Para la formulación de galletas, todos los ingredientes básicos se compraron en supermercados especializados y certificados. La lecitina de soja de grado alimentario se obtuvo de Manuel Riesgo S.A. (España). El maltitol fue proporcionado por Helm Iberica S.A. La stevia, con un 3% de glucósidos de esteviol, se adquirió en un supermercado local. Los FOS en formato polvo (ORAFTI®P95) fueron una donación de Beneo-Orafti.

Como fuente de fibra antioxidante de café se emplearon MC procedentes del proceso industrial de obtención del café soluble o instantáneo. Los granos de café utilizados para su elaboración fueron de especie Robusta. La materia prima fue proporcionada por Prosol S.A (España) y almacenada -20 °C hasta su uso.

Se elaboraron un total de seis nuevas formulaciones de galletas sin azúcares (B1, B2, B3, B4, B5, B6) y una galleta siguiendo la formulación tradicional y utilizando como edulcorante sacarosa que se empleó como control (A). Las formulaciones de los siete alimentos se indican en la Tabla 1. Las galletas se prepararon empleando como ingredientes básicos harina de trigo y aceite de girasol. No se incluyó huevo en las formulaciones y el azúcar se sustituyó por stevia y/o maltitol como edulcorantes hipocalóricos en las formulaciones B1-B6. Los MC se añadieron como fuente insoluble de fibra antioxidante y los FOS para mejorar la tolerancia a la glucosa, aportar fibra soluble, favorecer la salud intestinal (prebiótico) y mejorar la textura y el sabor de los nuevos alimentos con elevado contenido de fibra antioxidante de café y stevia.

La masa se preparó mezclando inicialmente sal, levadura, FOS y edulcorantes, y sobre esta mezcla seca se añadió agua mineral a temperatura ambiente, hasta conseguir una mezcla homogénea. La lecitina y el aceite de girasol se mezclaron aparte y posteriormente se añadieron a la mezcla acuosa. Finalmente, la harina junto con la fibra antioxidante de café se fue añadiendo gradualmente a la mezcla y se trabajó hasta obtener una masa homogénea, elástica y ligeramente pegajosa. La masa se dejó reposar durante 30 min y transcurrido este tiempo se moldeó en forma de galletas con guías de grosor 3-5 mm y moldes de 6,5 mm de diámetro. La superficie de las galletas se pinchó para evitar la formación de burbujas durante el horneado a 185 °C durante 16 min.

Dos tipos de galletas comerciales con alta adhesión a la marca por parte de los consumidores españoles (C1 y C2) se adquirieron en un supermercado local. C1 y C2 presentaban en su formulación maltitol e isomaltitol como edulcorantes y fibra dietética en un contenido del 3,6% y 8,3%, respectivamente.

Las galletas elaboradas según las nuevas formulaciones (B1, B2, B3, B4, B5, B6) y las comerciales (C1, C2) se sometieron a un test sensorial hedónico. La evaluación sensorial se realizó con la participación de 26 catadores no entrenados. Se evaluó el nivel de aceptación global de las galletas teniendo en cuenta el color, la textura y el sabor, empleando una escala hedónica verbal de 7 puntos (1- me disgusta mucho y 7-me gusta mucho). La media de la puntuación dada a cada formulación de galletas se determinó. La nueva formulación de galleta con un grado de aceptación equivalente a las comerciales se seleccionó para estudiar su efecto en la liberación de las hormonas GLP-1 y serotonina.

Previo al estudio del efecto de liberación de hormonas in vitro, se llevó a cabo una digestión abiótica oral, gástrica e intestinal, según el procedimiento descrito por Hollebeeck et al. (2013), con ligeras modificaciones. Los digeridos obtenidos se centrifugaron y fueron separados en dos fracciones, sobrenadante y precipitado. Sobre la fracción bioaccesible (sobrenadante) se realizó la última etapa, eliminación de las sales biliares, con el fin de imitar la reabsorción de las mismas que tiene lugar en el intestino durante el proceso de digestión humano (Edwards y Slater, 2009). Los digeridos desalinizados se congelaron a -80 °C y posteriormente fueron liofilizados. Los ensayos se realizaron por triplicado.

Células epiteliales tumorales de colon humano, Caco-2, se cultivaron en Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero fetal bovino (10%), L-glutamina (2%) y penicilina/estreptomicina (1%) a 37 °C y 5% de CO_2. Las células se crecieron en placas de 12 pocillos hasta alcanzar confluencia aproximadamente tres días después. La diferenciación celular se obtuvo transcurridos 21 días con cambio de medio cada dos-tres días. Las células Caco-2 ya diferenciadas se emplearon para el estudio de liberación de la hormona serotonina.

Células epiteliales cancerosas de duodeno humano, HuTu-80, se cultivaron en Medio Esencial Mínimo (MEM) suplementado con suero fetal bovino (10%), L-glutamina (2%) y penicilina/estreptomicina (1%) a 37 °C y 5% CO.. Las células se crecieron en placas de 24 pocillos hasta alcanzar confluencia en un día transcurrido. Las células HuTu-80 no se diferenciaron y 24 horas después de sembrarse estaban preparadas para utilizarse en los ensayos de liberación de la hormona GLP-1.

Ambas líneas celulares se subcultivaron tres-cuatro veces tras su descongelación antes de usarse, con el fin de recobrar el ratio normal de crecimiento.

Las fracciones solubles recuperadas de los digeridos de la galleta tradicional (A), galleta elaborada según la nueva formulación (B2) y fibra antioxidante de café (I3) —que contienen los componentes bioaccesibles para su absorción y metabolismo— y stevia se emplearon para estimular la secreción de hormonas causantes de saciedad en los modelos celulares descritos en los párrafos anteriores, siguiendo la metodología que se describe a continuación.

Las células Caco-2 se suplementaron con las fracciones bioaccesibles (150 µl) en tres concentraciones diferentes (0,5, 0,05, 0,01 mg/ml), por duplicado. Previamente, se llevó a cabo un lavado de las células con tampón fosfato salino (PBS). La estimulación de las células se realizó por 5 minutos con agitación orbital. Los sobrenadantes se retiraron y guardaron en congelación hasta posterior cuantificación de serotonina. Se incluyó como control positivo cinamaldehído 5mM, y como control negativo tampón. La cuantificación de la hormona serotonina liberada por las Caco-2 fue realizada siguiendo las indicaciones del kit de ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) de alta sensibilidad (cat-nº EA630/96, de DLD Diagnostika GmbH). Tres subcultivos diferentes se emplearon en cada set de análisis, que se realizaron por sextuplicado (n =3x6=18). Los resultados se expresaron como % frente al control T/C [%].

Las células HuTu-80 se sometieron a un período de ayuno de 1 h con medio libre de suero, glucosa y glutamina, y estimulación con las fracciones bioaccesibles (300 µl) a 0,5, 0,05, 0,01 mg/ml, glutamina 40 mM (control positivo) y tampón (control negativo) durante 1 h 30 min a 37 °C. El experimento se llevó a cabo por duplicado. Tras el periodo de estimulación se colectaron los sobrenadantes y se conservaron en congelación hasta su posterior análisis. La cuantificación de GLP-1 se realizó mediante ELISA sándwich siguiendo las instrucciones del kit (Cat-nº EZGLP1T-36K de EMD Millipore). Tres subcultivos diferentes se emplearon en cada set de análisis, que se realizaron por sextuplicado (n =3x6=18). Los resultados se expresaron como % frente al control T/C [%].

Los análisis estadísticos se realizaron mediante el empleo de SigmaPlot 11.0 (Systat Software Inc., California, USA). Los resultados se expresaron como la media ± desviación estándar (SD) para todos los análisis, excepto aquellos relativos al cultivo celular, los cuales se representaron como la media ± error estándar de la media (SEM). Los datos se analizaron mediante análisis de varianza (ANOVA) de una vía y las diferencias entre medias mediante el Test de Holm-Sidak a un nivel de significación de α=0,05.

Como se muestra en la Figura 2, las formulaciones de galletas preparadas con stevia (B2), stevia y maltitol (B4) y maltitol (B6), que contienen en todos los casos fibra antioxidante de café y FOS en su formulación, obtuvieron puntuaciones significativamente mayores (p<0,05) que las respectivas galletas sin FOS (B1, B3 y B5). Los compuestos bioactivos, cafeína y glucósidos de esteviol, presentes en el café y la stevia, respectivamente, aportan un sabor amargo que persiste en boca (Hellfritsch, et al., 2012), pudiendo afectar negativamente la calidad sensorial del alimento. El retrogusto de los esteviósidos en particular es muy persistente, lo que limita su uso a determinadas concentraciones en muchos alimentos. Los FOS presentan un ligero dulzor que mejora significativamente (p<0,05) la calidad sensorial de los alimentos elaborados incluyendo en su formulación stevia y fibra antioxidante de café (B2, B4 y B6) como ingredientes. La incorporación de FOS en las galletas tiene un impacto positivo en la calidad nutricional del alimento. A los FOS se le atribuyen carácter prebiótico (Kumar, et al., 2012), efecto fibra (Sartori da Silva, et al., 2007) y capacidad de reducir la respuesta glicémica postprandial (EFSA, 2014). Por tanto, los FOS son un ingrediente esencial de la formulación de las nuevas galletas, dado que su incorporación solventa simultáneamente problemas de calidad sensorial y mejora el valor nutricional del alimento. Su adición podría tener impacto no solo en el sabor sino también en la textura del producto final (Ishwarya y Prabhasankar, 2013).

El grado de aceptación global de las galletas que contienen FOS en su formulación (B2, B4 y B6) y las comerciales (C1 y C2), con alta adhesión del consumidor y similares características nutricionales en lo que se refiere al uso de edulcorantes hipocalóricos y el contenido de fibra incorporado, no difirió significativamente (p>0,05) (Figura 2). A las galletas B2, B4, B6 y C2 se les puede atribuir la alegación nutricional “alto contenido de fibra”, de acuerdo con lo establecido en el Reglamento (CE) 1924/2006 del Parlamento Europeo (Unión Europea, 2006).

Los resultados del estudio indican que la combinación de los ingredientes fibra antioxidante de café, stevia y FOS resulta adecuada para la obtención de un snack saludable y destaca el interés de los FOS como ingrediente funcional, tanto desde el punto de vista tecnológico como nutricional. Teniendo en cuenta los resultados del análisis sensorial, se seleccionó la galleta B2, que contiene en su formulación fibra antioxidante de café, stevia y FOS, para realizar los estudios posteriores de liberación de hormonas (serotonina y GLP-1) implicadas en procesos de saciedad y tolerancia a la glucosa postprandial.

Figura 2.

Diagrama de tela de araña con las puntuaciones medias (n=26) de la escala de 7 puntos para la aceptación global de las galletas comerciales (C1 y C2) y de las galletas reformuladas (B1, B2, B3, B4, B5 y B6) cuya composición se indica en Tabla 1. Letras diferentes denotan diferencias significativas en la calidad sensorial de los alimentos objeto de estudio (p < 0,05).

Los compuestos bioaccesibles que se recuperaron tras la digestión oral gastrointestinal in vitro de la galleta con alto contenido en fibra y sin edulcorante calórico (B2) en una concentración de 0,5 mg/ml estimularon la secreción de la hormona serotonina en las células Caco-2 diferenciadas (Tabla 2). Los niveles de serotonina en las células tratadas con el nuevo alimento (354,7 ± 42,7%) fueron cuatro veces más elevados que los detectados en las muestras correspondientes a las células control (100%). No se observaron diferencias significativas (p>0,05) entre los niveles de secreción de serotonina detectados en células tratadas con los compuestos bioaccesibles de las galletas elaboradas según la nueva formulación y la tradicional, en la que se emplea sacarosa como edulcorante (A).

Los compuestos bioaccesibles que se liberaron durante el proceso de digestión de la fibra antioxidante de café en una concentración de 0,5 mg/ml (MC, I3) indujeron un incremento significativo de la secreción de serotonina (p<0,05) en las células Caco-2 diferenciadas. Los valores de serotonina inducida por el nuevo ingrediente alimentario (762,9 ± 81,4%) fueron siete veces superiores que el basal. En nuestro conocimiento, esta es la primera vez que se describe el efecto de los compuestos bioaccesibles tras la digestión oral gastrointestinal de fibra antioxidante de café sobre hormonas de saciedad. Estos resultados están en concordancia con los descritos en la literatura para el café. Estudios previos asocian al consumo de café una mejora de secreción de serotonina por las células enteroendócrinas gastrointestinales (Bakuradze, et al., 2014). Por otra parte, a los extractos de café, en concreto a los ácidos gálico y cafeico, se les atribuye potencial para incrementar la biodisponibilidad de triptófano necesario para la síntesis de serotonina mediante la inhibición de la enzima indolamina 2,3-dioxigenasa implicada en el metabolismo del triptófano (Gostner, et al., 2015). Los resultados sugieren que la inclusión de una dosis controlada de fibra antioxidante de café en la formulación del alimento podría favorecer la sensación de plenitud postprandial.

El edulcorante natural hipocalórico stevia (I4) mostró ser inefectivo en la estimulación de la producción de serotonina en las células Caco-2 diferenciadas a las concentraciones ensayadas. En un estudio de intervención llevado a cabo por Anton et al. (2010) se halló que la ingesta de stevia provocó niveles de saciedad similares a la ingesta de sacarosa. No se han encontrado más trabajos en la literatura científica en relación al efecto de la stevia pura en la secreción de esta hormona. En consecuencia, se requieren más estudios para elucidar el papel de este edulcorante hipocalórico y sus metabolitos en la secreción de serotonina. Estos resultados y los descritos en el párrafo anterior indican claramente la necesidad de realizar estudios de intervención nutricional en humanos para conocer el grado de saciedad que causa el nuevo alimento desarrollado en esta investigación. Sin embargo, los resultados sugieren un potencial efecto saciante que podría ser igual o superior al que se logra tras la ingesta de galletas preparadas según la formulación tradicional, empleando sacarosa como edulcorante.

La mayor parte de la serotonina liberada por el organismo se encuentra en las células enterocromafines del tracto gastrointestinal, que responden a los estímulos mecánicos y químicos mediante liberación de la hormona tras la ingesta de alimento (Voigt y Fink, 2015). Por tanto, es esperable que la fibra antioxidante del café, que se utiliza como ingrediente alimentario en este trabajo, pueda ejercer un mayor efecto saciante in vivo que el que aquí se describe. En esta investigación solo se ha evaluado el efecto de aquellos compuestos que quedan bioaccesibles tras su digestión gastrointestinal. No se tiene en cuenta el efecto físico de estimulación hormonal del material indigestible que podría también jugar un papel relevante en la secreción de serotonina.

El análisis de la composición nutricional de los digeridos de galletas obtenidos (datos no mostrados) sugieren la presencia de otros compuestos que pueden estimular la secreción de serotonina, tales como azúcares. El consumo de alimentos con elevado índice glicémico (Herrera, et al., 2011; Zelkas, et al., 2015) se ha asociado a un incremento de producción de serotonina por las vesículas intestinales celulares. Los péptidos que se liberan durante el proceso de digestión del gluten que compone la harina de trigo pueden estimular principalmente la liberación de serotonina hipotalámica y cortical (Choi, et al., 2009, 2011). Por otra parte, los compuestos fenólicos presentes en la fibra dietética antioxidante podrían desempeñar un papel fundamental en la supresión del apetito también, mediante la estimulación de esta importante hormona de señalización (Huang, et al., 2013; Liu, et al., 2015). Estudios previos indican que los productos avanzados de la reacción de Maillard tales como el Nε-carboximetil-lisina están involucrados en el proceso de regulación de saciedad por medio de la liberación de serotonina en células SH-SY5Y (Holik, et al., 2013). La reacción de Maillard es el evento químico más importante que tiene lugar durante el procesado térmico de alimentos como las galletas (Tamanna y Mahmood, 2015). Por tanto, en el caso de las galletas elaboradas empleando sacarosa como edulcorante estos productos podrían contribuir a la estimulación de la liberación de esta hormona. Sin embargo, la sustitución de sacarosa por stevia limita el progreso de la reacción de Maillard en el alimento hacia las etapas avanzadas, afectando aspectos sensoriales del alimento como el desarrollo de color (Garcia-Serna, et al., 2014). En consecuencia, puede que estos productos no contribuyan de manera significativa a lograr un efecto saciante postprandial en el alimento elaborado según la nueva formulación (B2). Se requiere de más estudios para identificar los componentes alimentarios individuales que contribuyen a la liberación de la hormona tanto en el alimento elaborado siguiendo la formulación tradicional como en la propuesta en este trabajo.

Se observó una secreción de GLP-1 significativa (p<0,05) por estimulación de las células HuTu-80 con la fracción bioaccesible de los alimentos digeridos (Tabla 2). La cantidad de hormona GLP-1 liberada en comparación con las células control no tratadas se incrementó significativamente (p<0,05) tras la incubación con las fracciones bioaccesibles (0,5 mg/ ml) de la galleta con alto contenido en fibra y sin azúcares añadidos (B2) (277,9 ± 14,1%). No se detectaron diferencias (p>0,05) entre la galleta control (A) y la elaborada con la nueva formulación (B2). La mínima concentración testada (0,01 mg/ml) del digerido de fibra antioxidante de café (I3) presentó valores similares de GLP-1 (p>0,05) (269,89± 17,3%) a aquellos encontrados en las galletas elaboradas con la nueva formulación (B2, 0,05 mg/ml). Es la primera vez que se describe el efecto estimulador de la secreción de GLP-1 para la fibra antioxidante de café obtenida a partir de MC generados durante el proceso de la elaboración industrial de café instantáneo. Estos resultados concuerdan con los descritos para café en células, animales (Fujii, et al., 2015) y humanas (Jokura, et al., 2015).

En algunos casos asocian la estimulación de la producción de GLP-1 del café al compuesto fenólico mayoritario de la bebida, ácido clorogénico (McCarty, 2005; Rafferty, et al., 2011). El análisis del digerido de la fibra antioxidante de café procedente de los MC (datos no mostrados) indicó gran contribución de los compuestos fenólicos sobre la capacidad antioxidante, por lo que previsiblemente el ácido clorogénico estaría presente. La stevia (I4) resultó inefectiva a las tres concentraciones ensayadas, lo que apoya los resultados obtenidos en modelo in vivo animal por Fujita et al. (2009).

Tabla 2.

Liberación de serotonina y GLP-1, [%] frente al control (células no tratadas, 100%) por estimulación de células Caco-2 y HuTu-80 con las fracciones bioaccesibles de los digeridos de galleta control a base de sacarosa (A), de galleta con stevia, fibra antioxidante de café y FOS (B2), fibra antioxidante de café (I3) y stevia pura (I4), en concentraciones de 0,5, 0,05 y 0,01 mg/ml. Los resultados se expresan como la media $\textcolor{red}{}\pm$ SEM (n=3 sub-cultivos x 6 réplicas de cada uno = 18). Las letras diferentes indican la existencia de diferencias significativas entre los valores de todas las muestras analizadas para cada hormona en particular (ANOVA de una vía (p < 0,05)).

La fracción bioaccesible obtenida por digestión de la nueva galleta (B2) posiblemente contiene fibra soluble (FOS). Son varios los investigadores que han descrito la existencia de una relación entre estos hidratos de carbono y la secreción de la hormona GLP-1 (Delzenne, et al., 2007; Grover, et al., 2011; Habib, et al., 2011; Li, et al., 2012), destacando el potencial de estos compuestos para promover la secreción endógena de GLP-1 y conseguir así posible prevención y/o tratamiento de la obesidad y la diabetes tipo 2. La presencia de proteínas y péptidos en los digeridos analizados también exhibir estimulación de la hormona GLP-1, confirmado ya por otros autores previamente, quienes reportaron que proteínas de trigo intactas y digeridas conseguían influir fuertemente sobre la saciedad y el efecto anti-diabético a través de la estimulación de GLP-1 (Geraedts, et al., 2010, 2011).

Asimismo, el aceite de girasol empleado en las formulaciones de galletas ha demostrado tener efecto sobre la producción de GLP-1 intestinal en ensayos clínicos (Frost, et al., 2003; Manning, et al., 2013), lo que podría estar contribuyendo también al contenido total de GLP-1 liberado por células HuTu-80 tras el tratamiento con la galleta con alto contenido en fibra y sin azúcares (B2).