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Introducción

Las coníferas son un grupo de árboles y arbustos de gran importancia económica y ecológica, ya que son los componentes dominantes de diversos tipos de vegetación. En México, se encuentran presentes 10 de los 71 géneros del grupo, con 94 especies, de las cuales, 43 son clasificadas como endémicas. Su distribución nacional ocurre desde el nivel del mar hasta los 4000 m s.n.m. Dentro de las coníferas, el género Pinus destaca con 49 especies (Gernandt y Pérez-de la Rosa, 2014).

Las especies del género Pinus han disminuido en número de poblaciones, por lo que, algunas de ellas se encuentran amenazadas o bajo protección. Esto es resultado de la tala indiscriminada, la pérdida del hábitat debido al cambio de uso de suelo para producción agrícola, el cambio climático que trae como consecuencia la reducción del área de distribución potencial por cambios en la temperatura, sequías y otros eventos extremos incendios forestales, incidencia de plagas y enfermedades y otros fenómenos naturales (Del Castillo, Pérez-de la Rosa, Vargas y Rivera, 2004). Proyecciones en P. hartwegii Lindley, por ejemplo, indican una reducción del hábitat de 86% para 2050, debido a los efectos del cambio climático (Gutiérrez y Trejo, 2014).

La drástica disminución poblacional puede afectar negativamente los niveles de diversidad genética, implicando una baja capacidad de adaptación al ambiente y hacer frente a factores adversos, acelerando el proceso de extinción (Rocha y Gasca, 2007). Esto es consecuencia del manejo antropogénico en la composición genética y genotípica de las poblaciones vegetales (Freeman y Herron, 2002). Asimismo, la baja diversidad genética y la ausencia de estructura genética en las especies puede ser un reflejo de cambios demográficos a lo largo de las generaciones (Freeman y Herron, 2002; Moreno, 2007). Lo anterior puede estar ocurriendo en las especies del género Pinus debido a la sobreexplotación, la disminución poblacional y la reducción del área de distribución, por lo que los análisis de la diversidad genética son indispensables. A pesar de ello, en poblaciones mexicanas de Pinus estos estudios son escasos, particularmente aquellos que incluyen marcadores moleculares considerados especie-específicos, como los microsatélites o secuencias simples repetidas (SSR). Los SSR son secuencias de ADN formadas de uno a seis pares de bases, encontrándose en regiones codificantes y no codificantes. Estos marcadores son utilizados para estudios de caracterización genotípica en plantas por ser abundantes en el genoma, altamente informativos, multialélicos, codominantes y permiten su transferibilidad entre especies relacionadas (Mason, 2015; Carneiro, Santini, Lima y de Freitas, 2016). Este tipo de marcadores moleculares de ADN permiten inferir la diversidad y estructura genética, tamaños efectivos y mínimos variables de poblaciones para conservación (in situ o ex situ) y selección de genotipos para mejoramiento, eventos de cuellos de botella, cartografía genética, etc. (Rocha y Gasca, 2007; Geburek y Konrad, 2008). Sin embargo, la principal desventaja de estos marcadores es el costo de su generación cuando no se tiene información del genoma de la especie de interés, así como del diseño de cebadores que permitan la amplificación de las regiones SSR (Rentaría, 2007; Rocha y Gasca, 2007; Valdés-Infante Herrero et al., 2010; Carneiro et al., 2016). Una alternativa es la evaluación de SSRs desarrollados para especies relacionadas a la especie de interés (transferibilidad) (Echt, Vendramin, Nelson y Marquardt, 1999; Chagne et al., 2004; Celiński, Pawlaczyk, Wojnicka-Półtorak, Chudzińska y Prus-Głowacki, 2011; Lesser, Parchman y Buerkle, 2011; Feng, Yang, Wang, Luo y Li, 2014; Villalobos-Arámbula, Pérez de la Rosa, Arias y Rajora, 2014; Rai, Ginwal y Saha, 2018). Así, se pueden identificar marcadores útiles reduciendo el tiempo y consumo de recursos en estudios genéticos para diversas especies de pinos (Villalobos-Arámbula et al., 2014).

Objetivos

El objetivo del presente trabajo fue evaluar la transferibilidad de marcadores SSR desarrollados para P. taeda en nueve especies de pinos.

Materiales y métodos

Material vegetal y extracción de ADN

Para la extracción de ADN, se emplearon las acículas de nueve especies del género Pinus: P. cembroides Zucc. (San José de Gracia, Aguascalientes), P. devoniana Lindl. (Tapalpa, Jalisco), P. luzmariae Pérez de la Rosa (Bosque La Primavera, Jalisco), P. patula Schltdl. & Cham. (Cruz Blanca. Veracruz), P. ayacahuite C. Ehrenb. ex Schltdl. (San Antonio Buenavista, Puebla), P. hartwegii Lindl. (Tapalpa, Jalisco), P. jeffreyi Balf. (Ejido Sierra de Juárez, Baja California), P. lumholtzii B.L. Rob. & Fernald (Sierra Escondida, Aguascalientes) y P. pseudostrobus Brongn (San Cristóbal de las Casas, Chiapas). El proceso de extracción de ADN se realizó basado en el método de CTAB (bromuro de hexadeciltrimetilamonio) a partir de tejido liofilizado. Para las primeras cuatro especies se empleó la misma metodología que Saghai-Maroof, Soliman, Jorgensen y Allard, (1984); para el resto de las especies se siguió la metodología establecida por Huang, Guang, Kong, Guo y Guo, (2013). La concentración y calidad del ADN fue determinada mediante espectrofo-tometría (NanoDrop 2000, Thermo Scientific) y corroborada mediante electroforesis en geles de agarosa, comparando el patrón de migración de las muestras con el del marcador de referencia, lambda sin cortar (New England Biolabs). Se emplearon tres árboles para cada especie, excepto para las especies P. devoniana Lindl. y P. hartwegii Lindl, para las cuales solamente se emplearon dos árboles.

Selección de marcadores SSR

Se realizó la selección de los marcadores de SSR desarrollados para P. taeda (Echt et al., 2011) con base en tres criterios: a) por grupo de ligamiento (GL) (marcadores distribuidos en todos los grupos de ligamiento de las especies del género Pinus), b) motivo de repetición (marcadores con repetición simple de dos o tres nucleótidos) y c) posición genética dentro de cada GL (marcadores ubicados en el brazo corto y largo). Se seleccionaron 39 marcadores, tres por cada uno de los 12 grupos de ligamiento y tres marcadores que no tienen asignación reportada (Tabla 1).

Amplificación por PCR y análisis

Las reacciones de amplificación mediante PCR se realizaron en un volumen final de 10 µL conteniendo 40 ng de ADN, 1 µM de cada iniciador y 0.8 X de REDTaq® ReadyMix™ PCR Reaction Mix (Sigma- Aldrich). Las condiciones de amplificación fueron: una desnaturalización inicial a 95° por 5 min., seguida de 35 ciclos de desnaturalización a 95° por 40 s, hibridación a 60° por 40 s y elongación a 72° por 2 min y una de extensión final a 72° por 10 min. La amplificación se realizó en un termociclador Veriti 96 Well Thermal Cycler (Applied Biosystems). Los productos de la amplificación fueron separados mediante electroforesis en geles de agarosa a 2% previamente teñidos con GelRed™ Nucleic Acid Gel Stain (Biotium) en amortiguador TBE 1 X a 120 V constantes durante 2 horas. La visualización de los fragmentos amplificados se realizó exponiendo los geles a luz UV en tanto que la captura de la imagen se realizó mediante el sistema Gel Logic (KODAK Carestream). Finalmente, se realizó el registro y cuantificación de fragmentos para determinar su tamaño y el porcentaje de amplificación.

Resultados y discusión

La amplificación de fragmentos de los 39 marcadores SSR fue variable. Treinta y siete (95%) amplificaron en al menos una de las nueve especies evaluadas. De ellos, 69.27% (27) presentó amplificación mayor a 50% a través de las especies, los cuales se encuentran distribuidos en los 12 grupos de ligamiento (GL). Diez de los marcadores (25.64%) amplificó entre 10% y 50% de las especies (Tabla 2). Los marcadores SsrPt_ctg7141, PtRIP_0630 y PtSIFG_1062 amplificaron en las especies P. jeffreyi y P. pseudostrobus mientras que el marcador PtRIP_1072 amplificó exclusivamente en la especie P. lumholtzii. Los marcadores PtTX3027 y PtTX3019 no amplificaron en ninguna especie. Los marcadores PtRIP_9315, PtSIFG_0265, PtTX3029, PtTX3045, PtSIFG_0440, PtSIFG_1018, PtSIFG_0249 (17.95%) amplificaron en todas las especies, localizados en los grupos de ligamiento (GL) 2, 4, 5, 6, 8, 11 y uno sin mapear.

Se observó un porcentaje de amplificación mayor a 30% en todas las especies. El mayor porcentaje de transferibilidad se observó en P. jeffreyi con 31 marcadores (79.49%), seguido de P. devoniana y P. pseudostrobus con 30 marcadores (76.92%). P. luzmariae, P. patula y P. lumholtzii, por otro lado, mostraron amplificación de 29 marcadores (74.36%), mientras que P. hartwegii, P. cembroides y P. ayacahuite mostraron amplificación en 22 (56.41%), 16 (41.03%) y 12 (30.67%) marcadores, respectivamente. Siete especies analizadas en el presente estudio tuvieron una transferibilidad de marcadores SSR mayor a 50%. Estas especies, así como P. taeda, pertenecen a la sección Trifoliae del subgénero Pinus. Por el contrario, las especies con menor transferibilidad (P. ayacahuite y P. cembroides) pertenecen al subgénero Strobus secciones Quinquefoliae y Parrya, respectivamente, siendo filogenéticamente más lejanas a P. taeda (Tabla 3). Las regiones complementarias de los iniciadores pudieron haber sufrido algún evento mutacional que impidió en ellos el proceso de hibridación durante el proceso de amplificación por PCR, con la consecuente ausencia de ampliaciones (Chapuis y Estoup, 2007).

Estas tasas de transferibilidad son similares a las observadas en marcadores SSR de P. strobus evaluados en cinco especies de pinos (Villalobos-Arámbula et al., 2014), para las cuales se registró amplificación de entre 67% y 100%, dependiendo de la especie, aunque es importante considerar que el número de loci evaluados fue menor (solo 6 marcadores). Por el contrario, la transferibilidad de marcadores de P. taeda, P. merkusii, P. resinosa y P. densiflora en P. kesiya fue considerablemente baja (de 0% a 20%), debido posiblemente a la distancia filogenética de las especies originales con la especie objetivo (Rai et al., 2018). El tamaño de los fragmentos generados en las diferentes especies fue variable (Fig. 1). Todos los marcadores presentaron polimorfismo a través de las especies en las se observó amplificación, con excepción de PtTX4079 y PtTX3063 (Tabla 4). Las diferencias entre los fragmentos obtenidos por un marcador se deben posiblemente al número de unidades de repetición que posee cada uno de ellos, producto de la adición o deleción de dichas unidades.

Los diferentes pesos moleculares también pueden ser resultado de errores de la polimerasa durante el proceso de replicación del ADN o durante la recombinación, obteniéndose cadenas hijas con longitudes desiguales a las parentales (Mason, 2015). Esto significa que alelos que difieren en una sola unidad de repetición están más relacionados por descendencia que alelos que difieren en más de una repetición (Demarchi 2009; Carneiro et al., 2016). Por lo tanto, las especies que se encuentran filogenéticamente más cercanas a la especie en la que se desarrollaron los iniciadores tendrían mayor éxito de transferibilidad que aquellas que se encuentran lejanas (Chapuis y Estoup, 2007).

Sin embargo, la transferibilidad entre especies cercanas no siempre ocurre. El concepto filogenético no necesariamente define el éxito de la amplificación interespecífica. En el presente trabajo, se podría esperar que P. patula, P. luzmariae y P. lumholtzii presentaran un mayor porcentaje de transferibilidad ya que pertenecen a la misma subsección (Australes) que P. taeda (Tabla 3). En contraste, P. jeffrei, P. pseudostrobus y P. devoniana, las cuales se encuentran en una subsección diferente a P. taeda (Ponderosae), registraron los mayores porcentajes de transferibilidad. Los bajos niveles de transferibilidad entre especies cercanas pueden ser explicados por el fenómeno de recombinación o de mutación en el sitio de unión de los iniciadores. La recombinación actúa mediante arreglos independientes de genes en diferentes cromosomas o por entrecruzamientos entre genes homólogos, contribuyendo a la generación de combinaciones de alelos en nuevos genomas (Salas, 2007). Las mutaciones en los sitios de unión de los cebadores podrían hacer que estos no se unan a la región complementaria y así evitar la amplificación de un fragmento, afectando la estimación de la diversidad genética y la diferenciación de las poblaciones (Chapuis y Estoup, 2007). Por otro lado, la identificación de los fragmentos (alelos) se basa, principalmente en la determinación de su tamaño, sin embargo, no todos los alelos que tienen la misma longitud presentan la misma secuencia. Estos alelos suelen dificultar la identificación de la diversidad alélica ya que pueden tener un origen genealógico diferente o, por el contrario, sobreestimar el flujo genético cuando la tasa de mutación es alta, particularmente cuando se usan en grupos altamente divergentes (Selkoe y Toonen, 2006). Es decir, el éxito de la transferibilidad no depende enteramente de la relación filogenética entre especies, ya que existen procesos que pueden modificar regiones puntuales en el genoma y sobreestimar el polimorfismo o reducir el porcentaje de amplificación inter-específica.

Conclusiones

Se identificaron entre 12 y 31 marcadores SSR óptimos para el análisis de las especies de pino estudiadas; no obstante, se sugiere evaluar otros marcadores para las especies que registraron menor amplificación (P. ayacahuite y P. cembroides). La transferibilidad de estos marcadores representa una alternativa más económica y rápida comparada con el desarrollo de marcadores especie-específicos, permitiendo la selección de un grupo de marcadores microsatélites para la realización de estudios de diversidad genética en especies del género Pinus y la comparación de los resultados interlaboratorios a través de métodos estandarizados.

Reconocimientos

Este trabajo fue financiado por la Comisión Nacional Forestal (Conafor) a través del proyecto “Fomento y Operación del Subsistema de Recursos Genéticos Forestales dentro del Centro Nacional de Recursos Genéticos (CNRG)”

Referencias

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Notas de autor

^*Autor de correspondencia. cortes.moises@inifap.gob.mx

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