Resumen:
Entre los principales problemas sanitarios para la producción ovina están los parásitos gastroentéricos; de ellos, el más importante es Haemonchus contortus. Las estrategias actuales de control enfocan la eficacia, junto con el bajo o nulo impacto al ecosistema; el estudio del control integral de parásitos permite la investigación de alternativas con probable efecto antihelmíntico, entre ellas el uso de semilla de papaya (Carica papaya). El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto in vitro de los extractos hidroalcohólico y etanólico de la semilla de papaya (C. papaya) sobre huevos y larvas de H. contortus. El trabajo se llevó a cabo con el equipo e instalaciones del Laboratorio 3 de la Unidad de Investigación Multidisciplinaria en la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán, UNAM. Se elaboraron los extractos por medio de macera- Entre los principales problemas sanitarios para la producción ovina están los parásitos gastroentéricos; de ellos, el más importante es Haemonchus contortus. Las estrategias actuales de control enfocan la eficacia, junto con el bajo o nulo impacto al ecosistema; el estudio del control integral de parásitos permite la investigación de alternativas con probable efecto antihelmíntico, entre ellas el uso de semilla de papaya (Carica papaya). El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto in vitro de los extractos hidroalcohólico y etanólico de la semilla de papaya (C. papaya) sobre huevos y larvas de H. contortus. El trabajo se llevó a cabo con el equipo e instalaciones del Laboratorio 3 de la Unidad de Investigación Multidisciplinaria en la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán, UNAM. Se elaboraron los extractos por medio de macera- ción en solvente. Se inoculó un ovino con 5000 larvas de tercer estadio (L3) de H. contortus, cepa aislada y mantenida en dichas instalaciones. Se tomaron muestras de materia fecal y se recuperaron huevos para el ensayo de inhibición de la eclosión. Los huevos y las L3 fueron pretratados con extracto hidroalco- hólico y etanólico de semilla de papaya (2.5 mg/ml), agua destilada, etanol 90 % y levamisol (7.5 mg/ ml). Se efectuó la técnica de explantes abomasales, evaluando el efecto de los extractos sobre las L3 y su asociación a la mucosa abomasal. Se realizó un ANOVA para muestras repetidas por medio del programa Statgraphics. El extracto etanólico de semilla de papaya mostró el 92 % de inhibición de la eclosión; el extracto hidroalcohólico mostró 50 % (p<0.05). En el caso de los explantes, el extracto etanólico mostró el 10 % de larvas no asociadas al tejido abomasal, seguido por el extracto hidroalcohólico, con el 60 % de larvas no asociadas (p<0.05). Se concluye que el extracto etanólico tiene efecto sobre huevos, mientras que el extracto hidroalcohólico inhibe la asociación al tejido abomasal.
Palabras clave:Carica papayaCarica papaya,extracto etanólicoextracto etanólico,extracto hidroalcohólicoextracto hidroalcohólico,Haemonchus contortusHaemonchus contortus.
Abstract: Among the main health problems for sheep production are gastrointestinal parasites, of which the most important nematode is Haemonchus contortus. Current control strategies focus on the effectiveness, along with the low impact on the ecosystem. The study of the integral control of parasites allows the investiga- tion of alternatives with probable anthelmintic effect, such as the use of papaya (Carica papaya) seeds. This study aimed at evaluating the in vitro effect of hydroalcoholic and ethanolic extracts of papaya seeds on eggs and larvae of H. contortus. The study was carried out with the equipment and facilities of Labo- ratory 3 of the Multidisciplinary Research Unit at the Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán, UNAM. The extracts were prepared through maceration in solvent. A sheep was inoculated with 5000 L3 of H. contortus, a strain isolated and maintained in the facilities. Fecal samples were collected, and eggs were recovered for the hatch inhibition assay. The eggs and L3 were pretreated with hydroalcoholic and etha- nolic extract of papaya seed (2.5 mg/ml), distilled water, ethanol 90 %, and levamisole (7.5 mg/ml). The abomasal explants technique was used to evaluate the effect of the extracts on L3 and its association to the abomasal mucosa. An ANOVA was performed for repeated samples using the Statgraphics program. The ethanolic extract of the papaya seed inhibited 92 % of hatching, and the hydroalcoholic extract 50 % (p<0.05). In the case of the explants, the ethanolic extract showed 10 % of the larvae not associated with the abomasal tissue, followed by the hydroalcoholic extract with 60 % of non-associated larvae (p<0.05). In conclusion, the ethanolic extract has an effect on eggs, while the hydroalcoholic extract inhibits the association to the abomasal tissue.
Keywords: Carica papaya, ethanolic extract, hydro alcoholic extract, Haemonchus contortus, seeds.
Efecto in vitro de los extractos hidroalcohólico y etanólico de semilla de papaya (Carica papaya) en HAEMONCHUS CONTORTUS
In vitro effect of the hydroalcoholic and ethanolic extracts of papaya seeds (Carica papaya) against Haemonchus contortus
Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia
Recepción: 06 Septiembre 2017
Aprobación: 29 Diciembre 2017
El estatus sanitario de un rebaño ovino garantiza la producción y la generación de indicadores positivos; unas de las enfermedades que afectan este rubro son las parasitosis gastroentéricas (1), de las cuales sobresale, por su característica hematófaga, la ocasionada por el nematodo Haemonchus contortus (2). El manejo sanitario actual impide el control de infecciones y maximiza el daño causado en el hospedero, además de originar otro tipo de problemas, como la resistencia antiparasitaria; en estas condiciones, herramientas alternativas, como la herbolaria y la homeopatía, y el uso de razas resistentes abren paso a la investigación (3, 4).
El control integrado de parásitos plantea una herramienta tangible a los problemas suscitados por el manejo señalado; dentro de las opciones se encuentra la herbolaria, que permite el uso de diferentes plan- tas en preparaciones hidroalcohólicas, alcohólicas o acuosas que potencian el efecto de las moléculas activas (5-9). La semilla de papaya se ha utilizado como principio antihelmíntico (10) en extractos acuosos, pero su eficacia es controvertida; el solvente que se utiliza para la extracción y los resultados reportados son diversos (11). La semilla de papaya debe tener un manejo previo, como el secado, oreado, macerado y mezcla con el solvente final (12). El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto del extracto hidroalcohólico y del etanólico de la semilla de papaya (Carica papaya) contra huevos y L3 del parásito H. contortus.
Este trabajo se llevó a cabo en el Laboratorio 3 de la Unidad de Investigación Multidisciplinaria, de la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán, UNAM. La localidad está a 2,100 m s.n.m., posee clima semiseco y una temperatura media anual de 16.6 0C (23).
La metodología utilizada es la reportada por Bautista (13). Se obtuvieron 400 g de semillas de papaya (C. papaya) recién cortada, adquirida en el mercado regional; a las semillas se les extrajo la humedad en estufa a 100 °C durante 48 horas, obteniéndose 68 g en base seca.
Se realizó el macerado de los 68 g de semillas (base seca) en mortero; 34 g se mezclaron con solvente hidroalcohólico (50:50) y 34 g se destinaron para el extracto etanólico al 90 %. Durante cinco días se adicionó al macerado, de forma lenta, sol- vente a 15 °C, hasta que la semilla perdió su color. El extracto obtenido se concentró por medio de ro- taevaporador y el residuo obtenido se liofilizó.
Los huevos de H. contortus se obtuvieron de las heces de un cordero donador, infectado experimentalmente con 5000 larvas de tercer estadio (L3). La cepa es de origen ovino aislada, mantenida y caracterizada en la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán (14). Se colectaron larvas infectantes por medio de la técnica de Corticelli-Lai (15).
1) Técnica de inhibición de la eclosión de huevos. Esta técnica se realizó siguiendo la metodología citada por Coles y col. (16) y Carvalho y col. (17).
1. Se homogeneizaron las muestras de materia fecal con un agitador en solución salina fisiológica.
2. De las dos fases formadas, se colectó el sobrenadante por pipeteo en un tubo para centrifugar.
3. Se procedió a centrifugar a 3000g/5 min, hasta que los huevos estuvieron en el fondo de los tubos, realizando siete repeticiones de este paso.
4. Una vez que se obtuvieron los huevos se procedió a cuantificarlos. Se aplicaron los siguientes tratamientos como se muestra en la Tabla I.
Tabla I
Tabla I. Tratamientos aplicados a huevos de H. contortus.
5. Se adicionaron aproximadamente 100 huevos a cada pozo.
6. Se llevó a incubación a 27 oC durante 48 horas.
7. Se llevó a cabo la lectura al microscopio con el objetivo de 40X, se añadieron gotas de Lugol para fijar la muestra y se cuantificó.
btener los explantes seincidió por la curvatura menor, se retiró el contenido y se lavó con solución salina fisiológica al 0.85%, se realizaron cortes circulares de tres centímetros de diámetro y se colocaron en placas de cultivo con medio Hanks y Hepes a 20 mmol y 37
2) Técnica de explantes abomasales. Se realizó según la técnica descrita por Jackson y col. (18). El abomaso se obtuvo de un ovino libre de nematodos gastroentéricos. Para obtener los explantes seincidió por la curvatura menor, se retiró el contenido y se lavó con solución salina fisiológica al 0.85%, se realizaron cortes circulares de tres centímetros de diámetro y se colocaron en placas de cultivo con medio Hanks y Hepes a 20 mmol y 37 ºC
A las L3 obtenidas se les realizó el siguiente proceso:
1. Se desenvainaron con hipoclorito de sodio al 1% y se centrifugaron a 3500 g/5min.
2. Se realizaron tres lavados con agua destilada y se centrifugaron a 3500 g/5min.
3. Se aplicaron los siguientes tratamientos, como se muestra en la Tabla II.
Tabla II
Tabla II. Tratamientos aplicados a las L3 de H. contortus desenvainadas.
4. Se adicionaron 2500 + 200 L3 de H. contortus a cada pozo sobre el tejido abomasal.
5. Se incubaron durante tres horas y se realizaron dos lavados del tejido con solución salina fisiológica a 0.85 % a 37 °C.
6. El tejido abomasal se sometió a digestión con una mezcla de ácido clorhídrico al 1 % y pepsina al 1 % durante 48 horas.
7. una vez transcurrido este tiempo se procedió a cuantificar las L3 asociadas al tejido.
Los datos fueron ajustados a una curva de distribución normal por medio del programa Statgraphics XV®, y posteriormente se realizó un ANOVA multifactorial por medio del mismo programa.
El manejo del cordero donador de huevos de H. contortus se realizó conforme a los lineamientos del Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Experimentación, de la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán de la Universidad Nacional Autónoma de México (CICUAE- FESC-uNAM).
El extracto hidroalcohólico mostró inhibición de la eclosión de huevos del 50 %; el extracto etanólico, del 90 %; el albendazol, del 78 %, mientras que el testigo con agua mostró 100 % de desarrollo a L1, los resultados se detallan en la Figura 1.
Figura 1
Fig. 1. Inhibición de la eclosión de huevos de H. contortus expuestos a extracto etanólico y extracto hidroalcohólico de semilla de papaya (C. papaya). * Muestran diferencia estadísticamente significativa (p< 0.05) ME + EE.
Batatinha y col. (19) mostraron que la actividad antihelmíntica atribuida a la semilla de papaya se debe al compuesto químico denominado benzil isotiocianato. Kermanshai y col. (20) mostraron una correlación positiva entre la actividad antihelmíntica y la presencia de benzil isotiocianato en los aceites esenciales de las semillas de papaya. Batatinha y col. (19) mostraron reducción del metabolismo energético e interferencia motora de Ascaridia galli, por lo cual presumieron parte del mecanismo de acción. Los resultados descritos son comparables con los obtenidos en el presente es- tudio, donde el extracto etanólico de la semilla de papaya mostró inhibición de la eclosión de huevos de H. contortus. De la misma manera, Buttle y col.
(22) mostraron que el mecanismo antihelmíntico de la semilla de papaya se debe a cistein protei- nasas, el cual se demostró en ensayos in vivo e in vitro en roedores. Las enzimas presentes en la semilla de papaya se unen a proteínas presentes en la cutícula del parásito adulto, causando debilitamiento, ruptura y liberación de tejidos internos, con consecuente muerte del adulto. Estos hallazgos explican la ruptura de la cutícula del huevo, causando liberación y muerte de este (13).
El extracto etanólico de semilla de papaya (C. papaya) mostró un 10 % de larvas no asociadas al tejido abomasal; en el caso del extracto hidroalcohólico, el 60 % de las larvas aplicadas no se asociaron al tejido abomasal; el levamisol evidenció 0 % de larvas asociadas al tejido, mientras que el etanol mostró un 79 % de larvas asociadas al tejido abomasal; los resultados se muestran en la Figura 2.
Figura 2
Fig. 2. Evaluación de larvas asociadas y no asociadas al tejido abomasal, las L3 de H. contortus fueron expuestas a extracto etanólico y extracto hidroalcohólico de semilla de papaya (C. papaya). * Muestran diferencia estadísticamente significativa (p<0.05) ME + EE.
Batatinha y col. (19) mostraron que extractos acuosos hechos con semilla de papaya (C. papaya) muestran actividad antihelmíntica, resultado relacionado con los encontrados en este estudio, donde el 60 % de las larvas no se asociaron al tejido abomasal en el ensayo de explantes abomasales. Kermanshai y col. (20) mostraron que el compuesto responsable (benzilisotiocianato) es soluble en agua, lo que podría ser responsable de la actividad de los extractos acuosos. Sin embargo, estudios he- chos con extractos acuosos de semilla de papaya mostraron un 18.6 % de eficacia sobre nematodos adultos (13).
El extracto etanólico de semilla de papaya (C. papaya) tiene efecto sobre huevos, inhibiendo su eclosión en un 92 %; en la técnica de explantes abomasales el extracto hidroalcohólico mostró efecto del 60 %, impidiendo la asociación de L3 al tejido abomasal.
Al proyecto PAPIIT/UNAM 28IN226217, Efecto antihelmíntico del extracto etanólico de Artemisiacina, semilla de papaya (Carica papaya) y taninos condensados sobre el nematodo hematófago Haemonchus contortus, por el financiamiento de este trabajo.
A la unidad de helmintos del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), CENID-PAVET.
Al CONACyT, por el apoyo económico al becario.
Tabla I
Tabla I. Tratamientos aplicados a huevos de H. contortus.
Tabla II
Tabla II. Tratamientos aplicados a las L3 de H. contortus desenvainadas.
Figura 1
Fig. 1. Inhibición de la eclosión de huevos de H. contortus expuestos a extracto etanólico y extracto hidroalcohólico de semilla de papaya (C. papaya). * Muestran diferencia estadísticamente significativa (p< 0.05) ME + EE.
Figura 2
Fig. 2. Evaluación de larvas asociadas y no asociadas al tejido abomasal, las L3 de H. contortus fueron expuestas a extracto etanólico y extracto hidroalcohólico de semilla de papaya (C. papaya). * Muestran diferencia estadísticamente significativa (p<0.05) ME + EE.
