Construcción de un modelo animal de fibrosis pulmonar inducido por Bleomicina

Making an animal model of Bleomycin-induced pulmonary fibrosis

La fibrosis pulmonar es una enfermedad progresiva y fatal debida a un proceso inflamatorio crónico descontrolado en los pulmones.

Una de las principales dificultades para encontrar un tratamiento apropiado para esta enfermedad es la falta de conocimiento sobre los mecanismos patogénicos que conducen a la fibrosis (1, 2).

La fisiopatología de la fibrosis pulmonar involucra células inflamatorias activadas que se acumulan en las vías aéreas bajas; las cuales producen especies reactivas de oxígeno, lo cual lleva a daño tisular y proliferación de fibroblastos que al activarse liberan proteínas a la matriz extracelular en exceso, lo cual distorsiona la arquitectura del tejido pulmonar con destrucción o pérdida de la función del órgano.

Las opciones de tratamiento están limitadas a pesar de la variedad de drogas antifibróticas disponibles, y la sobrevivencia del paciente es de tres a cinco años después del diagnóstico (3 - 5).

La clasificación de los desórdenes fibróticos pulmonares es amplia, y entre ellas, la fibrosis pulmonar secundaria a fármacos se presenta con características clínicas pulmonares similares a la fibrosis pulmonar idiopática (IPF).

De las enfermedades intersticiales del pulmón, la IPF es la más conocida por su agresividad y pronóstico ominoso (6 - 8).

Los modelos animales de fibrosis pulmonar son críticos para investigar los mecanismos patológicos de la enfermedad e importantes para la evaluación preclínica de nuevas terapias (9).

Un fármaco utilizado para tratar algunos tipos de cáncer es la Bleomicina, un glicopéptido originalmente obtenido de Streptomyces verticillus con varios atributos que lo hacen elegible, entre los cuales destaca el hecho de que no induce inmunosupresión ni mielosupresión. A nivel celular, la Bleomicina inhibe la síntesis de ADN mediante la producción de radicales libres que alteran la molécula. Como efecto secundario produce fibrosis pulmonar dependiente de la dosis.

Se considera que la neumonitis inicial, producida por Bleomicina, afecta al 46% de los pacientes en tratamiento, y de ellos, un 3 % muere por los efectos indeseables del medicamento (10 - 12).

Ese efecto indeseable del fármaco se ha aprovechado para estudiar los daños pulmonares en animales de experimentación, al inducir fibrosis pulmonar secundaria a Bleomicina. Este fármaco induce fibrosis pulmonar intersticial focal e inflamación, caracterizada por disminución significativa de la capacidad pulmonar (13).

Las ratas tratadas con Bleomicina intratraquealmente presentan elevación de la frecuencia respiratoria (10,13), alveolitis con edema y fibrosis incipiente a los 14 días de tratamiento; a los 28 días se observa fibrosis intersticial generalizada.

El objetivo de este trabajo fue construir un modelo animal de fibrosis pulmonar secundario a Bleomicina, en ratas Wistar, como herramienta que pueda servir de base para futuros diseños experimentales.

Este trabajo constituye un estudio de tipo descriptivo observacional con técnicas de laboratorio, realizado en el Laboratorio de Investigaciones de la Universidad de Cartagena (Cartagena, D.T. y C., Colombia) y en el Bioterio del Departamento de Farmacia de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá (Bogotá, D. C., Colombia).

Se utilizaron 10 ratas Wistar de 250 a 350 gramos de peso, las cuales fueron adquiridas en el Instituto Nacional de Salud (Bogotá, D. C.). Fueron hospedadas en cajas, en grupos de tres, en condiciones libres de patógenos y con acceso a voluntad al alimento concentrado y agua.

Se cumplieron todas las normas de Colombia sobre el uso de animales de experimentación, consignadas en la Ley 84 de 1989 (Estatuto Nacional de Protección de los Animales) (14) y en la Resolución 8430 de 1993, en la que se establecen normas científicas, técnicas y administrativas para la investigación en salud (título V: Animales) (15).

El Acuerdo 79 de 2003, Código de Policía, se tuvo en cuenta en lo que se refiere al capítulo IV: Protección y cuidado de los animales; igualmente, los procedimientos estuvieron ajustados al Memorando 0013 de marzo de 2014 de la Procuraduría sobre el cumplimiento de la Ley.

Se obtuvo aval del Comité de Ética de la Universidad de Cartagena por cumplimiento con los lineamientos éticos amparados en las mencionadas regulaciones como Ley, Resolución y Acuerdo.

De igual manera, se trabajó con el mínimo número de animales necesarios para la realización del modelo, con seguimiento diario y sacrificio sin sufrimiento.

Inicialmente se utilizó Ketamina, administrada por vía intramuscular (músculo del muslo posterior), la cual actúa sobre el sistema reticular activador del tallo cerebral, y Xylazina, que produce relajación muscular por su acción sobre los receptores adrenérgicos alfa. Se observó perdida del reflejo de enderezamiento, no el de deglución.

Inicialmente se utilizó Ketamina, administrada por vía intramuscular (músculo del muslo posterior), la cual actúa sobre el sistema reticular activador del tallo cerebral, y Xylazina, que produce relajación muscular por su acción sobre los receptores adrenérgicos alfa. Se observó perdida del reflejo de enderezamiento, no el de deglución.

Se ensayó la anestesia por vía intraperitoneal (IP) en la mitad inferior del abdomen a las siguientes dosis: Ketamina (80 mg/kg) y Xylazine (8 mg/kg), y se observo pérdida del reflejo de enderezamiento y de deglución. Se decidió además administrar Atropina: 0,05mg/kg, la cual disminuye la secreción salival y la sensibilidad y motilidad de la laringe, lo cual facilita la intubación. La vía IP finalmente se aplicó a las ocho ratas experimentales y dos controles.

Después de perder los reflejos de enderezamiento y deglución, la rata anestesiada fue colocada en posición supina sobre una tabla inclinada, se aseguraron los incisivos superiores al sostén dental y se colocó un tubo debajo de la nuca para alinear los ejes (bucal, faríngeo y laríngeo).

La intubación se realizó con un catéter intravenoso con una cánula n°16 (o de menor calibre), dirigido con una guía metálica, la cual se retiraba al pasar la glotis (16). Luego se procedió a instilar 2,0 unidades/kg de peso de Sulfato de Bleomicina (Blenoxane®, Bristol-Myers Squibb Company, New York) vial con 15 unidades) en un volumen máximo de 0,25 ml.

Después de la instilación se insuflaron pequeños volúmenes de aire lentamente, para asegurar la correcta distribución de la solución de Bleomicina en los pulmones del animal.

Se realizó seguimiento de los signos vitales durante la recuperación.

El grupo experimental (ocho ratas) recibió tratamiento con Bleomicina; el grupo control (dos ratas) recibió igual volumen de solución salina.

Figura 1
Rata en posición supina sobre unatabla inclinada, con incisivos superiores aseguradosal sostén dental. La intubación se realizócon un catéter intravenoso dirigido con unaguía metálica.
autores

La Figura 1 ilustra un animal anestesiado e intubado momentos antes de la administración de la Bleomicina.

De las ocho ratas utilizadas como grupo experimental cuatro fueron sacrificadas a los 14 días postratamiento junto a una rata control usando Penthal® (INVET, Bogotá, D. C.) intraperitoneal, a una dosis letal de 150 mg/kg en un volumen de 0.5 ml. Las ratas restantes fueron sacrificadas a los 28 días de tratamiento, siguiendo el mismo protocolo.

Inmediatamente posterior al sacrificio se realizó un lavado broncoalveolar con una jeringa de 5 ml, instilando lentamente 4 ml de solución salina (cuatro veces). Los volúmenes de líquido se recogieron en un tubo Falcon (Becton, Dickinson and Company, BD. San José, California, EE.UU.) siguiendo el procedimiento descrito por Dussaubat, Cryan y cols. (17,18). De los 16 ml administrados, se recuperaron aproximadamente 12 ml. Se obtuvo 1.5 ml para recuento celular, que se realizó en una cámara de Neubabuer (Clay-Adams Co, New York). Los resultados se informaron como número de células por mm3. El contenido restante se dividió en partes iguales en dos tubos estériles, que se centrifugan a 2000 rpm durante 10 minutos. Un tubo se utilizó para el recuento diferencial; el botón celular se utilizó para realizar extendidos, los cuales fueron coloreados con el reactivo de Wright (Harleco, EE.UU.) y analizados bajo microscopio óptico. El resultado se informó en porcentaje de los distintos tipos celulares. El segundo tubo se conservó para extracción de ARN total en otro proyecto.

Una vez realizado el lavado broncoalveolar se instiló formol al 10 % en tampón fosfato salino (PBS) pH 7.4 y se procedió a la disección de la cavidad torácica para la obtención de los pulmones.

Ambos pulmones de cada animal fueron disecados; cortes del pulmón izquierdo fueron fijados en formol fosfato salino al 10 % y embebidos en parafina y teñidos con hematoxilinaeosina y tinción tricrómica de Masson para el análisis histopatológico mediante microscopia óptica y determinación del puntaje de Ashcroft para fibrosis pulmonar por patólogos con experiencia en patología pulmonar (19). Además, el grado de inflamación se estimó por puntajes de intensidad de 0 a 3, según las indicaciones de López y cols. (20). El pulmón derecho se conservó congelado a -80 °C para estudios posteriores (no mostrados en este trabajo). Los procedimientos generales se esquematizan en el cuadro 1.

Macroscópicamente, los pulmones de las ratas tratadas con Bleomicina se observaron de un color pardo oscuro, mientras que los de las ratas control fueron de una tonalidad rojiza anaranjada brillante.

Ninguno de los controles, que recibieron solución salina, presentó a nivel microscópico cambios histopatológicos inflamatorios o fibróticos en los cortes pulmonares teñidos con hematoxilina y eosina y tinción histoquímica de Tricrómico de Masson.

La Figura 2 compara los hallazgos histológicos encontrados en sujetos experimentales y control a los 14 días posterior al tratamiento. En el grupo de ratas tratadas con Bleomicina, la histología reveló daño pulmonar con edema alveolar, caracterizado por infiltrado leucocitario, hemorragia intralveolar y proliferación fibroblástica.

La Figura 3 muestra los hallazgos histológicos en ratas tratadas con Bleomicina y sacrificadas a los 28 días. Se observó alteración de la arquitectura pulmonar con fibrosis extensa, hiperplasia del revestimiento alveolar con exceso de matriz extracelular, evidenciada por acumulación de colágeno con la coloración histoquímica de Tricrómico de Masson Figura 4.

Los resultados revelan que el tratamiento a los 14 días con Bleomicina indujo fibrosis pulmonar incipiente acompañada de inflamación intersticial intensa, mientras que la extensión del tratamiento a los 28 días resultó en proliferación de fibroblastos y síntesis excesiva de colágeno; estos cambios fueron representados con elevados índices en el puntaje de Ashcroft (tabla 2) para fibrosis pulmonar en ambos grupos experimentales. Asimismo, se observaron focos de necrosis tisular a los 14 días; similar hallazgo se observó a los 28 días; posiblemente resultado de un proceso de daño tisular que dio inicio durante la primera semana de tratamiento.

Figura 2
Figura 2

Comparación de cortes histológicosde pulmones de rata con tratamiento versuscontroles a los 14 días post-tratamiento (40X). Ay B: controles, ratas 5 y 8. C: rata 6. D: rata 7. E:rata 9. F: rata 10, todas tratadas con Bleomicina.Los cortes muestran tractos fibrosos, inflamaciónintersticial con enfisema compensatorio yacúmulos de macrófagos alveolares

autores

Figura 3
Figura 3

Comparación de cortes histológicos depulmones de rata con tratamiento versus controlesa los 28 días post-tratamiento (40X). A y B:controles, ratas 1. C: rata 2. D: rata 3, todas tratadascon Bleomicina. Los cortes muestran tractosfibrosos, fibrosis adventicial, neumonitis, connódulos fibroblásticos y numerosos macrófagosalveolares. E: rata 4, con neumonía bacteriana

autores

Figura 4
Figura 4

Hallazgos histológicos de fibrosis pulmonaren ratas tratadas con bleomicina a 14 (Ay B) y 28 días (C y D). A: rata 7. B: rata 9. C: rata 3.D: rata 2. Nótese la marcada fibrosis (color azul)acentuada alrededor de bronquios y vasos sanguíneos,con inflamación intersticial acompañante.Tinción tricrómica de Masson, 40X

autores

Tabla 2
Tabla 2

Determinación del grado de fibrosispulmonar en inflamación en las ratas controlesy con tratamiento a los 14 y 28 días. Para laestimación de la fibrosis pulmonar el puntajede Ashcroft utiliza como grado 0 el pulmóncon histología normal y grado 8 la obliteraciónfibrosa total. Al componente inflamatorio se ledio un grado de 0 a 4, siendo 0 la ausencia deinfiltrado inflamatorio y 4 neumonía.

Este trabajo describe la construcción de un modelo animal de fibrosis pulmonar inducido por Bleomicina, con base en el método sencillo de intubación endotraqueal de ratas descrito por Lizio y cols. (16).

Además de la Bleomicina, otros fármacos, sustancias y medios físicos han sido empleados para inducir fibrosis pulmonar; entre ellos se destacan: asbesto, irradiación, sílica, transferencia génica del factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-P1), el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), los cuales, en general, muestran una respuesta fibrótica posterior a una reacción inflamatoria.

Igual que en la enfermedad humana, el cuadro histológico se caracteriza por inflamación del parénquima por segmentos, lesión e hiperplasia de la células epiteliales y fibrosis intersticial (20, 21).

Como se describió en los resultados, hubo un hallazgo consistente de necrosis tisular a los 14 y 28 días.

En la literatura se reporta que durante las primeras 24 horas la fibrosis pulmonar por Bleomicina en roedores inicia como necrosis de la célula epitelial; dos a tres días después de la administración de Bleomicina aparece alveolitis aguda; la inflamación intersticial intensa aparece cuatro a doce días después del tratamiento con Bleomicina. Aunque el periodo incipiente de daño tisular no fue observado en este modelo, es plausible que los hallazgos reportados correspondan al efecto temprano de la acción de la Bleomicina.

La proliferación de fibroblastos y síntesis de matriz extracelular excesiva se inicia de 4 a 14 días post Bleomicina y aproximadamente tres semanas después el contenido de colágeno ha aumentado al doble (20, 22, 23); similar a como fue descrito en este modelo.

La Bleomicina es uno de los fármacos más ampliamente utilizados para el tratamiento de algunas neoplasias, pero tiene como limitación que a las dosis usuales empleadas produce toxicidad pulmonar en el 2 % de los casos (12, 24). Este hecho ha permitido que sea utilizado para la inducción química (farmacológica) de fibrosis pulmonar en modelos animales.

El daño al pulmón por tratamiento con Bleomicina es rápido al principio, con una fase de alveolitis inicial caracterizada por edema, acumulación de células inflamatorias, incluyendo macrófagos, linfocitos y neutrófilos, que conducen a la proliferación de fibroblastos.

La siguiente fase se caracteriza por acumulación de fibroblastos y depósito aumentado de colágeno en el intersticio, y de otros componentes de la matriz extracelular que distorsionan la arquitectura pulmonar (25, 26).

Similares resultados se observaron en este estudio; en el que además se encontró aumento significativo del recuento de células en el lavado broncoalveolar, tanto en las ratas tratadas con Bleomicina sacrificadas a los 14 días como en las que fueron sacrificadas a los 28 días.

Similar a los resultados de Dussaubat y cols. (17), nuestros resultados revelan que en los animales sacrificados a los 14 días después del tratamiento con Bleomicina se encontraron bronquiolos con inflamación en la pared e infiltrado inflamatorio permeando el epitelio. Se observó también proliferación de fibroblastos en el intersticio y focos de inflamación con proliferación fibroblástica, además de macrófagos alveolares en la luz. En los animales sacrificados a los 28 días después del tratamiento con Bleomicina, por su parte, se observó proliferación fibroblástica con producción de matriz extracelular e infiltrado inflamatorio crónico con macrófagos y linfocitos. Todo lo anterior le otorgó altos índices de puntaje Ascroft.

El modelo animal presentado aquí se podría combinar con métodos diagnósticos por imagen para seguir el curso del desarrollo de enfermedades pulmonares humanas y sus terapias (26, 27).

Igual que en la literatura mundial, el modelo animal de fibrosis pulmonar inducido por Bleomicina construido en este trabajo cumple varios de los criterios que se presentan en la enfermedad humana, como son la inflamación y la reparación aberrante del tejido que lleva a focos de proliferación fibroblástica (28, 29, 30). Estos hallazgos cumplen parcialmente con los criterios de la enfermedad humana.

En Colombia se ha desarrollado con éxito el modelo animal de fibrosis pulmonar en ratones con el hongo Paracoccidioides brasiliensis, que produce una de las más importantes enfermedades sistémicas por hongos en Latinoamérica (31).

En conclusión, en este trabajo se ha descrito la construcción de un modelo animal de fibrosis pulmonar inducido farmacológicamente mediante el tratamiento con Bleomicina. A nuestro entender, esta es la primera vez que se describe la construcción de este modelo en nuestro país.

El modelo ya implementado servirá a nuestro grupo y a otros grupos de investigación nacionales e internacionales como herramienta en estudios tendientes a investigar las bases moleculares subyacentes en la fisiopatología de la fibrosis pulmonar y a la búsqueda de nuevas opciones terapéuticas como moléculas o principios activos para el tratamiento de la misma.

Correspondencia: Doris Esther Gómez-Camargo. Universidad de Cartagena, Centro Calle de la Universidad, carrera 6 n° 36-100. Oficina Doctorado en Medicina Tropical. Teléfono: 3003109412. degomez@ hotmail.com

Agradecimientos: Los autores agradecen a la Universidad de Cartagena y a la Universidad Nacional de Colombia (Bogotá, D. C.) por apoyar esta investigación con sus recursos científicos, académicos y locativos; a los integrantes del Semillero Unimol de la Universidad de Cartagena, al médico José Pomares Estrada (anestesiólogo), a las profesionales Zoraya Rodríguez y María Vallejo del Laboratorio de Investigaciones de la Universidad de Cartagena; a la Clínica Veterinaria Mascotas (Cartagena) por su colaboración en el manejo inicial de los animales.

Conflicto de intereses: ninguno

Financiación: Este trabajo fue financiado con recursos propios del Grupo de Investigación UNIMOL de la Universidad de Cartagena.