Utilizaram-se amostras de INF-α_2b de um produtor nacional, adquiridas pela Secretaria de Ciência, Tecnologia e Insumos Estratégicos do Ministério da Saúde, para o Programa Nacional de Controle de Hepatites Virais. Foram analisados lotes de formulação com potência de 10 x 10⁶ UI/mL/frasco.

Todas as soluções neste estudo foram preparadas com água ultrapura usando o sistema Milli-Q^® (Millipore). Os reagentes foram fornecidos pela Sigma, GE, Bio-Rad e Merck, dentre outros. Os reagentes específicos a determinadas técnicas foram relacionados conforme descrição dos procedimentos. O padrão de INF-α_2b Lote nº 3 utilizado foi fornecido pela Farmacopeia Europeia.

A CLAE-FR foi utilizada para separar o INF-α_2b da SAH e dos demais componentes da formulação. O experimento foi realizado no cromatógrafo líquido de alta eficiência LC-10 (Shimadzu), equipado com sistema controlador SCL-10A_vp, bomba LC-10 AD_vp, válvula seletora de solvente Shimadzu FCV-10AL, auto injetor SIL-10AD_vp, resfriador de amostra, coletor de frações FRC-10A, e detector UV/VIS SPD 10A. A coluna utilizada foi ACE 3 C18-300 (250 mm x 4,6 mm), mantida em temperatura ambiente. A fase móvel A consistiu de ácido trifluoroacético 0,1% (TFA 0.1%) em água, fase móvel B de acetonitrila (ACN): TFA 0,1%, com gradiente descrito na FE¹⁹ ; fluxo de 1,0 mL/min e comprimento de onda de detecção 214 nm. Os dados foram processados utilizando Class – VP 6.13 SP2. O volume de injeção foi de 100 µL.

A solução de tripsina (Promega V5228A) foi preparada dissolvendo 100 μg em 100 μl de ácido acético 50 mM (solução estoque 1,0 μg/μL). Desta solução estoque, foram tomados 14 μl e diluídos em 1 ml de bicarbonato de amônio (NH₄HCO₃) 50 mM, para o preparo de uma solução de trabalho de tripsina. Foi preparado um branco, com o tampão e demais reagentes e um padrão de INF-α_2b na concentração de 7 µg/mL em tampão NH₄HCO₃ pH 8,4. Esta concentração é a esperada para a amostra. As frações coletadas da CLAE-FR foram liofilizadas, e, posteriormente, adicionados 100 µL de tampão NH₄HCO₃ pH 8,4, homogeneizados em vórtex, acrescidos de 10 µL da solução de trabalho de tripsina. As amostras permaneceram em Thermomixer®, com agitação a 37°C por 18 h. Na segunda etapa de digestão foram adicionados aos tubos mais 10 μl da solução de trabalho de tripsina, com período de 4 horas em Thermomixer®, com agitação e temperatura de 37°C. A seguir amostra, padrão e branco foram submetidos ao procedimento de digestão^{20 , 21} .

Os tubos com os peptídeos foram guardados a -20°C para posterior análise por espectrometria de massa.

Para a identificação das amostras coletadas na CLAE-FR, foi utilizada a técnica Peptide Mass Fingerprint (PMF), com a espectrometria de massa Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI-TOF)²² .

A matriz utilizada no preparo das amostras foi ácido a-ciano-p-hidroxicinâmico (ACHC). Foi preparada uma solução saturada dessa matriz em água, ACN (1:2) e TFA (0,2%). Essa solução foi misturada com solução dos peptídeos em partes iguais, de modo a ter a relação de 1.000 a 10.000 vezes mais moléculas de matriz que moléculas de peptídeo. À alíquota de 5 µL da amostra previamente submetida à digestão, adicionou-se 5 µL da matriz. Aplicou-se 0,5 µL dessa mistura em um porta-amostras, que, após a secagem, se cristalizou²² .

Para a aquisição dos espectros, o espectrômetro foi operado no modo refletido, com detecção para íons positivos. A calibração do equipamento foi feita com kit de peptídeos padrões da Brucker Daltonics. Os espectros foram processados no programa XACQ 4.0²³ .

Esse experimento foi realizado no mesmo cromatógrafo utilizado na CLAE-FR. As condições específicas foram: a coluna Superdex® 75 GL (GE Healthcare) com a fase móvel tampão, PB 50 mM pH 7,0, NaCl 150 mM, 5% propanol, fluxo: 0,4 mL/min, comprimento de onda de 214 nm, volume de 100 µL. A fração correspondente ao INF-α_2b foi coletada manualmente e concentrada em Speed-Vac®^{24 , 25} .

A determinação quantitativa de proteínas foi usada para acompanhar o teor nas frações coletadas dos métodos cromatográficos, que foi determinada pelo método de Bradford, utilizando o protocolo para determinação em microplacas²⁶ .

O SDS-PAGE foi usado para avaliar a homogeneidade proteica das frações coletadas dos procedimentos utilizando CLAE-FG e FR. Alíquotas de 10 mL das frações coletadas de CLAE-FG, adicionadas de 10 mL de solução de β-mercaptoetanol, foram aplicadas em gel concentrador de 5% e gel de acrilamida 15%, segundo Laemmli²⁷ , e colocadas no sistema de eletroforese Mini-Protean III (Bio-Rad), nas condições de corrida previstas em protocolo do fabricante. A coloração pela prata foi aplicada para evidenciar as bandas do INF-α_2b²⁸ . Os géis obtidos foram digitalizados no densitômetro GS-800 Bio-Rad, com o auxílio do programa Quantity One (Bio-Rad). As massas moleculares de cada banda foram estimados comparativamente a padrões de baixa massa moleculares.

Procedimento com membrana de imunoafinidade foi empregado para diminuir a quantidade de SAH para facilitar a separação cromatográfica do INF-α_2b da SAH. Foi seguido o protocolo do fabricante²⁹ .

A metodologia de espectroscopia de dicroísmo circular foi utilizada para avaliar a estrutura secundária do INF-α_2b a partir da purificação por imunoafinidade/gel filtração³⁰ . As frações coletadas de CLAE-FG, concentradas em Speed-Vac ®, foram submetidas ao procedimento de diálise, utilizando membrana de cut off 10 kDa, contra tampão fosfato 10 mM, pH 7.4³¹ . Um padrão de INF-α2a da FE foi diluído com o tampão fosfato 10 mM, pH 7,4, de maneira a obter concentração semelhante à da fração coletada. Os espectros foram obtidos no espectrômetro Jasco em células de quartzo de 1 cm.

A espectroscopia de fluorescência foi utilizada para avaliar a estrutura terciária das frações coletadas de CLAE-FG. Estas frações coletadas foram concentradas em Speed-Vac®, submetidas ao procedimento de diálise, utilizando membrana de cut off 10 kDa, contra tampão fosfato 10 mM, pH 7.4. Os espectros foram obtidos pelo espectrofluorímetro Shimadzu RF-5301 PC, em células de quartzo de 1,0 cm de caminho ótico, utilizando comprimentos de onda para excitação de 280 nm e 295 nm, com tamanho da fenda de 5,0 nm. A emissão foi lida de 200 nm até 400 nm. A leitura do tampão fosfato foi subtraída como branco³² .

A CLAE-FR é uma técnica bastante utilizada na separação de proteínas, devido a sua elevada resolução. Nesse estudo foi possível separar o INF-α_2b da SAH com uma boa resolução (7,3), conforme mostrado na Figura 1(a) , do perfil cromatográfico obtido da formulação de INF-α_2b. O pico cromatográfico referente à SAH, presente em excesso na amostra, apresentou tempo de retenção de 58,1 min. O segundo pico, identificado como INF-α_2b, apresenta tempo de retenção de 66,8 min, o que foi confirmado pela injeção do padrão da FE conforme mostrado na Figura 1(b) . A CLAE-FR se mostrou eficiente para a separação INF-α_2b/SAH. A hidrofobicidade do INF-α_2b é superior à da SAH, como pode ser constatado nos cromatogramas da Figura 1(a) e (b) , o que facilitou bastante a separação.

Figura 1
(a) Cromatograma da formulação de INF-α2b; (b) Cromatograma do padrão de INF-α2b FE. Experimentos realizados nas mesmas condições: 100 µL de solução, 35 µg/100 µL, coluna ACE 3 C18-300, 250 mm C x 4,6 mm diâmetro, fase móvel A: TFA 0.1% em água, fase móvel B: acetonitrila: TFA 0.1%, com gradiente, fluxo de 1.0 mL/min, λ 214 nm. A linha sobreposta mostra a concentração de fase B; (c) Análise de SDS-PAGE das frações coletadas da CLAE-FR em (a): (1) padrão de peso molecular; linhas (2), (3), e (4) frações coletadas de CLAE-FR, com tempo de retenção de 66 min.

A homogeneidade proteica do pico de 66,8 min foi avaliada por SDS-PAGE das frações coletadas da CLAE-FR, apresentada na Figura 1(c) . Foi observada uma banda com 19 kDa, que corresponde ao peso molecular do INF-α_2b. Além disso, há existência de bandas de pesos moleculares maiores do que o INF-α_2b, com 57 kDa. Na literatura, essas bandas são relacionadas a trímeros do INF-α_2b^{33 , 34} . Esse resultado comprovou que o INF-α_2b se apresentava numa pureza adequada à caracterização por espectroscopia de massa.

Inicialmente, para estabelecer a metodologia, foram usados padrões de INF-α_2b da FE e de SAH (Sigma) hidrolisados pela tripsina. Apesar dos picos coletados na CLAE-FR apresentarem pureza adequada, um padrão de SAH também foi preparado para EM (resultados não apresentados). O objetivo desse experimento foi determinar se havia uma contaminação por SAH que não tivesse sido detectada no SDS-PAGE.

Na Tabela são dadas as sequências esperadas de aminoácidos dos peptídeos dessa digestão e as correspondentes massas monoisotópicas [M + H]⁺, as teóricas e as observadas, de cada peptídeo, tanto para o padrão da FE quanto para a fração coletada de CLAE-FR.

Tabela
Sequências esperadas de aminoácidos dos peptídeos para a hidrólise tríptica de INF-α2b e as correspondentes massas monoisotópicas [M + H]+. A coluna das massas experimentais se refere aos valores observados nos espectros do padrão de INF-α2b da FE e da fração coletada.

1N: Número do peptídeo; 2[M + H]⁺Teórica (MH⁺): obtida submetendo-se a sequência do INF-α_2b à ferramenta PeptideMass ( www.expasy.org ); 3Ir: intensidade relativa; 4 P: padrão FE; 5 FC: Massa observada na hidrólise da fração coletada; 6n.o: não observado.

Nessas condições, a cobertura de sequência observada para o padrão de INF-α_2b foi de 72,7%. Foram observados peptídeos correspondentes a 120 do total de 165 aminoácidos no INF-α_2b. Considerando que, devido à especificidade hidrolítica da tripsina, com a formação de aminoácidos livres e di/tripeptídeos que não são detectáveis nessas condições, o total de aminoácidos que poderíamos detectar com esse método é de 154, uma cobertura de 78% foi atingida, que é uma cobertura bastante elevada²⁰ .

Observações importantes podem ser feitas a partir dos resultados do padrão da FE. De acordo com a Tabela , os peptídeos 3 e 5 têm características em suas sequências que são correlacionadas ao aumento da ionização³⁵ . Ambos têm arginina no C terminal, sendo que o peptídeo 3 tem também histidina no N terminal. É importante destacar que o peptídeo 5 é o que apresenta o sinal mais intenso em espectros de massa já publicados do INF-α_2b^{20 , 36} .

Por outro lado, os peptídeos menos intensos têm características em suas sequências que reduzem a ionização³⁵ . Quanto ao C terminal, o peptídeo 6 tem lisina, o peptídeo 7 tem arginina, além de cisteína no N terminal. Ambos possuem aspartatos como resíduos internos, sendo que 6 tem também um triptofano.

As pontes dissulfeto, ligações importantes para a estabilidade da estrutura tridimensional de proteínas, apresentam-se de forma correta, de acordo com os resultados. Outro ponto que foi observado nos espectros das amostras foi a conservação da ponte dissulfeto entre as cisteínas 29 e 138 ([M + H]⁺ 2117,5), demonstrando que essa característica importante da estrutura do INF-α_2b está preservada no produto comercial analisado após as manipulações nos procedimentos realizados. Foi observado um pico intenso com MH⁺ de 2116,9. Esse valor corresponde à associação, via ponte dissulfeto, dos peptídeos 8 e 10. Como não foi utilizado redutor na preparação da amostra, parte da ponte de sulfeto se manteve e parte foi reduzida, formando os peptídeos 8 e 10.

Um pico intenso, com [M + H]⁺ igual a 2225,9, foi observado (peptídeo 3). Esse valor corresponde à massa de um peptídeo onde não ocorre hidrólise pela tripsina na sequência KDR. A perda desse sítio de hidrólise pela tripsina já foi observada anteriormente na análise do INF-α_2b²⁰ .

Houve uma coincidência dos peptídeos não observados com resultados preliminares da literatura, para a análise de INF-_α2b matéria-prima²⁰ e em análise do padrão da FE³⁶ .

A próxima etapa foi a análise do INF-α_2b presente nas formulações. O material coletado na CLAE-FR foi então submetido à hidrólise por tripsina e os peptídeos resultantes foram analisados por EM.

Os peptídeos 2, 6 e 12, menos intensos no espectro padrão, não foram observados nos espectros das amostras. Da mesma forma, o peptídeo 7 não foi observado nas amostras.

A cobertura de sequência atingida com essa análise para as amostras das formulações farmacêuticas foi de 34,5%, sendo identificados 57 aminoácidos em um total de 165. Partindo-se da possibilidade de detecção de 154 aminoácidos, chegou-se a 37% de cobertura de sequência²⁰ .

Os peptídeos mais intensos observados no padrão, 3, 4, 5, 8, 9 e 10 também foram observados na amostra preparada a partir da hidrólise da coleta da fase reversa. A cobertura de sequência alcançada com a 45,5%, sendo identificados 75 aminoácidos em 165. Partindo da possibilidade de detecção de 154 aminoácidos, chegaríamos a 48,7% de cobertura.

Outro ponto que foi observado nos espectros das amostras foi a conservação da ponte dissulfeto entre as cisteínas 29 e 138 ([M + H]⁺ 2117,5), demonstrando que essa característica importante da estrutura do INF-α_2b está preservada no produto comercial analisado após as manipulações nos procedimentos realizados.

Para que pudéssemos avaliar a estrutura molecular do INF-α_2b foi necessário desenvolver um método de separação SAH/INF-α_2b não desnaturante. A CLAE-FR é considerada uma técnica desnaturante, com pH ácido e alta concentração de solvente orgânico, que muda a estrutura tridimensional durante a análise³⁷ . A técnica inicialmente testada para a separação foi a CLAE-FG. Esse tipo de cromatografia demonstrou ser adequada, devido à diferença de volume hidrodinâmico entre o INF e a SAH, que, em princípio, possibilitaria a separação. Além disso, a análise se dá em condições pouco desnaturantes, com baixa concentração de solvente orgânico e pH próximo à neutralidade, o que minimiza a possibilidade de degradação do biofármaco durante o processo. O material coletado estaria nas condições adequadas para os experimentos de dicroísmo circular e fluorescência³³ .

A CLAE-FG é um método amplamente usado para análise de agregados em proteínas, sendo que vários parâmetros, como a coluna cromatográfica, concentração salina da fase móvel, uso de surfactante e modificadores orgânicos, podem ser otimizados para melhorar a separação^{38 , 39} . Vários parâmetros foram testados para obter uma melhor separação do INF-α_2b da SAH, (resultados não mostrados). A melhor condição foi alcançada a partir da adição de 5% de n-propanol à fase móvel, com a função de diminuir as interações hidrofóbicas da formulação com a matriz que compõe a fase estacionária^{38 , 39} .

Nessas condições foi observada a maior diferença de tempo de retenção obtido até então entre o pico de SAH, presente em excesso, e o pico do INF- α_2b, sendo em torno de seis minutos, conforme pode ser visto na Figura 2(a) . Por esse motivo o segundo pico foi coletado, concentrado e analisado por SDS-PAGE, para avaliar a homogeneidade proteica.

Figura 2
(a) Cromatograma da formulação de INF-α2b obtido. Condições: coluna Superdex® 75 HR 10/30, 30 cm C x 10,0 mm diâmetro, fase móvel: tampão, PB 50 mM pH 7,0, NaCl 150 mM, 5% propanol, fluxo: 0,4 mL/min, λ 214 nm. (b) Análise por SDS-PAGE de frações coletadas, oriundas dos três sistemas testados, (1) Fração de 28 min, fase móvel: tampão, PB 50 mM pH 7,0, NaCl 150 mM, nPrOH 5%, (2) Fração de 28 min, fase móvel: tampão, PB 50 mM pH 7,0, NaCl 150 mM, (3) fase móvel: tampão, PB 50 mM pH 7,0, (4) formulação, (5) padrão marcador de peso molecular.

O resultado do SDS-PAGE é mostrado na Figura 2(b) . As frações coletadas apresentaram bandas correspondentes às massas moleculares da SAH e do INF- α_2b, demonstrando que a separação efetivamente não foi completa.

Apesar da separação obtida na CLAE-FG, o resultado do SDS-PAGE da fração correspondente ao INF-α_2b ainda apresentou contaminação por SAH. A dificuldade de melhorar a separação entre as duas proteínas poderia estar associada à pequena resolução atingida pela CLAE-FG e pela grande diferença de concentração entre ambas. Por isso optou-se por um processo que reduz a concentração de SAH nas amostras. Com menos SAH, a saturação dos sítios da coluna seria menor e a separação provavelmente melhor.

A submissão da formulação ao procedimento de imunoafinidade foi acompanhada por SDS-PAGE, conforme mostrado na Figura 3 . Pode-se observar que o tratamento com a resina reduziu bastante a presença de SAH nas amostras, porém não eliminou completamente essa proteína. Provavelmente o grande excesso molar da SAH saturou completamente a resina, sendo que parte dessa proteína foi eluída junto com o INF-α_2b.

Figura 3
(a) Análise de SDS-PAGE de frações da formulação de INF-α2b (1) padrão de massa molecular; (2) Formulação submetida à imunoafinidade (3) Fração correspondente ao pico de 28 min coletada de coluna Superdex 75 (4) Fração da coleta de coluna Superdex 75, a partir da injeção da amostra obtida por imunoafinidade; (b) Perfil cromatográfico da fração coletada da membrana de imunoafinidade, e padrão de INF FE (vermelho), condições: coluna Superdex® 75 HR 10/30, 30 cm C x 10,0 mm diâmetro, fase móvel: tampão, PB, 50 mM, NaCl 150 mM, 5% propanol pH 6,9, fluxo: 0,4 mL/min, detector UV λ1 214 nm.

A partir desse resultado, foi feita a combinação dos procedimentos de imunoafinidade e CLAE-FG, o que possibilitou a obtenção do INF-α_2b puro a partir das formulações. As amostras preparadas dessa forma apresentaram homogeneidade proteica por SDS-PAGE, como pode ser visto na Figura 3(a) .

O efeito farmacológico de biofármacos depende da integridade de sua estrutura molecular. A degradação física, como perda da estrutura secundária e terciária, compromete a capacidade de ligação do INF-α_2b ao receptor, comprometendo o seu efeito^{15 , 16 , 17} . Portanto, se fez necessária a avaliação dessa integridade, sendo que as técnicas de dicroísmo circular e fluorescência podem ser empregadas para esse fim⁴⁰ .

As frações coletadas do esquema de purificação imunoafinidade/gel filtração foram então analisadas por dicroísmo circular, sendo os resultados mostrados na Figura 4 . O perfil do padrão foi semelhante ao descrito por outros autores para o INF-α_2b em pH 7,4^{31 , 32 , 41} . Aparecem bandas em 209 nm (-12,81) e 219,4 nm (-11,56), com intensidade menor. Esse perfil é característico de proteínas que apresentam alfa hélices³⁰ , como é o caso do INF-α_2b⁴¹ .

Figura 4
Espectros de dicroísmo circular do padrão de INF-α2a da FE (7 µg/mL) em vermelho, e da fração coletada da Imunoafinidade/CLAE-FG (8 µg/mL) em azul. Amostras em tampão PB 10 mM, pH 7,4.

A fração coletada mostrou um perfil distinto do padrão. A intensidade do desvio da luz diminuiu, houve um desvio das bandas negativas para comprimentos de onda maiores, respectivamente 209,8 nm e 225,6 nm. Além disso, houve uma inversão da intensidade das bandas, sendo que a segunda banda (-11,11) foi mais intensa que a primeira (-7,87) ( Figura 4 ).

Esses resultados indicam que há uma perda de estrutura secundária do INF-α_2b presente nas formulações. Para complementar esses dados, as amostras também foram avaliadas por fluorescência.

Inicialmente, os espectros da fração coletada e do padrão da FE foram comparados, conforme a Figura 5 . O padrão apresentou um espectro com máximos de emissão em 336 nm (λ_ex 280 nm) e 333 nm (λ_ex 295 nm). As frações coletadas apresentaram máximos de emissão em 338 nm (λ_ex 280 nm) e 334 nm (λ_ex 295 nm). Esses resultados demonstraram que o INF-α_2b presente nas formulações tem uma exposição das cadeias laterais maior que o padrão da FE, indicando a possibilidade de desnaturação da estrutura terciária³¹ .

Figura 5
(a) Perfil de fluorescência do padrão de INF-α2b da FE (traço pontilhado) e da fração coletada da CLAE-FG (traço normal). Excitação em 280 nm. (b) Perfil de fluorescência do padrão de INF-α2b da FE (traço pontilhado) e da fração coletada da CLAE-FG (traço normal). Excitação em 295 nm. Amostras em tampão PB 10 mM, pH 7,4.

Outra informação importante que os espectros de fluorescência fornecem é a medida da intensidade da luz no λ_ex. Essa medida é proporcional ao espalhamento de luz, fenômeno que ocorre devido à presença de agregados em solução. O padrão teve uma intensidade de 674,8 (λ_ex 280 nm) e 280,6 (λ_ex 295 nm). Nos dois comprimentos as frações coletadas apresentaram uma intensidade de 1015,6 que está na faixa de saturação do detector do fluorímetro. Esse resultado demonstra que a agregação das amostras é elevada, o que não é observado no padrão.

Os resultados da avaliação da estrutura tridimensional demonstraram que nas amostras houve desnaturação dessa estrutura.

De acordo com estudos apresentados por Qian³⁷ , a complexidade da estrutura proteica e as várias vias de agregação e degradação podem ser induzidas por alguns fatores. O presente estudo constatou a degradação física causada provavelmente pelos procedimentos usados para obtenção do INF-α_2b purificado, tais como mudança de temperatura, aumento da concentração de sal na composição do tampão e as várias etapas necessárias para obter volume suficiente para análise^{16 , 38} .

* E-mail: sinea.mendes@incqs.fiocruz.br