La ruta de señalización de MAPK Pmk1p y el mantenimiento de la integridad celular del Schizosaccharomyces Pombe

The signaling pathway of MAPK Pmk1p and the maintenance of cellular integrity of the Schizosaccharomyces Pombe

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La levadura Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) fue descrita por primera vez en 1883 por P. Lindner. El nombre genérico hace referencia a su semejanza con la levadura Saccharomyces cerevisae (S. cerevisiae), mientras que el epíteto específico designaba el nombre local de la cerveza elaborada con esta levadura. En los últimos 25 años, ese microorganismo se ha convertido en un organismo atractivo para el estudio de multitud de procesos biológicos sobre todo los que conciernen a la maquinaria de crecimiento y división celular. ^(1,2) El mismo resulta fácil de manipular en el laboratorio, no es patógeno, presenta ciclos de vida y sexual de corta duración, además de ser susceptible de análisis genético clásico y molecular debido a la secuenciación de su genoma. ⁽³⁾

S. pombe pertenece a los ascomicetos al igual que S. cerevisiae; sin embargo, los estudios de comparación de las secuencias de proteínas ortólogas de diversos grupos de hongos sugieren que el primero divergió de la línea troncal de los ascomicetos hace 1.144 millones de años. ^(4,5) Esa característica evolutiva se refleja en los ciclos de vida y la regulación del ciclo celular en ambos microorganismos.

S. pombe resulta ideal para la realización de estudios de morfogénesis y polaridad, ya que su forma, tamaño y su ciclo de división celular son extremadamente reproducibles en el labora-torio, además se pueden obtener mutantes con morfologías aberrantes sin pérdida de la viabilidad. ⁽⁶⁾

Alrededor del S. pombe se describen tres cascadas de MAPKs hasta el momento: 1) de respuesta feromonas, con Spk1p como MAP kinasa;⁽⁷⁾ 2) de respuesta a estrés en la que Sty1p/Spc1p es la MAPK ⁽⁸⁾ y 3) de mantenimiento de la integridad celular liderada por Pmk1p/Spm1p (MAPK).

En relación con S. cerevisiae, la ruta de señalización más importante que controla el ensamblaje de la pared es la ruta PKC. ^(9,10) Esta lleva un módulo “sensor” o “módulo de detección” que activa a Rho1p y que a su vez activa a Pkc1p y el módulo de MAP kinasas. La detección es llevada a cabo por proteínas de la familia Wsc (Wsc1p, Wsc2p y Wsc3p) y el par Mid2-Mtl1p y cada grupo parece responder a distintos estímulos. Por ejemplo, Wsc1p es importante para sobrevivir al estrés térmico y un mutante wsc1 presenta un defecto en la activación por “heatshock” de Mpk1p (la MAP Kinasa de la ruta). ^(11,12)

La ruta de integridad o ruta PKC en S. cerevisiae regula la biosíntesis de la pared celular durante los periodos de crecimiento polarizado como la gemación, la formación de la proyección sexual y la conjugación, además de ser necesaria para responder al estrés. Las señales se inician en la membrana plasmática a través de los “sensores” de superficie (Wsc1p, Mid2p.…etc) que junto a los GEFs estimulan el intercambio de nucleótido de Rho1p y lo

activan. Rho1p activa a sus efectores que incluyen a Pkc1p y la cascada de MAP kinasas, la β-GS, las forminas y alguno de los componentes del exocisto.

También existe la llamada “ruta de integridad” en S. pombe, la que está integrada por un módulo de tres MAP Kinasas liderado por Pmk1p que es la MAP kinasa. Sin embargo, apenas se conoce su participación en la biosíntesis de la pared celular o en otros procesos; así como, los “sensores” que transmiten la señal de daños en la pared u otros tipos de estrés al módulo de MAP kinasas. Entre los reguladores positivos de la cascada está Rgf1p (GEF de Rho1p), la GTPasa Rho2p y Pck2p el homólogo de Pkc1p en S. cerevisiae.

La cascada de señalización de mantenimiento de la integridad celular en S. pombe está constituida por tres kinasas Mkh1p, Pek1p/Shk1p y Pmk1p/Spm1p (Figura 1). ^{(13,14,15,16,17,18)} (Figura 1).

Figura 1. Ruta de integridad en Schyzosaccharomyces pombe

Cuando en la célula se producen daños en la pared u otros tipos de estrés como estrés osmótico, etc), una señal es probablemente transmitida a un sensor de superficie que activa a Rgf1p/Rho1p, a Rho2p y/o a otra molécula todavía no identificada. Esta señal activa a Pck2p, que a su vez activa a Mkh1p y con ello al módulo de MAPK Mkh1p-Pek1p-Pmk1p. Se desconoce la activación transcripcional que desencadena en el núcleo la fosforilación de Pmk1p. Las fosfatasas Pmp1p, Pyp1p, Pyp2p y Ptc1p son necesarias para inactivar a Pmk1p, una vez transmitida la señal.

La eliminación de cualquiera de estas kinasas provoca alteraciones morfológicas y células multitabicadas en condiciones de estrés (37ºC, 1M KCl), hipersensibilidad a β–glucanasa y a Caspofungina y defectos en fusión vacuolar.^(19,20,15) Todos esos defectos sugieren una función en homeostasis iónica y en la biosíntesis de la pared celular, aunque también podría participar en otros procesos todavía no determinados de manera clara.

Mkh1 (Mek Kinase Homolog 1) es la MAPKKK que en su estado activo fosforila a Pek1p.⁽¹⁵⁾

Pek1p (pombe mEK1), también denominada Skh1p, es la MAPKK y se comporta como un interruptor molecular actuando como un potente regulador negativo de Pmk1p cuando está desfosforilada, de tal manera que la ruta carece de actividad basal, y como activador de Pmk1p, cuando Pmk1p está fosforilada.⁽¹⁶⁾ Este mecanismo contribuye a que en S. pombe exista una respuesta de todo nada en esta vía de MAPKs, diferenciándose de lo que ocurre en S. cerevisiae donde la ruta está siempre activa.⁽²¹⁾

Pmk1p (S. pombe MAP Kinase 1), también denominada Spm1p, es la MAPK de la ruta de integridad. Pmk1p es fosforilada por Pek1p en los residuos Thr186 y Tyr188(13,16) y desfosforilada e inactivada por la fosfatasa Pmp1p (S. pombe MAP kinase phosphatase 1).⁽²²⁾ Sin embargo, aún no se sabe cómo se transmite la señal desde Pmk1p hacia un “desconocido factor de transcripción”. Las tres kinasas se localizan en la zona del septo. Mkh1p y Pek1p se localizan en el citoplasma y solo Pmk1p se localiza a la vez en el citoplasma y en el núcleo, pero su localización no cambia en condiciones de estrés.⁽²³⁾

Se ha descrito que el factor de transcripción Atf1p es fosforilado por Pmk1p en condiciones de daño en la pared.⁽²⁴⁾ Estos autores proponen que las rutas de respuesta a estrés y la de integridad celular convergen en el factor de transcripción Atf1p, para activar la expresión de determinados genes que reparen los daños producidos en la pared celular. Sin embargo, no se conocen genes relacionados con la biosíntesis de la pared celular cuya expresión dependa de Atf1p.⁽²⁵⁾

Pmk1p se induce por múltiples condiciones de estrés: estrés hiper o hipoosmótico, ausencia de glucosa, daño en la pared celular, alta temperatura y estrés oxidativo.⁽²³⁾ En todos los casos, la activación de Pmk1p depende completamente de Mkh1p y de Pek1p, sin embargo, no todos los tipos de estrés activan a la cascada a través de Rho2p y de Pck2p. Un ejemplo es la activación de la ruta por estrés oxidativo que es totalmente independiente de Rho2p y de Pck2p.⁽²⁶⁾ La mayoría de los activadores de la cascada se han aislado porque las cepas mutantes de los componentes de esta ruta son capaces de antagonizar los efectos de la eliminación de la calcineurina en la homeostasis iónica. La eliminación de la subunidad catalítica de la calcineurina, Ppb1p o la inhibición de su actividad mediante inmunosupresores (como FK506), produce hipersensibilidad a Cl-, mientras que la inactivación simultánea de alguno de los miembros de esta ruta de MAPK suprime este fenotipo.

Basándose en esta interacción se ha descrito el fenotipo vic (Viable in the presence of Immunosuppressant and Chlorine ion), y se ha visto que todos los mutantes nulos de los componentes de la cascada de integridad presentan este fenotipo, es decir son viables en presencia del inmunosupresor FK506 y altas concentraciones de MgCl2. ^(16,22)

Para buscar nuevos componentes de la ruta se realizó un “screening” de mutantes de fenotipo vic. Primero se identificó una cepa mutada en el gen cpp1+ que codifica la subunidad de la farnesiltransferasa encargada de catalizar la prenilación de las GTPasas Rho2p y Rho3p y esto condujo a la identificación de Rho2p como un nuevo miembro de la ruta de MAPK, ya que los mutantes rho2 también presentan el fenotipo vic.⁽¹⁴⁾ La sobreexpresión de rho2+ deja de ser letal cuando se elimina Mkh1p, Pek1p o Pmk1p de la célula, y lo mismo ocurre al sobre expresar pck2+, lo cual sitúa a Rho2p y a Pck2p por encima del módulo de MAPK de la ruta de integridad celular. Además, la sobreexpresión de rho2+ o pck2+ incrementa en gran medida los niveles de fosforilación de Pmk1p.⁽¹⁴⁾

También se ha descrito a Rgf1p como uno de los reguladores de la cascada. Los mutantes rgf1 muestran el fenotipo vic y son incapaces de crecer a altas concentraciones de KCl, ambos fenotipos característicos de los mutantes de la cascada. Rgf1p es necesario para la fosforilación de la MAPK Pmk1p en respuesta a estrés osmótico y a estrés producido por daños en la pared y actúa por encima de Rho2p y de Pck2p.⁽²⁰⁾

El trabajo que se presenta se realizó con el propósito de caracterizar nuevos reguladores que actúen por encima de la ruta Rho1p/Pck1p/Pck2p y el mantenimiento de la integridad celular en Schizosaccharomyces pombe en relación con la ruta de señalización de MAPK Pmk1p.

Figura 1.
Ruta de integridad en Schyzosaccharomyces pombe

En el proceso investigativo que se presenta, el organismo mayoritariamente utilizado fue la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe; aunque, también se emplearon diferentes estirpes de Escherichia coli para los trabajos de clonación molecular. Se usaron diversas técnicas de clonación molecular, métodos genéticos, técnicas de microscopía, Western Blot y determinación de la actividad de Pmk1p bajo condiciones de estrés y análisis informático de las secuencias de ADN y proteínas.

Ensayo de determinación de la actividad de pmk1p bajo condiciones de estrés

A una temperatura de 28oC, se incubaron las células en medio rico YES o medio mínimo suplementado con los correspondientes aminoácidos, así como en ausencia o presencia de tiamina. Cuando las células alcanzaron una densidad óptica de 0.5 comenzó el tratamiento de estrés con NaCl 0.5M durante 30’, KCl 0.6M durante 15’, Caspofungina 1μg/ml durante 1 hora, H2O2 6mM durante 15’ y Cafeína 15mM durante 2 horas, respectivamente. También se determinó la actividad de Pmk1p a las 22 horas de sobreexpresión de los genes mtl2+ y wsc1+ en la cepa silvestre.

Primeramente, en todos los casos se recogieron las células mediante filtración de 30 ml de cultivo, para luego extraer las células de los filtros en tubos de microcentrífuga fríos, a los que previamente se le ha añadido 1ml de PBS 1X frío. Los precipitados resultantes se congelaron en hielo seco, para después descongelar todas las muestras obtenidas y resuspenderlas en 200μl de buffer de lisis de Pmk1 (50mM TrisHCl pH=8, 150mM NaCl, 10% Glicerol, NP-40 0.1%) con inhibidores de proteasas (2μ/ml aprotinina, 2μ/ml leupeptina y 1mM PMSF) incorporados.

Las células se lisaron con bolitas de vidrio (G8772, Sigma) en una Fast-Prep FP120 (Bio 101 Savant) durante dos pulsos de 16 segundos a una potencia de 6,0. Se comprobó la rotura celular por observación al microscopio de contraste de fases. Las bolitas de vidrio, paredes y restos celulares se retiraron mediante centrifugación a 13.000rpm durante 10’. Todo el proceso se realizó a 4oC para evitar la degradación de las proteínas.

La concentración de proteína de los extractos obtenidos se cuantificó por el método colorimétrico descrito. Pmk1-HA6H se purificó utilizando 60µl de bolas de Níquel Ni2+NTA Agarose (Qiagen) al 50% junto con 800µg de cada extracto celular obtenido e incubando las distintas muestras durante dos horas en agitación a 4.

Posteriormente, Pmk1p unida a las bolas de níquel se sedimentó por centrifugación y se lavó tres veces con 1ml de TrisHCL pH=8. Finalmente, esos complejos proteicos se resuspendieron en 15µl de tampón de carga 2X para proceder a la electroforesis en geles de 10% de poliacrilamida y posterior análisis por Western blot. El estado activo de Pmk1p se detectó utilizando anticuerpos policlonales antifosfo-p44/42 (Cell Signalling) a una dilución de 1:2500 y la cantidad total de Pmk1p purificada mediante anticuerpos monoclonales anti-HA, 12CA5 (Boehringer) a una dilución de 1:5000.

Todos los componentes conocidos de la cascada de integridad mostraron el fenotipo vic (viable in the presence of immunosuppressant and choride ion); por lo que resultan viables en presencia del inmunosupresor FK506 y altas concentraciones de MgCl2 (16Sugiura et al., 1999; 22Sugiura et al., 1998). En S. pombe los mutantes de Calcineurina no crecen en presencia de MgCl2, mientras que una mutación adicional en los miembros de la ruta de MAPK suprime este fenotipo. En medio con FK506 + MgCl2, la inhibición de la Calcineurina es llevada a cabo por FK506 y en consecuencia la cepa silvestre no puede crecer en presencia de iones cloro, sin embargo, los mutantes que tienen seleccionado alguno de los componentes de la ruta, complementan la hipersensibilidad a cloro y crecen en estas condiciones.

Los mutantes mtl2∆ y wsc1∆ no presentan el fenotipo vic (Figura 2)

Sin embargo, ni pck2+ ni pmk1+ suprimen el fenotipo de hipersensibilidad a Caspofungina del mutante mtl2∆ y no hemos realizado los experimentos para saber que ocurre con el mutante wsc1∆. También hemos visto que los mutantes dobles entre uno de los “sensores” junto con mutaciones en alguno de los componentes de la ruta, crecen normalmente, lo que también podría significar que no colaboran en ninguna función esencial en relación con la integridad celular o que colaboran en la misma función no esencial.

Figura 2.
Los mutantes mtl2∆ y wsc1∆ no presentan el fenotipo vic

Células silvestres rgf1∆, pmk1∆, mtl2∆ y wsc1∆ fueron sembradas en placas de YES y de YES + FK506 (0,5 mg/ml) + MgCl2 (0,2M) (paneles superiores). Se realizaron diluciones seriadas (con 8x104, 4x104, 2x104, 2x103, 2x102 y 2x101 cels/ml) y se sembraron aproximadamente 3ml de cada una de estas diluciones. Las mismas cepas fueron sembradas en placas de YES + FK506 (0,5 mg/ml) y YES + MgCl2 (0,2M) por separado (paneles inferiores). Las placas fueron incubadas a 28ºC durante 3 días.

Mtl2p y Wsc1p no son componentes “autenticos” de la cascada de integridad

La cepa wsc1∆ no es sensible a 0,75 mg/ml de caspofungina, al contrario del mutante rho2∆; sin embargo, al subir la concentración de caspofungina a 1,5 µg/ml (Figura 3), es cuando la cepa wsc1∆ es incluso más sensible a caspofungina que la deleción de Rho2p, sugiriendo en principio que el mecanismo que provoca este defecto podría ser diferente en ambos casos. En cuanto a los mutantes dobles, son sensibles a las mismas concentraciones que el mutante simple rho2∆, y además presentan el fenotipo vic como el mutante rho2∆.

La relación entre Mtl2p y Rho2p es diferente, los mutantes individuales rho2∆ y mtl2∆ presentan distinto grado de sensibilidad a caspofungina, siendo más sensible la cepa mtl2∆ que la cepa rho2∆. Las cepas mtl2∆ rho2∆ se comportan como la cepa mtl2∆ con respecto al crecimiento en placas de caspofungina y son más sensibles que la cepa rho2∆. Estos datos y el hecho de que ambos mutantes no presenten el fenotipo vic, indicarían que ni Mtl2p ni Wsc1p son componentes “autenticos” de la cascada de integridad.

Figura 3.
Relación entre Mtl2p y Wsc1p con Rho2p

Ensayo de sensibilidad a caspofungina de la cepa silvestre, los mutantes rho2∆, wsc1∆ y los dobles mutantes rho2∆wsc1∆. Se hicieron diluciones seriadas de cada cepa (8x104, 4x104, 2x104, 2x103, 2x102 y 2x101 cels/ml) y se sembraron aproximadamente 3ml de cada dilución en placas de medio rico (YES) y YES suplementado con caspofungina (0,75mg/m, 1,5 mg/ml y 2,5mg/m). B- Las mismas cepas se sembraron en placas de YES y de YES + FK506 (0,5 mg/ml) + MgCl2 (0,2M). Las placas se incubaron 3 días a 28oC.

La activación de Pmk1p en respuesta a estrés osmótico o a estrés por daños en la pared, no depende de Mtl2p ni de Wsc1p

Analizamos el nivel de fosforilación de Pmk1p sometida a diferentes tipos de estrés en la cepa silvestre y en los mutantes nulos mtl2∆ y wsc1∆. Se ha descrito que la activación de Pmk1p es inducida por numerosos tipos de estrés, incluyendo condiciones híper e hipotónicas, presencia de compuestos que dañan la pared celular, calor, ausencia de glucosa y estrés oxidativo.⁽²³⁾ La actividad catalítica de la MAPK Pmk1p depende de la fosforilación de dos residuos, Thr-186 y Tyr-188, que puede ser detectada por “Western blot” utilizando un anticuerpo antifosfo-p42/44.^(13,18)

La proteína Pmk1p se purificó mediante bolas de Ni2+ que presentan afinidad por las 6His y posteriormente se analizó la fracción de Pmk1p fosforilada mediante SDS-PAGE y “Western blot”, utilizando anticuerpos policlonales antifosfo-p44/42 que detectan el estado activo de Pmk1p. Los niveles totales de Pmk1p se detectaron a partir de los extractos celulares, mediante SDS-PAGE y “Western blot” utilizando anticuerpos anti-HA (12CA5).

No se observó diferencias significativas en la fosforilación de Pmk1p entre las células silvestres y los mutantes nulos mtl2∆y wsc1∆ (Figura 4). No se apreciaron cambios ni en la actividad basal, ni cuando las células se sometieron a estrés osmótico con KCl o NaCl. Pero quizás el dato más concluyente de los mencionados hasta ahora es que la activación de Pmk1p que se produce en respuesta a estrés osmótico o a estrés producido por daños en la pared, no depende de Mtl2p ni de Wsc1p. No observamos diferencias significativas en la fosforilación de Pmk1p entre las células silvestres y los mutantes nulos mtl2∆ y wsc1∆, ni cuando las células se someten a estrés osmótico (con KCl o NaCl), ni en presencia de Caspofungina. Tampoco observamos diferencias entre los mutantes mtl2∆y wsc1∆ la cepa silvestre, analizado otros tipos de estrés, como estrés oxidativo, heatshock o ayuno de glucosa.

Figura 4.
Activación de la cascada de integridad por estrés con NaCl, KCl y Caspofungina

Activación de Pmk1p inducida por estrés osmótico y daño en la pared celular en los mutantes nulos mtl2∆y wsc1∆. Células de las cepas pmk1+-HA6His (MI200), mtl2∆ pmk1+-HA6His y wsc1∆pmk1+-HA6His creciendo en fase exponencial en medio rico se trataron con NaCl 0,5M durante 30 minutos (A), KCl 0,6M 15 minutos (B) y caspofungina (1mg/ml) durante 60 minutos (C). Pmk1-HA6His se purificó por cromatografía de afinidad. La fracción de Pmk1p activada y la total se determinaron por SDS-PAGE y “Western blot”, revelando con anticuerpos antifosfo-p42/44 (panel superior) o anti-HA (panel inferior).

La sobreexpresión de wsc1+ aumenta los niveles de fosforilación de Pmk1p a través del módulo de MAP Kinasas

Sin embargo, se observó que la sobreexpresión de wsc1+ aumenta claramente los niveles de fosforilación de Pmk1p (Figura 5), comparado con la cepa que sobreexpresa mtl2+ o con la cepa que lleva el plásmido vacío. Este aumento depende del módulo de MAP kinasas ya que no se produce en el mutante mhk1∆ y depende solo parcialmente de Rgf1p. La sobreexpresión de Wsc1p aumenta los niveles de Rho1p y también aumenta la cantidad de pared celular, lo que es un estrés para la célula y podría actuar activando la cascada indirectamente. Aun así y puesto que los “sensores” comparten una función esencial en lo que respecta a la integridad celular, podríamos pensar que solo la ausencia de los dos a la vez debería tener un efecto en la transmisión de la señal.

Figura 5.
La sobreexpresión de wsc1+ aumenta claramente los niveles de fosforilación de Pmk1p a través del módulo de MAPKinasas

La sobreexpresión de Wsc1p activa a Pmk1p y esta activación se produce a través de mkh1+. En la parte izquierda se muestra Pmk1p obtenida a partir de células de la cepa silvestre pmk1+-HA6His transformada con los plásmidos pREP41X (vacío) y pREP3X-wsc1+ y pREP3X-mtl2+, desreprimidas en MM sin tiamina durante 22 horas. En la parte derecha, las células de la cepa mkh1∆ pmk1+-HA6His y rgf1∆ pmk1+-HA6His fueron transformadas con los plásmidos pREP41X vacío y pREP3X-wsc1+. La cantidad de Pmk1p fue analizada por el procedimiento descrito anteriormente, revelando con anticuerpos antifosfo-p42/44 (arriba) o anti-HA (abajo).

En resumen, aunque en S. cerevisiae la cascada lleva el módulo de “sensores” o módulo de detección que activa a Rho1p y este a su vez activa a PKC1 y el módulo de MAP kinasas, en S. pombe el comportamiento no resulta similar.

Los “sensoses” “Mtl2p y Wsc1p” activan o señalizan hacia Rho1p. Los datos indican que Mtl2p y Wsc1p no resultan componentes “auténticos” de la cascada, sin que se demuestre claramente que Rho1p lo sea.

Los mutantes mtl2∆ y wsc1∆ no presentan el fenotipo vic (viable en presencia de inmunosupresor y de iones cloruro), característico de los mutantes en los componentes de la cascada.

Mtl2p y Wsc1p no desempeñan un papel importante en la señalización en respuesta a estrés osmótico y daño en la pared celular a través de la ruta de integridad celular de Pmk1p.

Conflicto de intereses: Los autores declaran que no existen

Declaración de contribución: Ambos autores participaron en el proceso investigativo y la confección del artículo.