Detección de crinivirus y begomovirus en plántulas de tomate y arvenses asociadas a semilleros¹

Crinivirus and begomovirus detection in tomato plantlets and weeds associated to nurseries

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El tomate (Solanum lycopersicum) es un cultivo de alto valor económico para productores, y nutricional para consumidores, en muchos países del mundo. Es afectado por varias plagas de origen entomológico, entre las que se destacan las moscas blancas (Hemiptera: Aleyrodidae), debido a su capacidad de transmitir virus (Navas-Castillo et al., 2011; 2014). Las infecciones de los virus que transmiten las moscas blancas pueden llegar a provocar daños fisiológicos severos, especialmente si ocurren en las primeras semanas del desarrollo de una planta (periodo crítico) (Schuster et al., 1996). Es por esto, que realizar diagnósticos tempranos puede reducir su transmisión dentro de la plantación (Hilje y Stansly, 2008) y su dispersión a otras regiones (Tzanetakis et al., 2013).

El virus del amarillamiento del tomate (Tomato chlorosis virus, ToCV) del género Crinivirus (familia Closteroviridae), es uno de los virus emergentes de mayor impacto en la producción mundial de tomate (Fortes et al., 2012). Los crinivirus poseen un genoma bipartito de ARN monocatenario sentido positivo (Liu et al., 2000). Fue descrito por primera vez en Estados Unidos (Wisler et al., 1998), pero hoy en día está presente en Europa, Medio Oriente, África, el Sureste de Asia y América Latina (Navas-Castillo et al., 2011), incluyendo Costa Rica (Castro et al., 2009). Se distingue de otros crinivirus, porque es transmitido por diferentes especies de moscas blancas, tales como Trialeurodes vaporariorum, Bemisia tabaci (anteriormente MED o biotipo Q), B. argentifolii (anteriormente MEAM1 o biotipo B) y B. inconspicua (anteriormente NW o biotipo A) (Navas-Castillo et al., 2000; Wintermantel y Wisler, 2006; Boykin, 2014; Polston et al., 2014).

El tomate también es hospedero natural de los begomovirus (familia Geminiviridae), los cuales son transmitidos por la mayoría de las especies que se incluyen dentro del complejo de B. tabaci (Rojas y Gilbertson, 2008; Boykin, 2014; Polston et al., 2014). La mayoría de los begomovirus tienen genomas bipartitos (componentes A y B) de ADN circular y simple banda (ADNsb), pero dentro del género existen especies monopartitas (Rojas et al., 2005). En Costa Rica, los begomovirus que infectan el tomate son el virus del enrollamiento de la hoja de tomate de Sinaloa (Tomato leaf curl Sinaloa virus, ToLCSinV) (Nakhla et al., 1994; Idris et al., 1999); el virus del moteado amarillo del tomate (Tomato yellow mottle virus, TYMoV) (Hilje et al., 1993; Nakhla et al., 1994; Polston y Anderson, 1997) y el virus del enrollamiento de la hoja amarilla del tomate (Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV) (Barboza et al., 2014). Este último es el único representante monopartita reportado para el país, y es considerado de alto riesgo, pues entre otros síntomas, puede provocar aborto foliar (Moriones y Navas-Castillo, 2010).

En Costa Rica en los últimos años no hay estudios de las pérdidas económicas en la producción de tomate atribuidas a estos virus, sin embargo, puede presentarse una disminución severa en la producción si las infecciones virales ocurren a nivel de plántulas antes de su venta y distribución a diferentes regiones del país. El objetivo de este trabajo fue detectar infecciones causadas por el ToCV y por begomovirus en plántulas de tomate, y en las arvenses ubicadas en los alrededores de los invernaderos.

En abril de 2008, se recolectó tejido foliar de quince plántulas de tomate (35-45 días de desarrollo), seleccionadas al azar de una bandeja con 96 compartimentos, la cual fue tratada cada doce días con el insecticida imidacloprid (500 g/ha); otras quince plántulas de tomate se tomaron de una bandeja sin este tratamiento. Lo anterior se realizó para plántulas ubicadas en tres invernaderos que se nombraron A, B y C en distintas zonas geográficas de la región de Cartago, Costa Rica, a altitudes de 1281, 1361 y 1609 msnm, respectivamente. Las condiciones estructurales entre los invernaderos B y C, comparados con A, eran muy diferentes. Por ejemplo, en los primeros no se contaba con doble puerta y se pudo observar la presencia de defectos en el cerramiento del plástico, tanto del techo como de las paredes y a alturas variables.

En cada uno de los invernaderos se realizó la recolecta de arvenses, en octubre de 2008 y en abril de 2009, que corresponden respectivamente con la época lluviosa y la época seca, respectivamente. Las arvenses se seleccionaron con base en la presencia de mosca blanca o síntomas asociados a infecciones con ToCV (Wisler et al., 1998) o con begomovirus (Rojas et al., 2005). Estas plantas se incluyeron en el estudio para analizar su potencial como hospedantes alternos.

En total se colectaron 90 muestras de tejido foliar de tomate y 78 de arvenses, las cuales se liofilizaron y almacenaron a -70 °C para su posterior análisis. La totalidad de las muestras de arvenses se identificaron a nivel de género y en algunos casos a especie.

Detección del virus de la clorosis del tomate

Se extrajo el ARN total de las muestras de tomate y arvenses recolectadas, para esto se empleó el protocolo de extracción de tiocianato de guanidina-fenol-cloroformo, según las indicaciones del fabricante. Con el ARN extraído se realizó una transcripción reversa ligada a una reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real, utilizando el kit QTaq One-Step qRT-PCR SYBR, de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Se utilizaron los iniciadores previamente descritos por Wintermantel et al. (2008), diseñados para amplificar un fragmento del gen que codifica por el homólogo de la proteína de choque térmico 70 (HSP70h) del crinivirus ToCV. Los iniciadores utilizados correspondieron a TocQ 875F 5’-AACCATTCGCTAGACGCAGTT-3’ y TocQ 998R 5’-TCTGCTCTATTCTGAATCGGTCTAA-3’ a la concentración final de 0,2 µM. Se utilizaron aproximadamente 500 ng de ARN total. El Ct (ciclos críticos o “cycle threshold”) fue determinado con el software Multiplex Quantitative PCR Systems (MxPro-3000P, Stratagene). Luego de la amplificación se elaboraron las curvas de disociación.

Detección de begomovirus

Los ácidos nucleicos totales de las muestras de tomate y arvenses se extrajeron según el protocolo descrito por Dellaporta et al. (1983), con las modificaciones detalladas por Hernández et al. (2012). La presencia de begomovirus fue evaluada inicialmente utilizando la técnica de hibridación molecular por dot blot según lo detallan Hernández et al. (2012).

Con la finalidad de aumentar la sensibilidad de los análisis posteriores, las muestras positivas por hibridación se sometieron a la técnica de amplificación por el círculo rodante (RCA) (Haible et al., 2006), con el empleo de Illustra TempliPhi Amplification Kit (Amersham Biosciences, UK) y siguiendo las instrucciones de la casa comercial. A partir de los productos de RCA se realizó una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de punto final con dos diferentes pares de iniciadores: el primer par PAR1c715 y PAL1v1978 permitieron amplificar una región de aproximadamente 1,4 kb de la parte superior del componente A (Top-A) del genoma del virus (Rojas et al., 1993), y los iniciadores PAV494 y PAC1048 que amplificaron la región más conservada del gen que codifica la proteína de cubierta (gen cp) (Wyatt y Brown, 1996). Las reacciones de PCR se realizaron según las condiciones descritas por Hernández et al. (2012).

Análisis de datos

Utilizando los resultados obtenidos de los análisis de detección, se realizó un cuadro de contingencia, con la intención de registrar y analizar la asociación entre las variables. Se contabilizó el número total de muestras positivas de plántulas de tomate y arvenses de acuerdo con el tratamiento (con o sin insecticida), y se compararon contra el total de muestras. Estos datos fueron analizados con base en la prueba de Fisher (GraphPad Software, Inc.) para determinar la existencia de diferencias significativas entre ambos ensayos.

En las plántulas de tomate se encontraron muestras infectadas con el ToCV solamente en los invernaderos B y C. La infección ocurrió en ambos sitios independientemente de la aplicación o no de insecticida a las bandejas. Los porcentajes de infección totales por invernadero y por tratamiento fueron menores a 25%; sin embargo, de forma individual, en algunos invernaderos el porcentaje fue mayor al 30% (Cuadro 1). Cuando se realizó la prueba de Fisher, no se encontraron diferencias significativas (p>0,5) entre los tratamientos.

Cuadro 1
Número de muestras de tomate de tres invernaderos (A, B y C) ubicados en distintas zonas geográficas de la región de Cartago, Costa Rica, a altitudes de 1281 (A), 1361 (B) y 1609 msnm (C), infectadas con el virus de la clorosis del tomate (ToCV), y distribución porcentual (%) con respecto al total durante 2008-2009.

Table 1. Number of tomato samples, taken from three different nurseries (A, B and C) located in different geographical regions of Cartago, Costa Rica, at altitudes of 1281 (A), 1361 (B) and 1609 (C) masl, infected with tomato chlorosis virus (ToCV) compared to the total and its corresponding percentage (%) during 2008-2009.

No se detectaron plántulas de tomate infectadas por begomovirus mediante los análisis de hibridación molecular. Para descartar la posibilidad de falsos negativos, las muestras se examinaron también mediante preamplificación por RCA y posterior PCR con iniciadores degenerados del gen cp (Wyatt y Brown, 1996) y ninguna muestra amplificó. Plántulas de chile dulce fueron analizadas para estos virus, mediante la misma técnica, y los resultados fueron negativos (los datos no se muestran).

Los porcentajes de infección del ToCV fueron similares a los reportados en invernaderos por productores de tomate en otros países como: Líbano, Grecia y España (Abou-Jawdah et al., 2006; Fortes et al., 2012; Orfanidou et al., 2013), pero el número de muestras infectadas por este crinivirus puede aumentar dependiendo de la especie de mosca blanca presente y la carga viral inoculada (Navas-Castillo et al., 2000; Dovas et al., 2002). Según Wintermantel y Wisler (2006), el ToCV es transmitido de forma eficiente por T. abutilonea y B. argentifolii, las cuales retienen el virus por cinco y cuatro días, respectivamente. Mientras que cuando T. vaporariorum es el vector, su capacidad de transmisión dura solamente un día.

Tanto B. tabaci, B. argentifolii y T. vaporarirum han sido reportadas en Costa Rica (Hilje et al., 1993; Guevara-Coto et al. 2011). Sin embargo, un estudio iniciado en 2008 en la región de Cartago, concluyó que la especie T. vaporariorum predomina en los invernaderos que cultivan tomate y chile dulce (Vargas-Asencio et al., 2013); estos ambientes protegidos parecen ser propicios para el desarrollo de esta mosca blanca (Wintermantel, 2004; 2010). De este modo, si T. vaporariorum es el vector principal en los invernaderos estudiados, eso explicaría la baja incidencia del ToCV y la ausencia de begomovirus en las plántulas analizadas.

En ocasiones, otros factores pueden alterar la cantidad de moscas blancas y la incidencia de los virus que transmiten, entre ellos, las prácticas de manejo utilizadas (Hilje y Stansly, 2002; Kakati y Nath, 2014) y las condiciones estructurales de los invernaderos (Mears y Both, 2000). Tal es el caso del invernadero A, donde no se detectaron infecciones virales y cuya estructura incluía características ideales (malla de tamaño 50-mesh, buena aireación, doble puerta y un techo sin perforaciones) para evitar la entrada de moscas blancas (Hilje y Morales, 2008). No obstante, en todos los invernaderos (incluyendo el A) se realizaba una práctica conocida como “endurecimiento”, que consiste en una aclimatación de las plántulas a condiciones similares a las del campo, colocándolas fuera del semillero cuando estas tienen entre 45 y 50 días de germinadas. El problema de esta práctica es la exposición innecesaria de las plántulas a moscas potencialmente virulíferas, y el riesgo de un ingreso accidental de los insectos a la estructura. Además, los daños fisiológicos que ocurren debido a infecciones virales tempranas podrían afectar el crecimiento e incluso propiciar una muerte acelerada de la planta (Schuster et al., 1996).

La presencia del ToCV en las plántulas podría representar un riesgo para la producción de tomate del país, debido a que los síntomas de infección se expresan de tres a cuatro semanas luego de la inoculación inicial (Wintermantel y Wisler, 2006), por lo que, muchas de ellas se llegan a comercializar estando infectadas pero sin tener síntomas visibles. De manera que, al pasar desapercibidas estas plántulas podrían facilitar la diseminación del ToCV a otras regiones del país. Es por esto que mantener las plantas libres de virus durante el periodo crítico del desarrollo debe ser prioridad, en especial en este tipo de invernaderos donde hay material vegetal disponible, para que potencialmente el inóculo viral persista a lo largo del año (Hilje y Stansly, 2008).

Con respecto a los tratamientos con insecticida aplicados en los ensayos, se pretendía determinar si habría una diferencia en el número de plántulas infectadas asumiendo que los tratamientos podrían reducir la cantidad de vectores. Sin embargo, las infecciones virales detectadas ocurrieron tanto en las plántulas que recibieron el tratamiento químico como en las que no. La aplicación de insecticidas sigue siendo una herramienta muy utilizada (Perring et al., 1999) y en algunos casos la única forma de manejo. La literatura señala que las aplicaciones frecuentes y prolongadas de imidacloprid promueven la aparición de individuos resistentes tanto de B. tabaci y B. argentifolii (Elbert y Nauen, 2000; Li et al., 2001, Nauen et al., 2002), como de T. vaporariorum (Gorman et al., 2007), lo que prueba que un único método de control puede ser evadido de muchas maneras, por lo que para un manejo eficaz puede ser necesario implementar varias estrategias a la vez (Gilbertson et al., 2011).

Seis muestras de las 78 arvenses examinadas, estaban infectadas con ToCV, lo que representa un 7,7% del total. En el invernadero A, la especie Plantago major (Plantaginaceae) fue la única positiva. Mientras que en el invernadero B, tres muestras resultaron infectadas, estas correspondieron a Ruta chapelensis (Rutaceae), Phytolacca icosandra (Phytolacaceae) y Cucurbita moschata (Cucurbitaceae), que crecía como planta voluntaria. Para el invernadero C, se identificaron dos plantas del género Brassica (Brassicaceae) positivas para el crinivirus. Además, se identificaron muestras de arvenses positivas para begomovirus con la técnica de hibridación molecular. Estos resultados se confirmaron por medio de RCA y PCR con dos pares de iniciadores degenerados. Excepto por una muestra de Phaseolus sp, todas las muestras amplificaron con ambos iniciadores (Cuadro 2).

Cuadro 2
Detección del virus de la clorosis del tomate (ToCV) y begomovirus en especies de arvenses colectadas en los alrededores de tres invernaderos (A, B y C) ubicados en distintas zonas geográficas de la región de Cartago, Costa Rica, a altitudes de 1281 (A), 1361 (B) y 1609 msnm (C), durante el 2008-2009.

Table 2. Tomato chlorosis virus (ToCV) and begomovirus detection in weeds species collected at three nurseries surroundings (A, B and C), located in different geographical regions in Cartago, Costa Rica, at altitudes of 1281 (A), 1361 (B) and 1609 (C) masl, during 2008-2009.

Dos de las seis arvenses positivas para begomovirus, también estaban infectadas con el ToCV (Cuadro 2). En total, se han encontrado catorce especies de plantas distribuidas en nueve familias, susceptibles a infecciones del ToCV en Costa Rica; convirtiéndolo en el crinivirus con mayor amplitud de hospedantes del país (Cuadro 3).

Cuadro 3
Familias y especies de cultivos y arvenses que se han determinado como hospedantes naturales de crinivirus y begomovirus en Costa Rica.

Table 3. Families and species for crops and weeds determined as natural host for crinivirus and begomovirus in Costa Rica.

Vargas-Asencio et al. (2013), Solórzano-Morales et al. (2011), Karkashian et al. (2002), Ramírez et al. (2008), Castro et al. (2013), Kim y Flores (1979), Gámez (1971), Hilje et al. (1993), Díaz et al. (2002), Morales (2010), Castro et al. (2013), Höfer et al. (1997), Castro et al. (2009), Nakhla et al. (1994), Nakhla et al. (2005), Barboza et al. (2014), Vargas-Asencio et al. (2013), Lotrakul et al. (2000), Vargas et al. (2011)

En cuanto a los begomovirus, ya se han reportado once especies virales distintas en el país, una de ellas, el virus del enrollamiento de la hoja del camote (Sweet potato leaf curl virus, SPLCV) el cual fue detectado solamente por hibridación molecular (Valverde y Moreira, 2004). La mayoría de estos virus se han identificado en una sola especie de planta, un hecho que no les resta importancia y deben ser vigilados para evitar futuras epidemias. No obstante, el número de hospedantes del virus del mosaico dorado del chile (Pepper golden mosaic virus, PepGMV) parece ir en aumento, al igual que el del MCLCuV-CR, ambos capaces de infectar cuatro o más diferentes hospedantes (Cuadro 3).

Las infecciones por begomovirus detectadas en las arvenses son evidencia de que Bemisia está presente en el agroecosistema. No obstante, se desconoce la especie de Bemisia que se haya establecido en las cercanías de los invernaderos, los niveles poblaciones a lo largo del año y su comportamiento de selección hacia los hospedantes disponibles. Algunos factores como el clima o las características de las hojas podrían influenciar la colonización preferencial de estos insectos por ciertas plantas. En ocasiones, el número de moscas blancas tiende a disminuir durante la época lluviosa por la reducción de la temperatura y el daño mecánico de las precipitaciones sobre las plantas (Hilje y Morales, 2008). Además, varios autores afirman que las hojas jóvenes, con gran vellosidad, presencia de glándulas y gran densidad de venas vasculares (Janssen et al., 1989; Lei et al., 1998; Chu et al., 2000), son preferidas por estos insectos para establecerse. De modo que, faltan estudios para concluir sobre los motivos por los cuales este vector transmitió begomovirus en las arvenses y no en las plántulas.

Desde el punto de vista epidemiológico, las arvenses infectadas por ToCV o begomovirus representan potenciales hospedantes alternos de estos virus. Se destacan aquellas plantas con hábito de crecimiento perenne (S. quitoense y P. icosandra) que pueden ser reservorios de inóculo viral a lo largo del año (Jovel et al., 2007). Los hospedantes alternos son particularmente importantes para el insecto en ausencia de los cultivos (Norris y Kogan, 2005) y también para los crinivirus y begomovirus, pues no se replican dentro del vector (Acotto y Sardo, 2010). En Costa Rica, durante décadas, los begomovirus identificados se establecían en los cultivos y las arvenses no tenían un papel relevante para los investigadores (Hilje et al., 2001). En la actualidad, esa idea ha cambiado y ahora se reconoce que estas plantas podrían funcionar como puentes entre los virus, el vector y los cultivos cercanos (Solórzano-Morales et al., 2011; Castro et al., 2013; Vargas-Asencio et al., 2013).

Otro aspecto relevante, es la oportunidad de emergencia de nuevas especies virales y de enfermedades distintas debido a las coinfecciones, es decir, por la presencia de dos o más virus en una misma planta. Infecciones mixtas entre el ToCV y begomovirus detectadas en cultivos de tomate, con frecuencia provocan daños más severos y por ende mayores pérdidas en la producción (Martínez-Zubiaur et al., 2008; Velasco et al., 2008). De la misma forma, diferentes especies de begomovirus se han encontrado infectando la misma planta, debido a hospedantes en común (Ala-Poikela et al., 2005; García-Andrés et al., 2007). Esta convergencia puede promover la variación genética y biológica de las especies preexistentes, a través de la aparición de mutantes, recombinantes y pseudorecombinantes (Seal et al., 2006; Jones, 2009; Nawaz-ul-Rehman y Fauquet, 2009).

Este trabajo es el primero en detectar e informar la presencia del ToCV a nivel de plántulas de tomate en Costa Rica y no hay evidencia todavía de infecciones por begomovirus. Es importante resaltar que las plántulas infectadas, que son asintomáticas, podrían ser comercializadas fuera de la región de Cartago, favoreciendo la diseminación del ToCV al resto del país. Además, dado que las infecciones detectadas ocurren en el período crítico, la probabilidad de que desarrollen problemas fisiológicos es mayor, representando pérdidas económicas para el productor de tomate.

Los resultados sugieren que las arvenses podrían estar actuando como reservorio del ToCV, begomovirus e incluso de coinfecciones entre ambos. Ante esto, la práctica de aclimatación es riesgosa, ya que las plántulas sanas pueden infectarse de cualquiera de los virus detectados en las arvenses cercanas a los semilleros. Todavía se requiere mayor investigación sobre el papel que cumplen las arvenses alrededor de estos invernaderos, pero es claro que no se pueden ignorar y es necesario aplicar prácticas de control.

Un estudio adicional de las especies de mosca blanca presentes en el agroecosistema resultaría muy provechoso, ya que esto contribuirá a monitorear la evolución de los virus que transmiten y establecer estrategias de prevención ante potenciales especies virales emergentes.

A la Vicerrectoría de Acción Social (VAS) de la Universidad de Costa Rica y al Consejo Nacional de Rectores (CONARE) por el financiamiento de esta investigación. A los productores de plántulas de tomate y chile dulce de la región de Cartago que nos permitieron el acceso a los invernaderos y donaron las bandejas con las muestras recolectadas.