La detección directa se hace en el primer estadio larval (L1 enquistada) en tejido muscular, se realiza en la inspección post-mortem y comprende 2 técnicas: Triquinoscopía Directa y Técnica de Digestión artificial o enzimática (Trujillo et al., 2009).

Las canales de cerdos domésticos son sometidas a muestreos sistemáticos en los mataderos en el marco de los exámenes post-mortem. Se toma una muestra de cada canal, que se analiza para detectar triquinas en un laboratorio designado por la autoridad competente (Comisión de la Comunidades Europeas., 2005).

Los músculos de interés parasitológico y los que concentran la mayor cantidad de larvas de T. spiralis en la especie porcina son el diafragma, la lengua, los maseteros y los intercostales. Por otro lado, se encuentran los músculos de interés comercial que también son invadidos por las larvas de T spiralis y muchos de ellos se consumen crudos en forma de chacinados (bondiola, jamón, paleta) (Ribicich et al., 2011).

Es un método antiguo que aún es utilizado en zonas donde no existen laboratorios con capacidad para practicar técnicas de digestión enzimática.

El procedimiento consiste en la inspección óptica de muestras de tejido muscular que se cortan en pequeños trozos en la dirección de las fibras (Ruiz et al., 2008). Para la toma de la muestra, se extraen 45 gr de uno de los pilares del diafragma cortando el músculo en el mismo sentido de la fibra muscular, otros de los músculos más frecuentemente parasitados son los intercostales, maseteros y abdominales (Trujillo et al., 2009). Este método implica la compresión de múltiples trozos de tejido muscular de 2 × 10 mm entre dos placas de vidrio (compressorium) hasta que se vuelven translúcido, seguida de un examen al microscopio (OIE, 2008). Si es positivo, se ven los quistes con larvas en su interior o éstos pueden estar calcificados si corresponden a la fase clínica de un estado mayor de 24 meses (Rodriguez & Sanchéz, 2006).

El examen triquinoscópico no consigue detectar las especies de Trichinella no encapsuladas que infectan a animales domésticos y salvajes y a seres humanos, y no es un método adecuado de detección para una utilización estándar. El método triquinoscópico sólo debería usarse en circunstancias excepcionales para examinar un pequeño número de animales sacrificados por semana (Comisión de la Comunidades Europeas., 2005). Además, este método se ha utilizado durante décadas, es laborioso y se dispone de datos comparativos según los cuales no es tan sensible como los ensayos de digestión también no es práctico cuando se han de probar en grandes cantidades de animales (OIE, 2008).

El único procedimiento recomendado para la detección de las larvas de Trichinella en la carne son las pruebas de digestión enzimática. En varios países se reconoce oficialmente un cierto número de pruebas de digestión con fines comerciales. La Comisión Internacional para Triquinelosis (CIT) recomienda varias de estas pruebas, que constituyen estándares documentados en la Unión Europea, Canadá y Estados Unidos. Este método consiste en la digestión in vitro del tejido muscular con ácido clorhídrico y pepsina, seguida de la visualización microscópica y la cuantificación de las larvas del parásito (Recaverren et al., 2015).

El examen parasitológico directo puede ser positivo luego de dos semanas post-infección. En el examen de rutina de canales de cerdos en los que se emplea la digestión artificial, se recomienda procesar como mínimo un gramo y de preferencia cinco gramos de tejido para la prevención de la enfermedad (Malandrini et al., 2010). Esta técnica tiene una baja sensibilidad, ya que generalmente se analizan muestras compuestas o pools de 100 g de tejido en mataderos o de 10 g en muestras individuales en laboratorios, y no siempre el material remitido es el recomendado para cerdos domésticos (diafragma y masetero) (Recaverren et al., 2015).

Para que el examen sea más confiable se deberían tener en cuenta los siguientes puntos críticos primero debe mantenerse un sistema verificable de recolección e identificación de las muestras lo que permita la identificación inequívoca del animal positivo, segundo el líquido de digestión debe ser preparado de manera que no afecte la actividad de la pepsina, es decir, agregar al agua destilada el ácido clorhídrico y luego colocar la pepsina. Este procedimiento evita el contacto directo del ácido sobre la pepsina. se debe mantener sobre todo el proceso la temperatura 44 a 46º C. Las temperaturas más altas traerán como resultado la inactivación de la pepsina, digestión incompleta y pobres tasas de recuperación larvaria. Las temperaturas más bajas requieren tiempos más prolongados de digestión (Ministerio de Asuntos Agrarios y Producción de Buenos Aires., 2011).

La técnica de digestión artificial rápida (DAR) se ha usado en reemplazo de la triquinoscopía y esta metodología permitió incrementar el diagnóstico de cerdos positivos en el frigorífico. La triquinoscopía puede detectar entre 3 y 10 larvas por gramo (LPG), mientras que la DAR detecta los animales parasitados con 1 a 3 LPG. Este incremento en la sensibilidad, permitió disminuir los brotes humanos al detectar una mayor proporción de animales positivos en la faena (Ribicich et al., 2011).

Son todos los test serológicos para el diagnóstico de triquinosis, tienen la ventaja de detectar infecciones leves y se pueden realizar en el animal vivo (Trujillo et al., 2009). Estas técnicas se encuadran a la detección de la respuesta inmunológica humoral o celular en el hospedero y representan una evidencia sólida del contacto con el parasito (Ministerio de Salud de Chile., 2016). El principio básico de cualquier técnica inmunoquímica es el de que un anticuerpo específico se unirá con un antígeno específico para dar un complejo anticuerpo-antígeno exclusivo (Calderón, 2007).

Los huéspedes de Trichinella spp. adquieren una sólida inmunidad dirigida contra los vermes adultos, las LRN (Larvas recién Nacidas) migrantes y las LM (Larvas Musculares). Los adultos y la actividad temprana de las LRN impactan principalmente sobre la inmunidad de la mucosa intestinal, y la circulación de las LRN en sangre o linfa y la LM, evoca una inmunidad sistémica.

Los antígenos de T. spiralis pertenecen a dos grupos: a) grupo I, aquellos que inducen respuesta luego de la segunda semana post-ingesta y b) grupo II, detectados a partir de la cuarta, quinta semana post-ingesta (Riva et al., 2007). Los antígenos de los parásitos se pueden clasificar según la fuente de donde se obtienen para su estudio o aplicación clínica y su naturaleza química. (Becerril, 2014)

Los parásitos tienen ciclos de vida complejos y esta diversidad de etapas o estadios que el parásito debe completar en su ciclo vital implica un cambio estructural, bioquímico y celular que se refleja en la diversidad de antígenos que se pueden presentar de acuerdo con las diferentes etapas de desarrollo, las cuales pueden ser concurrentes en un mismo hospedero, por lo cual un parásito puede expresar diferentes antígenos de distintos estadios en un mismo hospedero. En consecuencia, la inmunidad despertada por estos antígenos por lo general es específica de estadio. Una clasificación práctica de los antígenos parasitarios de acuerdo con su origen es la siguiente: antígenos solubles extraídos del parásito (somáticos), antígenos solubles excretados o secretados, antígenos sintéticos y antígenos recombinantes (Becerril, 2014).

Con la obtención de larvas Infectantes (LI) de T.spiralis se someten a varios lavados con solución básica de fosfatos (PBS), se desengrasan con acetona absoluta a evaporación y se mantienen en PBS, después se procede a sonicar con la finalidad de romper cutícula y vaciar el contenido antigénico de las LI de T. spiralis, se centrifuga a 3500 rpmo por 1 hora y 30 minutos; el sobrenadante contiene el antígeno soluble total (AST) que se usa como antígeno soluble total de T. spiralis para las diferentes pruebas en los sueros problema (Moreno et al., 2007).

La inmunofluorescencia indirecta es una técnica de alta sensibilidad que consiste en incubar el suero del paciente (anticuerpo) en un sustrato antigénico (células HEp- 2, hígado o riñón de rata), al cual se le añade una antiinmunoglobulina unida a un fluorocromo que permite visualizar la reacción con un microscopio de fluorescencia. Los resultados son reportados como negativos o positivos, expresando la dilución y el tipo de patrón (Munive et al., 2010).

La fluorescencia es una propiedad de ciertas moléculas que, al ser irradiadas con energía electromagnética de longitud de onda adecuada, emiten radiación de longitud de onda característica permitiendo su cuantificación. Se utiliza esencialmente en la detección de autoanticuerpos y anticuerpos contra antígenos de superficie de células y tejidos (Calderón, 2007).

La gran desventaja de este método es que es operador dependiente y la confiabilidad de los resultados está directamente relacionada con la experiencia del observador (Hayashi et al., 2001).

El diagnóstico se basa en un sistema en paralelo conformado por un enzimo inmuno-ensayo de base sólida (ELISA) que mide anticuerpos circulantes contra antígenos de excreción y secreción como método de tamizaje (Malandrini et al., 2010). Según investigaciones recientes los anticuerpos específicos contra Trichinella spiralis detectados por la prueba de ELISA, se mantienen en el cerdo durante 100 días post-infección. Debido a que las larvas comienzan a ser infectivas entre los 17 y 21 post-infección (Medina et al., 2006).

Este es el método más comúnmente utilizado para la detección de la infección por Trichinella spp. debido principalmente a la sensibilidad metódica que permite la detección de tan solo 1 larva por 100 g de tejido muscular (Bruno Gottstein et al., 2009). Este método se emplea sobre todo en estudios epidemiológicos. El interés en la práctica clínica se limita al diagnóstico retrospectivo cuando se desea confirmar el diagnóstico (Cañavate et al., 2009).

En los cerdos que tienen 1 o 2 larvas por gramo, solamente ELISA es 100 % efectiva para diagnosticar Triquinelosis. Mientras que las pruebas Western blot y digestión artificial tienen baja sensibilidad y un valor predictivo del resultado negativo bajo en cerdos con baja carga de larvas, que dejan pasar falsos negativos para consumo (Guanera et al., 2006).

El Western Blot es una prueba complementaria a la técnica de digestión artificial, la primera prueba se basa en la detección de anticuerpos, mientras que la segunda se basa en la detección del agente infectante (Frey et al., 2009).

Este método permite la detección de antígenos específicos de Triquinela y puede discriminar anticuerpos de reacción cruzada. Sin embargo, esta prueba no es aplicable para el diagnóstico de rutina, ya que requiere conocimientos técnicos que consumen tiempo, y es costoso; por lo tanto, la técnica se usa a menudo como un complemento para confirmar otras pruebas serológicas con resultados positivos en lugar de como una herramienta de rutina (Yang et al., 2016).

Los métodos de diagnóstico existentes se basan en la observación directa de los microorganismos y en la utilización de las reacciones inmunológicas que generan en el huésped, como las intradermorreacciones, y el desarrollo de métodos de detección de anticuerpos (p. ej., prueba ELISA), hemaglutinación directa e indirecta (HA) e inmunofluorescencia (IF). Estos métodos son confiables y ofrecen valores adecuados de especificidad y sensibilidad. Sin embargo, las reacciones cruzadas producen en ocasiones errores en los diagnósticos y originan la necesidad de recurrir a varias pruebas para establecer la causa exacta de la enfermedad en cuestión. Con el surgimiento de las técnicas moleculares se alcanzaron nuevas fronteras de especificidad y se aumentó la sensibilidad de las pruebas hasta poder detectar 1/12 000 de parásito, es decir, hasta 0.025 fentogramos de DNA en una muestra de sangre (Becerril, 2014).

Esta es una herramienta rápida y sencilla que se ha venido aplicando en estudios epidemiológicos moleculares. Ellos proporcionan información útil sobre la naturaleza y el alcance de la diversidad genética de las poblaciones de parásitos en una ubicación geográfica específica (Jojoa, 2012). El análisis del polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción terminal es una técnica popular de huellas digitales de alto rendimiento utilizada para monitorear los cambios en la estructura y composición de las comunidades microbianas y parasitarias (Schütte et al., 2008).

Este método en combinación con la técnica de PCR permitió la diferenciación de 9 genotipos de Trichinella (Nagano et al., 2003).

Actualmente el ADN es la molécula de elección como marcador molecular. Se analizó por primera vez por RFLP, pero el desarrollo de la PCR permite el uso de esta metodología poderosa para diseñar enfoques más rápidos de huellas dactilares como RAP (Amplificación aleatoria de polimorfismos) no solo el ADN se usa como marcador molecular, sino que también el ARN es uno de los más usados. Otras tecnologías de gran alcance para las huellas digitales son matrices y microarrays de ADN, ARN o péptidos, (Dorado et al., 2015). El aislamiento y la purificación del ADN es un paso clave en los estudios de biología molecular. Los métodos de extracción de ADN involucran la ruptura de la pared celular o membrana celular mediante la lisis enzimática o mecánica y, en general, requieren pasos adicionales para la obtención de ADN puro (Siachoque et al., 2010).

La técnica del RAPD se basa en la amplificación de segmentos de ADN genómico mediante la tecnología de la PCR a partir de cebadores oligonucleótidos cortos, diseñados previamente al azar. El patrón de bandas que se obtiene como resultado permite conocer el polimorfísmo genético entre las diferentes especies o cepas (aislamientos). La habilidad de este método de detectar variaciones al nivel genético, ha permitido estudiar daños y mutaciones en él (Monzote et al., 2009).

El RAPD no necesita de grandes cantidades de ADN, ni de un previo conocimiento genético de las especies a estudiar y permite el análisis de una gran cantidad de individuos ya que es simple, rápido y de bajo costo (Roldán et al., 2014).

Cuando se habla de sondas de ADN o ARN se refiere a segmentos de ácido nucleico de cadena simple utilizados como anzuelos para detectar una pieza de ADN fija en un soporte o suelta dentro de una sopa de molécula (Coto, 2003).

La utilización de sondas de ADN permite un diagnóstico muy específico, pero poco sensible sin embargo se utilizan fundamentalmente para la identificación de los patógenos presentes en cualquier organismo. (Torres, 2006). Mediante la utilización de sondas específicas de ADN obtenidas de distintos genotipos de Trichinella se logró diferenciar algunos genotipos como: T. spiralis y T. murrelli (La Rosa & Pozio, 2000).

Se incluyen entre las técnicas de secuenciación; su característica es separar ácidos nucleicos de cadena sencilla que tienen distinta secuencia. Pueden detectarse diferencias de una sola base, ya que alteran la estructura secundaria de la cadena de ADN y son visibles al analizarlos por electroforesis. Los SSCP son muy utilizados en la identificación de genotipos de individuos que difieren en su secuencia de ADN (Ríos et al., 2009). Es decir, el análisis empleando esta metodología permite comprobar la variabilidad intraespecífica entre individuos de una misma especie de Trichinella.

A diferencia de PCR-RFLP (Polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción) es un método que no requiere enzima de restricción y gel de agarosa. El costo del diagnóstico se reduce a la mitad, es más fácil y rápido que el método PCR-RFLP. Los fragmentos amplificados son visualizados en una corrida electroforética en un gel de acrilamida a 3 °C (Klug, 2013).

En la PCR multiplex se incorporan a la reacción de amplificación más de un par de sondas específicas para diferentes secuencias blanco. Los fragmentos generados pueden reconocerse por su tamaño o por medio de marcadores incluidos en las sondas. Entre las aplicaciones de este sistema figuran el análisis de muestras en las que hay varias moléculas blanco del mismo organismo, la confirmación de que éste se halla presente, o bien la investigación de forma simultánea de varios patógenos, para lo cual se incluyen sondas específicas para cada microorganismo. La dificultad principal de la PCR multiplex es el diseño adecuado de los oligos con el fin de evitar interacciones inespecíficas entre ellos y reconocimientos cruzados y lograr que las ampliaciones resultantes se puedan diferenciar unas de otras (Hernández & Rodríguez, 2009).