbactam o tazobactam) las cefamicinas y los carbapenemicos; además los plásmidos que codifican las BLEE portan genes de resistencia a otras familias de antimicrobianos como aminoglucosidos, fluoroquinolonas y sulfonamidas, por tal motivo el fenómeno de resistencia cruzada es muy frecuente y el tratamiento de las infecciones producidas por estas cepas presenta mayor dificultad.4

La epidemiología de Ec-BLEE en adultos está bien documentada a nivel mundial.5 En La Habana no se han informado estudios sobre la incidencia de E. coliproductora de BLEE causando infecciones endémicas y epidémicas. La prevalencia de estos fenotipos detectada en los hospitales de La Habana ha aumentado de un 3,8 % en el año 2004 a un 51,7 % en 2011, con una alta incidencia (53,3 %) en los pacientes ingresados en las Unidades de Cuidados Intensivos.6, 7, 8 Las enzimas TEM, SHV y CTX-M habían sido descritas en estudios previos en cuatro hospitales de La Habana.6 Sin embargo no hay información sobre la relación genética de los aislados clínicos de Ec-BLEE causante de infecciones hospitalarias. El objetivo del presente estudio fue caracterizar los genes bla que codifican BLEE y determinar la relación genética en E. coli productoras de BLEE, colectados en el período de junio a diciembre del 2014 de pacientes adultos hospitalizados en un Hospital de La Habana, Cuba.

MATERIALES Y MÉTODOS

Aislamientos bacterianos. Se estudiaron un total de 328 aislamientos clínicos no duplicados procedentes de muestras clínicas recibidas del Laboratorio de Microbiología de un Hospital en La Habana, durante el período de junio a diciembre de 2014. Las muestras fueron colectadas de pacientes adultos hospitalizados con infecciones respiratorias, en el torrente sanguíneo, tracto urinario y heridas quirúrgicas admitidas en la Unidad de Cuidados Intensivos (UCI) en la sala de Medicina Interna y en la sala de Urología. Los aislados fueron identificados mediante pruebas bioquímicas convencionales.9 Durante el estudio se utilizaron las siguientes cepas controles: Escherichia coli ATCC 25922 como control negativo y Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 control positivo.

Susceptibilidad antimicrobiana. Las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos se llevaron a cabo mediante el método de difusión con discos, siguiendo los lineamientos para enterobacterias del Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorios (CLSI, siglas en inglés).10 Se ensayaron los siguientes antimicrobianos: amoxicilina/ácido clavulánico (30/10µg), ceftriaxona (30 µg), ceftazidima (30 µg), cefepima (30 µg), cefotaxima (30 µg), aztreonam (30 µg), imipenem (10 µg), meropenem (10 µg). Los aislados también se ensayaron contra antibióticos no betalactámicos, incluyendo amikacina (30 µg), gentamicina (10 µg), ciprofloxacina (5 µg), trimethoprim/sulfamethoxazole (1,25 µg/23,75 µg).

Detección fenotípica de BLEE. Se realizó en todos los aislamientos que mostraron resistencia al menos a una de las cefalosporinas de tercera, cuarta generación y el monobactam aztreonam, utilizando la prueba de sinergia de disco doble como se describió anteriormente.11 Después de una incubación durante la noche a 37 ºC, una ampliación de la zona de inhibición entre un disco de betalactámico y el que contiene el inhibidor de beta-lactamasa es indicativo de la presencia de BLEE (Ec-BLEE).

Amplificación por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) de los aislados de Ec-BLEE. Todos los aislados de E. coli caracterizados fenotípicamente como positivos para BLEE fueron analizados por PCR. Para la extracción del ADN plasmídico, los aislados de E. colise cultivaron durante la noche en caldo de triptona soja a 37 ºC. El ADN plasmídico se purifico de acuerdo con el método de lisis alcalina de Kado y Liu.12 La amplificación por PCR se realizó usando GoTaq DNA polimerasa (Sigma). Para determinar la presencia de los tipos de genes blaTEM, blaSHV y blaCTX-M se utilizaron cebadores y condiciones descritas previamente.13 (Tabla 1).

Tipificación molecular de los aislados Ec-BLEE. El ADN genómico de todos los Ec-BLEE se realizó mediante electroforesis en gel de campo pulsado (ECP) después de la digestión con XbaI (New EnglandBioLabs, Reino Unido) según procedimiento previamente descrito por López-Cánovas (2006).14 Usando cámara miniCHEF del Sistema Guefast 06® (Neuronic SA, Cuba). Los minigeles fueron teñidos con solución de bromuro de etidio y fotografiados con una cámara digital (Sony DSC707). El análisis de los perfiles obtenidos por ECP y la construcción del dendograma fueron realizados mediante análisis computarizado, utilizando el software GuefaScan® (NeuronicSA. Cuba),15 acorde con él en el índice de coincidencia de Dice,16 el cual se calcula mediante la siguiente ecuación: D= Sxy / nx + ny Donde: Sxy es la similitud entre las cepas . y y, nxy es el número de bandas en común en los dos perfiles de DNA, y nx y ny son los números de bandas exhibidas por las cepas . y . respectivamente y el análisis de cluster de las matrices de similitud se calculó utilizando el método UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean). Las cepas que presentaron índice de similitud igual o mayor al 80 % se consideraron genéticamente relacionadas.17

RESULTADOS

De los 328 aislamientos clínicos no duplicados se identificaron 97 como E. coli (29,5 %) y fueron confirmados fenotípicamente 32 (32,9 %) como productores de BLEE entre los cuales 10 (31,2 %) fueron de la Unidad de Cuidados Intensivos (UCI) de estos tres (9,3 %) con infecciones respiratorias y 7 (21,8 %) en el torrente sanguíneo. En la sala de Medicina Interna 10 (31,2 %) provenientes de pacientes con infección de heridas quirúrgicas y 12 (37,5 %) con infección del tracto urinario de la sala de Urología.

Todos los aislamientos de Ec-BLEE resultaron resistentes a cefotaxima, aztreonam y ceftriaxona 32 (100 %) mientras 31(97,0 %), 28 (87,0%) y 27 (84,0 %) fueron resistentes a ceftazidima, amoxicilina/ácido clavulánico y cefepima, respectivamente. La co-resistencia para amikacina 22 (68,7 %), gentamicina 29 (90,6 %), Trimetoprima / sulfametoxazol 28 (87,5%), ciprofloxacina 28 (87,5 %). Todas las cepas fueron completamente susceptibles al imipenem y meropenem (Tabla 2).

Entre los aislados de Ec-BLEE se encontró que el gen blaCTX-M es el más prevalente 17 (53,1 %) seguido de blaTEM 14 (43,7 %) y blaSHV 4 (12,5 %). El análisis de los productos de PCR mostró coexistencia de BLEE entre los aislados clínicos de E. coli, diez de los 32 aislamientos presentaron los genes blaCTX-M y blaTEM, uno de los 32 aislados tenía los genes blaCTX-M y blaSHV (aislamiento 32), uno de los 32 aislados tenía blaSHV y blaTEM (aislamiento 49) y uno de los 32 aislados tenía blaTEM, blaCTX-M y blaSHV (aislamiento 34) (Tabla 3).

Tabla 3

Tabla 3a

El análisis de los patrones de bandas obtenidos mediante ECP mostró un alto nivel de diversidad genética de los aislados clínicos de Ec-BLEE. Los 32 aislamientos analizados mostraron 29 pulsotipos diferentes excepto en tres aislados de Ec-BLEE (40, 43 y 44) pertenecientes a la sala de Medicina Interna con 80% de similitud. Los 10 aislados de Ec-BLEE en esta sala se agruparon en cuatro pulsótipos A-D: A (n = 2), B (n = 6), C (n = 1) y D (n = 1). En el pulsotipo B, los tres aislamientos que están estrechamente relacionados se agruparon en el subtipo B4; el aislado 40 no produce ninguna de las enzimas probadas en el presente estudio, el 43 fue productor de CTX-M y el aislado 44 coexisten las enzimas CTX-M y TEM. En la sala de Urología fueron detectados nueve pulsotipos (A-I) y cinco subtipos B1, B2 y C1, C2, C3 y en la Unidad de Cuidados Intensivos fueron detectados ocho pulsotipos (A-H) y dos subtipos A1, A2, los cuales no están relacionados genotípicamente. En los patrones de ECP de los 32 aislados clínicos de Ec-BLEE.se observa la gran diversidad genética (Fig. 1)

DISCUSIÓN

La emergencia de aislados clínicos de Ec-BLEE es un desafío para la salud pública en el área de enfermedades infecciosas ya que reduce la eficacia terapéutica de los antimicrobianos, situación que ha sido informada en todo el mundo particularmente en América Latina.18, 19 El presente estudio muestra la prevalencia de BLEE (32,9 %) en aislados de E. coli con altas tasas de resistencia para antimicrobianos utilizados como primera opción terapéutica en infecciones causados por estos microorganismos. En el año 2014 se llevó a cabo un estudio en La Habana en un hospital con similares características al del presente estudio y el resultado informó una alta prevalencia (53,7 %) de Ec-BLEE.20 Los informes de prevalencia de diferentes tipos de genes blaTEM, blaCTX-M y blaSHV en aislados Ec-BLEE es muy variable entre diferentes ciudades, países y regiones.21 En este estudio se encontró que la mayoría de los aislados presentaron el gen blaCTX-M apoyando el reconocimiento de que la enzima CTX-M es el tipo de BLEE más prevalente en el mundo.22 En estudios previos se había informado la enzima TEM como la más prevalente en los aislados clínicos de E.coli causantes de infecciones intrahospitalarias. Sin embargo nuestro país al igual que en otras regiones del mundo como Europa del Este, América del Sur, Japón y la India el gen blaCTX-M ha desplazado a otros genes que codifican para otras enzimas BLEE.23 El análisis de los patrones de bandas obtenidos mediante ECP mostró una gran variabilidad genética en la mayoría de los aislados, excepto para tres cepas de Ec-BLEE (40, 43 y 44) pertenecientes a la sala de Medicina Interna con 80 % de similitud pero con diferencias en los tipos de enzimas presentes. Esta situación sugiere la transferencia horizontal de los genes más que la diseminación de un clon específico, este fenómeno ha sido observada en estudios en los cuales los aislados clínicos no pertenecen a un brote.24 Además, la ausencia de un perfil de ECP común entre los aislados clínicos excluye efectivamente un punto local de origen como fuente de brotes, favoreciendo en su lugar la importación de numerosas cepas dentro de la institución desde el ambiente extra hospitalario o la diversidad policlonal dentro de los reservorios de la institución.

CONCLUSIONES

El presente estudio informa una amplia diversidad genética de aislados clínicos de E. coliproductoras de BLEE en un hospital en La Habana, con una mayor prevalencia del gen blaCTX-M situación que merece una estrecha vigilancia; destacando la necesidad de implementar estrategias de control para prevenir la diseminación de estos aislados clínicos en el hospital.

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Notas