Ensaio do linfonodo local murino (LLNA) na diferenciação entre a dermatite de contato alérgica e de contato irritante: um estudo da expressão de marcadores de superfície de linfócitos T

Local lymph node assay in the differentiation between allergic and irritant contact dermatitides: study of the expression of T lymphocyte surface markersB

As doenças ocupacionais da pele são uma preocupação de saúde pública. A cada ano cresce o número de produtos que se tornam parte do meio ambiente, aumentando assim, a capacidade destes agentes tóxicos de induzir eventos adversos. Além disso, em 2012, somente nos EUA, os custos anuais diretos e indiretos com doenças ocupacionais da pele superaram US$ 1 bilhão. O custo com tratamentos dermatológicos deverá atingir US$ 18,5 bilhões por ano até 2018¹.

O desenvolvimento de metodologias visando à predição e o controle de possíveis efeitos adversos de xenobióticos sobre o sistema imunológico é questão pertinente e um desafio importante para a vigilância sanitária. Dentre os efeitos adversos provocados por xenobióticos, as reações de hipersensibilidade são as mais prevalentes^2,3,4,5. A dermatite de contato (DC) é uma dermatose inflamatória induzida por agentes químicos. A DC pode ser dividida principalmente em dermatite de contato alérgica (DCA) e dermatite de contato irritante (DCI)⁶. A DCA é um tipo de DC causada por contatos repetidos na pele por pequenas moléculas reativas com peso molecular inferior a 500 Da, denominadas haptenos, provenientes de diversos tipos de agentes químicos, que são reconhecidas pelo sistema imune como antígenos não próprios⁷.

A DCA requer a ativação da imunidade inata e adaptativa e, segundo diversos autores, é principalmente mediada por células T^6,8. Fatores genéticos do indivíduo também estão envolvidos no desenrolar dessa doença⁹. A iniciação da dermatite de contato é gerada pela aplicação tópica de sensibilizantes na epiderme como, por exemplo: níquel, cromo, dinitrofluorbenzeno (DNFB) e oxazolina (OXA)^10,11. Sendo assim, o mecanismo imunopatológico da DCA ocorre no primeiro contato da pele com o sensibilizante, que por sua vez forma um complexo hapteno-proteína que pode ser reconhecido e capturado pelas células de Langherans. Essas células quando capturam esse complexo podem então migrar da epiderme para região paracortical dos linfonodos de drenagem. A apresentação desses peptídeos conjugados a haptenos ativam linfócitos T CD8 e T CD4 específicos^12,13,14. A reexposição do mesmo hapteno resulta na produção de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias pelas células da epiderme, recrutamento de linfócitos T de memória, ativação de células endoteliais e mastócios, e a infiltração de neutrófilos, todos necessários para este processo inflamatório^12,15,16. A etapa final do mecanismo imunológico da DCA corresponde ao término da reação inflamatória. Nessa fase, também são liberadas citocinas, como por exemplo: IL-10, que, ao contrário das que são liberadas nas fases anteriores, estaria mais relacionada com a inibição da reação imunológica^14,17.

A DCI, por sua vez, é caracterizada por uma inflamação da pele que ocorre após contato imediato com substâncias irritantes¹⁸. A resposta imunológica descrita para esta forma de dermatite envolve a imunidade inata. Mais especificamente, um aumento de citocinas pró-inflamatórias de células que compõem a epiderme e derme, como por exemplo: queratinócitos, células de Langerhans, que secretam diversas citocinas¹⁸, entre elas, TNF-α (Fator de necrose tumoral alfa), GM-CSF (fator estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos) e IL-1^13,19. No entanto, há controvérsias quanto à participação ou não do sistema imunológico adaptativo na questão da DCI. De fato, algumas substâncias classificadas como irritantes podem induzir proliferação de células da resposta adaptativa^20,21,22.

Por muito tempo, a DCI foi definida como uma reação não específica da pele na presença de uma substância irritante. No entanto, hoje, é aceito que o sistema imune desempenha um papel fundamental na iniciação da DCI. Na presença de irritantes podem acontecer alterações fisiopatológicas, como por exemplo: destruição da barreira epitelial, danos celulares e aumento de mediadores pró-inflamatórios^18,23,24. Um tipo celular muito importante na resposta imunológica desencadeada por substâncias irritantes são os queratinócitos. Eles liberam citocinas na destruição da barreira epitelial, expressam moléculas de histocompatibilidade de classe II, moléculas de adesão (CD54) e também moléculas coestimulatórias, como por exemplo: CD80 e CD40²⁵. A liberação de citocinas pelos queratinócitos estimula outros queratinócitos e outras células, como as células de Langerhans, e promove a atração de células inflamatórias, ampliando desse modo o processo inflamatório²⁶. As citocinas pró-inflamatórias, como por exemplo: IL-1α, IL-1β e TNF-α²⁷, IL-6, IL-2²⁶ e a quimiocina CCL21, produzidas por células endoteliais linfáticas foram encontradas aumentadas na DCI^28,29.

O estudo de subpopulações de linfócitos envolvidas na DCA e ou DCI tem se mostrado promissor. A fenotipagem de linfócitos como método eficaz para diferenciação da DCA e DCI vem sendo estudada. Dentre os estudos de subpopulações de linfócitos, há várias diretrizes propostas e poucas similaridades, o que dificulta a construção de um protocolo comum. Alguns autores demonstraram um aumento de células B, constatado via receptor B220 e CD19 em camundongos expostos a agentes dermosensibilzantes^30,31. Lee et al.³² confirmaram apenas parcialmente os resultados dos estudos anteriores, tendo estes autores observado um aumento seletivo no percentual de células B que apresentavam CD86 apenas na exposição a sensibilizantes, mas não obtendo resultados conclusivos sobre CD40³². Neves et al.³³ demonstraram um aumento do receptor de quimiocina CXCR4 e da molécula CD40 in vitro em células dendríticas quando tratadas com substâncias sensibilizantes, porém, quando eram tratadas com substâncias irritantes, a expressão dessas moléculas era regulada negativamente³³.

Há também inúmeras controvérsias no que concerne o estudo da subpopulação de línfócitos T. Em relação às subpopulações de células T CD4 (célula T auxiliar) e ou T CD8 (célula T citotóxica), não há consenso. Enquanto Goutet et al. analisaram e observaram diferenças na expressão da citocina IL-4 e seu receptor em células T CD4³⁴, Lee et al. analisaram apenas a percentagem de células T CD4 e CD8³². Já De Silva et al. analisaram a população de células T totais, utilizando para este fim CD3 e o receptor da citocina IL-2, o CD25 (que junto com CD4 também é o marcador de células T reguladoras)³⁵. Além disso, estudos in vitro com células dendríticas derivadas de medula óssea (BMDC) mostraram ser promissores para avaliar o potencial alérgico de produtos químicos. Battais et al. mostraram que a expressão de moléculas como, MHC II, CD86, CD54 e CD40 em BMDC podem diferenciar alérgenos de não alérgenos e classificar os produtos químicos de acordo com seu potencial alergênico³⁶. Porém é importante ressaltar que na literatura existem poucos artigos nessa área. Desta forma, é evidente que estudos deste tipo ainda são necessários para que os dados já publicados possam ser, não somente reproduzidos, mas também para adicionar conhecimentos fundamentais visando o alcance de um consenso.

Outro aspecto relevante considerando esse tipo de investigação é o uso de animais de laboratório. Embora Asherson e Barnes³⁷ tenham utilizado o camundongo como modelo para a predição da reação de hipersensibilidade, outros estudos foram realizados em cobaias e consequentemente os primeiros testes preditivos para reações de hipersensibilidade induzidas por xenobióticos foram desenvolvidos utilizando este animal. No decorrer dos anos, inúmeros ensaios foram propostos e suas aplicabilidades e limitações vêm sendo discutidas até os dias de hoje^{38,39,40,41,42}.

Os testes de Buehler⁴³ e Maximização⁴⁴ foram criados com o objetivo de identificar o potencial de substâncias causarem DCA^43,44. Embora tenham sido amplamente utilizados entre as décadas de 1970 e 1980, esses testes apresentavam em comum sérias limitações, tais como: (i.) subjetividade na interpretação dos resultados (por exemplo: avaliação da amplitude do edema local); (ii.) longa duração dos testes (todos realizados em duas fases, com duração total de 25 a 30 dias); (iii.) alto custo e uma demanda de mão de obra considerável; e (iv.) uso de um grande número de animais, que eram submetidos a um grau de estresse considerável^38,45. No final da década de 1980, surge o ensaio do Linfonodo Local Murino (LLNA, do inglês local lymph node assay), como uma alternativa promissora aos testes convencionais realizados em cobaias.

O LLNA foi primeiramente descrito por Kimber e Weisenberger⁴⁶, como uma alternativa aos testes de Buehler e de Maximização^47,48,49,50 e foi aceito para fins regulatórios em 2002⁵¹, pelo European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) e pela Interagency Coordanating Comitee for Validation of Alternative Methods (ICCVAM). Das vantagens deste teste em relação aos seus precursores, listam-se: (i.) o parâmetro final analisado é quantitativo (ou seja, a proliferação de linfócitos por incorporação de ³H-timidina); (ii.) o teste se passa na fase de sensibilização, e por isso tem uma curta duração (cinco dias); (iii.) características referentes a natureza da substância, tais como cor, não interferem com desfecho do teste; (iv.) o número de animais utilizados por substância-teste é cerca de 50% menor do que nos testes em cobaias e, por fim, (v.) os animais são poupados da dor e do sofrimento decorrentes das reações de fase 2 (fase inflamatória)^46,52.

No entanto, o protocolo do LLNA inicialmente aceito para fins regulatórios⁵¹ também apresentava limitações importantes, como por exemplo: a utilização de material radioativo e a presença de resultados falso positivos^{22,53,54,55,56}. Por isso, como processo de aprimoramento do ensaio, foram publicados em 2010, protocolos modificados do LLNA^57,58. Além disso, com o banimento definitivo do uso de animais pela indústria de cosméticos na Europa, em 2013⁵⁹, a busca por metodologias in vitro se tornou ainda mais urgente. Neste contexto, estratégias de predição, como IATA (do inglês, Integrated Approaches to Testing and Assessment) têm ganhado destaque mundial e a atenção de agências regulatórias⁶⁰. Muitos dos ensaios in vitro, que isoladamente não apresentam boa capacidade de predição, quando combinados em bateria de ensaios, apresentam-se como estratégias promissoras. Assim, muitas das estratégias e baterias de ensaios propostas pela comunidade científica têm sido alvo de estudos e avaliações sistemáticas por centros de validação de métodos alternativos, e algumas já ganharam aceitação regulatória, inclusive no campo da dermosensibilização^{57,58,60,61,62,63}.

Agências regulatórias e comunidade científica vêm buscando avançar na construção de consensos, e um deles diz respeito ao uso de novas abordagens para o enfrentamento dos desafios da Toxicologia do século XXI. Para muitos autores, a Toxicologia Regulatória deve lançar mão de abordagens modernas e inovadoras (tais como o uso de big data e modelos in silico, “omics”, high-throughput, entre outros) e aprofundar-se em estudos mecanísticos para melhor compreender os desfechos toxicológicos que se quer predizer^64,65,66. Foi neste contexto que o presente trabalho foi conduzido, com o objetivo de investigar o mecanismo da diferenciação entre a DCA e a DCI, através da fenotipagem de linfócitos, e buscar o aprofundamento no estudo das alterações fisiopatológicos envolvidas na execução do teste LLNA.

Um dos primeiros antígenos de superfície celular expresso pelas células T após a ativação é o CD69. Uma vez expresso nas células, o CD69 atua como uma molécula de coestimulação para a proliferação de células T⁷¹. O CD25 é a cadeia α do receptor IL-2 e expresso em células T e B ativadas. Neste estudo, quando analisamos os linfócitos T em relação aos marcadores de ativação CD25 e CD69, observamos um aumento no número absoluto das células CD4 expressando esses dois marcadores de ativação. Este aumento das células CD4+CD25+ ocorreu nos linfonodos de animais tratados com as substâncias dermosensibilizantes DNCB e PPD e não nas substâncias irritantes testadas. Para a subpopulação de células CD4+CD69+ esse aumento foi visto em animais tratados com a substância PPD e com a substância irritante o LSS. Os dados descritos aqui para as substâncias sensibilizantes estão de acordo com Homey et al.⁷². Estes autores observaram que o tratamento tópico com o dermosensibilizante oxazolina provocou um aumento de células expressando os marcadores de ativação CD25 e CD69, quando comparado com o seu controle. Esse aumento foi maior em células CD4+ em relação às células CD8+. Os mesmos autores, ao analisarem substância irritante (óleo de cróton), não observaram um aumento significativo quando comparado com o controle⁷². Em um estudo mais recente, Strauss et al.⁷³ testaram a imunofenotipagem de linfócitos no LLNA comparando diversas substâncias sensibilizantes e irritantes. Nesse estudo, os autores avaliaram marcadores de superfície pan para células B e para células TCD4 e TCD8. Além disso, avaliaram a expressão de CD69 e MHC-II (I-A^k) dentro das subpopulações de linfócitos. Os autores não encontram diferenças no número de células apresentando esses perfis, quando compararam as células de animais tratados com substâncias sensibilizantes ou irritantes. Esses resultados corroboram os achados aqui relatados. Todavia, tendo visto diferença significativa na subpopulação CD4+CD25+ – que não foram referidas no artigo de Strauss et al. – percebemos que ainda há forte possibilidade de encontrarmos na imunofenotipagem um desfecho seguro⁷³. Além disso, outro artigo⁷⁴ que utilizou o Ensaio do Linfonodo Popliteal (também utilizado na avaliação de imunosensibilizantes) indicou dentre outras, a molécula CD25 como um possível marcador para determinação da ativação de células T por substâncias imunosensibilizantes.

Em relação ao marcador BrdU nessas subpopulações, não encontramos diferenças significativas nos linfonodos de animais tratados com LSS e TX-100. Porém, os resultados indicam um aumento de células CD4+CD69+BrdU+ e CD4+CD25+BrdU+ em animais tratados com a substância LSS em relação ao controle etanol. Embora a grande maioria dos irritantes seja negativa para esse tipo de teste, na literatura científica encontramos artigos que mostram que alguns irritantes induzem acúmulo e proliferação celular, assim como os sensibilizantes^2,55,75,76. Jung et al. indicaram um aumento da incorporação de BrdU após tratamento com LSS⁷⁵. No entanto, no que diz respeito aos animais tratados com as substâncias sensibilizantes, observamos um aumento BrdU+ nas células CD4+CD69+ para animais tratados com DNCB, CD4+CD25+ para animais tratados com DNCB e PPD.

Além disso, analisamos possíveis alterações histológicas nas orelhas dos animais para diferenciação da dermatite alérgica e irritante. Nossos dados não mostraram diferenças entre o tratamento com substâncias irritantes e dermosensibilizantes. Lee et al.⁷⁷ observaram um aumento proliferativo com o marcador BrdU nas células da epiderme, em animais tratados com DNCB, TDI, HCA e LSS quando comparados com seus controles. Dubois et al.⁷⁸ analisaram a contribuição das células TCD4 e TCD8 na dermatite de contato alérgica primária, ou seja, indivíduos que podem desenvolver uma dermatite de contato com uma única aplicação de um sensibilizante forte. Usando anticorpos monoclonais, os animais tiveram as células TCD4 e TCD8 depletadas e foram tratados com o dermosensibilizante severo DNFB. Os animais que tiveram as células TCD4 depletadas apresentaram um maior edema da derme e uma significativa infiltração celular, quando comparados com animais normais tratados com DNFB. Em contraste, os animais sem as células TCD8 não exibiram nenhuma alteração patológica.

Bonneville et al.¹³ mostraram que a resposta a DCA é mais severa em camundongos da cepa C57Bl/6 do que em camundongos da cepa BALB/c. Os camundongos das duas cepas foram tratados com DNFB, e a espessura das orelhas foi avaliada, camundongos da cepa C57BL/6 após 3 h do tratamento demonstravam um edema maior que os camundongos BALB/c. Da mesma forma, a análise histológica demonstrou que após 6 h do tratamento os camundongos C57Bl/6, revelaram um infiltrado celular na derme e um edema maior dos que os animais BALB/c¹³. Jung et al. mostraram um aumento de peso das orelhas que foram tratadas com LSS e PPD 1%, em relação aos controles e analisando o aspecto histológico encontraram hiperplasia da epiderme e infiltrado inflamatório⁷⁵. Da mesma forma, Ku et al.⁷⁰ mostraram com outros agentes dermosensibilizantes (DNCB e OXA) e o irritante óleo de cróton, que essas substâncias induzem hiperplasia da epiderme e infiltrado inflamatório. Nossos resultados estão de acordo com os achados de Jung et al.⁷⁵ e Bonneville et al.¹³, tendo sido encontradas as mesmas alterações patológicas, hiperplasia e infiltrado, tanto para as substâncias dermosensibilizantes quanto para irritantes.

Os resultados obtidos mostram diferenças tanto na fenotipagem quanto na proliferação de linfócitos T em animais tratados com as substâncias dermosensibilizantes DNCB e PPD, quando comparados ao grupo controle A/OO e aos animais tratados com as substâncias irritantes LSS e TX-100. Esses dados são relevantes e podem ser úteis na construção de possíveis estratégias preditivas e protocolos de ensaios para diferenciação entre a DCA e a DCI. Por outro lado, a análise histopatológica de animais tratados topicamente com substâncias dermosensibilizantes e irritantes não parece contribuir de forma significativa para a diferenciação entre agentes dermosensibilizantes e irritantes.