MELANOMACRÓFAGOS HEPÁTICOS Y ACTIVIDAD DE LA ENZIMA GLUTATION S-TRANSFERASA EN Leptodactylus chaquensis (ANURA, LEPTODACTYLIDAE) COMO BIOMARCADORES DE ESTRÉS OXIDATIVO POR LA EXPOSICIÓN A CLORPIRIFOS

Liver Melanomacrophages and Gluthation S-Transferase Activity in Leptodactylus chaquensis (Anura, Leptodactylidae) as Biomarkers of Oxidative Stress Due to Chlorpyrifos Exposition

El objetivo del presente trabajo fue cuantificar dos biomarcadores de estrés oxidativo (a. inmunohistológico, melanomacrófagos-MM y b. bioquímico, Glutation S-transferasa-GST) implicados en la detoxificación en el hígado de Leptodactylus chaquensis (Amphibia, Anura, Leptodactylidae) provenientes de un cultivo de arroz, luego de la aplicación de clorpirifos (CPF), y contrastarlos con ejemplares de un sitio de referencia en la provincia de Santa Fe (Argentina). El cultivo de arroz (CA) se localizó en el departamento San Javier, provincia de Santa Fe, Argentina (30°05'S - 59°53' W), en donde en un trabajo previo se ha registrado mortalidad de anuros adultos de forma casi inmediata luego de la aplicación de este insecticida, como así también se ha descartado mediante análisis de muestra de agua la presencia de otros agroquímicos (Attademo et al., 2015). Y el sitio de referencia (SR) (libre de aplicación de plaguicidas), a una distancia de 50 km del anterior, en humedales asociados al río Paraná (31°10'S - 60°15'W) en el departamento de Garay (Fig. 1). En el CA, siete días previos al muestreo, se aplicó el insecticida organofosforado CPF (48 %, Terminator^®, AGROS soluciones, Argentina), en una dosis de de 800 ml/hectárea. Leptodactylus chaquensis, por su abundancia y representatividad en los arrozales es considerada una especie centinela (Attademo et al., 2011) de amplia distribución en Argentina y se encuentra categorizada como "no amenazada" (Vaira et al., 2012) . Se recolectaron individuos adultos machos de L. chaquensis (n = nueve, en cada sitio) que fueron trasladados al laboratorio. Los ejemplares fueron pesados (P) y se midió la longitud hocico-cloaca (LHC). Con el P y LHC se calculó el Factor de condición animal (FCA), según la ecuación de Bagenal y Tesch (1978): FCA= P (g)*100/ LHC (mm). Posteriormente fueron eutanizados siguiendo el protocolo de la ASIH et al. (2004) y la aprobación del comité de ética de la Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas (FBCB-UNL). A cada espécimen se le extrajo el lóbulo hepático derecho y se fijó con formaldehido al 10 %. Las muestras fueron procesadas siguiendo el protocolo estándar de deshidratación, inclusión en parafina y luego se realizaron cortes seriados de 5 μm de espesor que fueron coloreados con Hematoxilina-Eosina (H/E), para evaluar las alteraciones hepatocitarias. Para cuantificar los MMS se siguió con modificaciones la metodología de Sayed y Jounes (2016). Para la determinación de parámetros morfométricos (área total, diámetros máximos y mínimos de los MM), se fotografiaron 30 campos al azar (N = 15 campos del primer corte y N = 15 del último corte de la serie). Este análisis se realizó utilizando el software Image Pro Plus (Media-Cybernetics Inc., version 4.5). Los fragmentos restantes del hígado se homogeneizaron para analizar la actividad de la enzima Glutatión S-Trasferasa siguiendo el método de Habig et al. (1974). Para evaluar las diferencias en los diferentes biomarcadores histológicos y enzimáticos entre SR y CA, se realizaron pruebas de t de Student considerando un p < 0.05 como estadísticamente significativo. Lotes de referencia de L. chaquensis se depositaron en la colección de anfibios de la FBCB-UNL (números PL-FBCB N° 3819; SR y PL-FBCB N° 3820; CA).

Los valores promedios de P (g) y LHC (mm) para CA fueron 51.9 ± 1.3 y 13.02 ± 2.7; y para SR fueron 52.3 ± 1.13 y 14.31 ± 2.9 respectivamente. Los individuos de CA (10.50 ± 0.70), no presentaron diferencias significativas en el FCA con respecto a los individuos del SR (11.91 ± 1.08) (t= 0.96, p = 0.202). Los MM en hígados de L. chaquensis provenientes del SR presentaron una distribución aleatoria en el parénquima hepático, con un promedio de 92 (±1.62) MM, y un área total promedio de 15649 (± 366.3) μm² por campo de 20 x (Fig. 2A). El tamaño medio de los MM fue de 160 μm² con un máximo de 2484.62 μm² y un mínimo de 43.25 μm² En el CA, los MM fueron significativamente mayores en número (t = 4.49; p = 0.028), con una media de 128 (±3.4). Y el área ocupada fue mayor por campo de 20 x (t = 3.66; p = 0.017), con un promedio de 23725 (± 728.53) μm² (Fig. 2B). El tamaño medio de los MM de CA fue de 173.3 μm² con un máximo de 3506.34 μm^{2 y} un mínimo de 43.25 μm² Un similar aumento en los MM, fue observado por Fenoglio et al. (2005) en hígados de Rana esculenta provenientes de arroceras. Además, Pérez-Iglesias et al. (2016) cuantificaron los niveles de melanina en los MM y hallaron una correlación con la concentración del herbicida glifosato a la que fueron expuestos individuos de Leptodactylus latinasus. También se ha hallado la misma correlación luego de la exposición al insecticida organofosforado Reldan 40EC (Paunescu et al., 2010), y al cadmio (Loumbourdis y Vogiatzis, 2002). El incremento en el número y área ocupado por los MM puede explicarse por su rol en los procesos de detoxificación de agentes oxidantes, y su relación con la inmunidad innata o adaptativa debido a su actividad fagocítica (Van der Oost et al., 2003; Franco- Belussi et al., 2013). De esta manera diferentes autores consideran a estos como biomarcadores inmunohistológicos de contaminación ambiental (Wolke, 1992).

La glutatión-S-transferasa (GST) hepática, es utilizada como biomarcador bioquímico, relacionada con la detoxificación de agroquímicos y el stress oxidativo (Haratym-Maj, 2002). Los niveles de actividad de la GST variaron entre los dos sitios, observándose una inhibición significativa en los individuos de L. chaquensis del CA (t = 2.165, p = 0.030), con un promedio de 417.72 (±28.28) nmol min^-1. mg^-1 de proteínas totales (PT), respecto de los individuos del SR cuyo promedio fue mayor 521.83 (± 40.36) nmol min^-1. mg^-1 de PT. La inhibición de esta enzima sugiere que podría haber una mayor desintoxicación de contaminantes (o compuestos endógenos) susceptibles de interactuar con la GST. Attademo et al. (2015) al exponer individuos adultos de Lysapsus limellus a dosis de uso agronómico de CPF en las arroceras, observaron una inhibición de la GST en estómagos e hígados. La sensibilidad de las diversas especies acuáticas al CPF es variable (Giesy et al., 1999). Los diversos estudios realizados se han enfocado en el efecto sobre larvas de anuros (Dimitrie y Sparling, 2014; Liendro et al., 2015; Sotomayor et al., 2015). No contándose con antecedentes sobre los efectos hepáticos en adultos de anfibios producidos por dosis reales de aplicación de CPF.

El aumento de los melanomacrófagos y la inhibición de la actividad enzimática de la GST en el hígado de adultos de Leptodactylus chaquensis, evidencian el estrés oxidativo y en consecuencia el riesgo ecotoxicológico al que están expuestos estos organismos debido principalmente al intenso uso de CPF en estas arroceras.

Figura 1

Figura 2

Los autores de este trabajo agradecemos a los proyectos ANPCyT, FONCyT, PICT N° 470, SECTel-ASaCTely CAI + D-UNL, a Fernanda Izaguirre y a Gabriel Janney por sus contribuciones.

The authors declare that they have no conflict of interest.

Associate Editor:: John Charles Donato Rondón.

Citation/Citar este artículo como:: Huespe I, Cabagna-Zenklusen M, Curi LM, Peltzer P, Attademo MA, Villafañe N, Lajmanovich R. Melanomacrófagos hepáticos y actividad de la enzima Glutation S-Transferasa en Leptodactylus chaquensis (Anura, Leptodactylidae) como biomarcadores de estrés oxidativo por la exposición a clorpirifos. Acta biol. Colomb. 2017;22(2):234-237. DOI: http://dx.doi.org/10.15446/abc.v22n2.60823