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INTRODUCCIÓN

En Argentina, la producción porcina constituye una actividad en constante aumento, en particular, para la pequeña agricultura familiar que representa más del 66% de las explotaciones agropecuarias (SENASA, 2014). No obstante, este tipo de producción posee ciertas limitaciones de índole comercial, tecnológica, productiva, social y ambiental (INTA, 2011) que, entre otras consecuencias, propician la transmisión enzoótica y zoonótica de diversas infecciones.

Entamoeba polecki (Von Prowazek, 1912) pertenece al grupo de amebas intestinales, de transmisión fecal-oral, cuyo quiste maduro posee un único núcleo. Su principal reservorio u hospedero es el cerdo (Sus scrofa domesticus) aunque también puede infectar a otros animales; entre ellos al hombre (Levin y Armstrong, 1969). Hasta el momento, y con base en diferencias nucleotídicas halladas en una región del gen ARN ribosomal 18S, se han identificado cuatro subtipos (ST1, ST2, ST3 y ST4) de esta especie que tendrían relación con el hospedero que parasitan (Stensvold et al., 2011). Si bien la patogenicidad potencial de esta ameba no está suficientemente comprobada (Salaki et al., 1979; Gay et al., 1985) actualmente se especula que la infección por este parásito contribuiría al agravamiento de cuadros digestivos en el cerdo, lo que estaría relacionado con la composición de su flora intestinal (Matsubayashi et al., 2015a). Particularmente, se observó que cerdos coinfectados con E. polecki (específicamente el subtipo ST3) y la bacteria Lawsonia intracellularis (agente etiológico de la enteropatía proliferativa porcina o ileítis (McOrist et al., 1995)) presentaron cuadros severos de colitis ulcerativa, mientras que cerdos infectados solo con L. intracellularis presentaron una sintomatología menos severa. Este hallazgo condujo a la conclusión de que gran cantidad de trofozoítos presentes en lesiones y sitios ulcerados del intestino sería la mayor causa del agravamiento del cuadro y no la infección por la bacteria (Matsubayashi et al., 2015b), mostrando con esto el efecto amplificador de daño que podría tener este parásito en presencia de otros patógenos.

Frente a lo expuesto y debido a que a) E. polecki tiene la capacidad potencial de agravar cuadros intestinales producidos por otros microorganismos en porcinos; b) no hay reportes en el país sobre esta parasitosis; c) la producción porcina es una actividad que se encuentra en creciente aumento en el país (SENASA, 2014); y a efectos de determinar si las condiciones de cría constituyen un factor de riesgo para la transmisión de E. polecki, se estudiaron dos poblaciones de cerdos procedentes de sistemas productivos diferentes. A nuestro entender, este es el primer reporte de diagnóstico y caracterización de E. polecki en Argentina, en particular asociado a la producción porcina.

MATERIALES Y MÉTODOS

Por un lado, en 2011, se recolectaron heces de cerdos (n=18) a través de un muestreo por conveniencia, en la zona periurbana y en parajes aledaños al municipio de Misión Nueva Pompeya (MNP, 24°55’36”S 61°28’48”O; departamento General Güemes), provincia de Chaco. Los animales no estaban confinados en corrales y circulaban libremente por el peridomicilio y por el monte para procurar su alimento, tanto a partir de los desechos orgánicos familiares como de frutos silvestres de leguminosas y raíces del monte.

Por otro lado, en 2012 se recolectaron heces de cerdos (n=10) de la estación experimental del INTA de Marcos Juárez (EEA-Marcos Juárez, 32°42’00”S 62°06’00”O), provincia de Córdoba. En este sistema productivo los animales se encontraban confinados, generalmente en corrales, disponían de controles sanitarios y eran alimentados con dieta balanceada. Las muestras procedentes de ambas regiones fueron conservadas en recipientes plásticos a -20 °C hasta su procesamiento.

Como paso previo a la detección de quistes parasitarios, una porción de las muestras fue concentrada por un método de centrifugación que habitualmente se emplea en el laboratorio (Duré et al., 2013). Al menos dos alícuotas, una de ellas coloreada con solución de Lugol, fueron inspeccionadas por microscopía óptica utilizando un objetivo de 40X. Para la extracción de ácidos nucleicos, una alícuota de las heces fue congelada con nitrógeno líquido y molida en mortero (tres veces). El ADN fue extraído utilizando un equipo comercial (QIAmp DNA stool de Qiagen), según las instrucciones del fabricante y conservado a -20 °C hasta su utilización como templado para las reacciones de amplificación por PCR.

Además y debido a que existen especies del mismo género que poseen quistes idénticos al de esta ameba, se propuso realizar el diagnóstico molecular de E. polecki. Para lo cual se diseñó un par de cebadores específicos de especie que hacen blanco en el gen ARN ribosomal 18S y que contiene la región informativa que permite discriminar entre diferentes subtipos de E. polecki (Stensvold et al., 2011): Pol_F AGAAAGAGGAGGAAGCATG y Pol_R CCCAGTCATGTACACCTTTT.

El ensayo de PCR fue realizado en un volumen final de 50 μl conteniendo buffer 1X (Qiagen®), 15 mM de MgCl2, 2 mM de dNTPs (Promega), 0,4 μM de cada cebador (Biodynamics) y 0,5 U de Taq polimerasa (Qiagen®). Como templado se utilizaron entre 250-300 ng de ADN genómico. Las condiciones de ciclado para la reacción de amplificación fueron: 3 min a 94 °C, seguido de 35 ciclos a 94 °C por 30 seg; 51 °C por 30 seg y 72 °C por 1 min, más una extensión final a 72 °C por 7 min. Los amplicones obtenidos fueron extraídos de la mix utilizando un equipo comercial (QIAquick PCR Purification Kit) según las instrucciones del fabricante y secuenciados en ambas direcciones en la Unidad de Genómica del Instituto de Biotecnología (CICVyA, INTA) por el método Sanger, utilizando BidDye Terminator v3 y secuenciadores automáticos Genetic Analyzer 3500 xl (Applied Biosystems). La edición de las secuencias y el ensamblado de los contigs se realizó con el Software Vector NTI®. Para realizar la reconstrucción filogenética de los aislamientos se utilizó el Software MEGA 5.05 (Kumar et al., 2004; Tamura et al., 2004).

Se calcularon intervalos de confianza binomiales Agresti-Coull 95% (IC) para las proporciones de heces infectadas con E. polecki (Brown et al., 2001).

RESULTADOS

En el 60,7% (17/28) de las heces colectadas se detectaron quistes uninucleados con características morfológicas compatibles con E. polecki: tamaños de los quistes comprendidos entre 8-15 µm, presencia de un solo núcleo con cromatina periférica y nucléolo central (figura 1).

El porcentaje de positividad fue mayor en las heces procedentes de Marcos Juárez [70% (64%; IC 39-90)] que en las de Misión Nueva Pompeya [55,5% (55%; IC 34-75)], aunque esta diferencia no fue estadísticamente significativa.

A partir de los fragmentos secuenciados pertenecientes al gen 18S del ARN ribosomal se determinó la identidad a través de la comparación contra la base de datos de Genbank usando BLASTn, de manera que se confirmó la presencia de E. polecki en 13 de las 17 muestras donde los quistes fueron identificados.

A su vez, las secuencias nucleotídicas fueron utilizadas para analizar los polimorfismos entre las muestras y establecer las relaciones filogenéticas que permiten clasificar los diferentes subtipos de E. polecki, para lo cual se utilizó el método de distancias Neighbor-joining disponible en el paquete MEGA 5.05. Se incorporaron al análisis otros aislamientos obtenidos de distintos hospederos donde fueron identificados los distintos subtipos de esta ameba (GenBank): cerdo (AF149913.1), humano (FR686394.1, FR686392.1, FR686398.1, FR686400.1, FR686357.1, FR686393.1, FR686395.1 y FR686397.1), avestruz (E. struthionis; AJ566411.2) y primate (E. chattoni; AF149912.1) (figura 2).

El análisis filogenético permitió clasificar diferencialmente a los aislamientos estudiados, de manera que fue posible identificar dos grupos: E. polecki (ST1) y E. struthionis (ST3) de acuerdo a datos previos (Stensvold et al., 2011). Ningún aislamiento obtenido en este trabajo agrupó con E. chatonni (ST2) o E. polecki (ST4).

DISCUSIÓN

Este trabajo describe por primera vez la presencia de E. polecki en cerdos procedentes de dos sistemas productivos de nuestro país. El diseño de un par de cebadores para la amplificación de los ácidos nucleicos específicos de E. polecki, propuestos aquí, permitió confirmar la identidad de quistes detectados por microscopía óptica en las heces de los cerdos, como así también identificar los subtipos del parásito que se encuentran en circulación.

Por un lado, dado que no existieron diferencias significativas en el número de positividad de las heces infectadas de los animales procedentes de ambos sistemas productivos (MNP y MJ) inferimos que las condiciones sanitarias de cada región no serían determinantes para la adquisición de esta parasitosis. Se ha observado que animales criados en sistemas abiertos (sistema “plein air”) presentan menor frecuencia de infección debido a que el ambiente actuaría como factor de “dilución” de los protozoarios excretados (Giarratana et al., 2012). Sin embargo, este estudio muestra que, aunque los animales de MNP son criados en un sistema abierto, las condiciones higiénico-sanitarias en esa región son deficientes y esto afectaría y contrarrestaría el efecto del ambiente.

Por otro lado, el hallazgo de ST1 y ST3 de E. polecki en estos animales es relevante, debido a que estos subtipos poseen una baja especificidad de hospedero, habiéndose detectados ambos subtipos tanto en cerdos (Sus scrofa domesticus) como en avestruces (Rhea americana) (Stensvold et al., 2011). En relación con esto, en MNP se ha observado que tanto los cerdos como otros animales, entre los que se encuentra el ñandú (Rhea americana), circulan por los mismos sitios (monte y peridomicilio rurales) lo que conllevaría, dadas las condiciones sanitarias, a la adquisición y persistencia de esta parasitosis en animales susceptibles. En el caso particular del hallazgo de ST3, en ambas poblaciones de cerdos (MJ y MNP), pone en alerta sobre la posible afectación de la salud de estos animales debido a la potencialidad de esta ameba de magnificar el daño producido por otros patógenos. La detección de E. polecki como potencial amplificador de daño sería particularmente importante en el “síndrome de diarrea posdestete” que se manifiesta, en un principio, como un disturbio funcional del intestino y luego se transforma en un cuadro infeccioso. En tal sentido, se ha reportado recientemente el aislamiento de gran cantidad de trofozoítos de E. polecki ST3 de úlceras intestinales de cerdos infectados con L. intracellularis que padecían cuadros diarreicos agudos (Matsubayashi et al., 2015b). Finalmente, los subtipos (ST4 y ST2) que han sido asociado a infecciones en humanos y primates (Stensvold et al., 2011) no fueron detectados en las muestras analizadas.

En este contexto se desprende la necesidad de realizar un seguimiento o control de la microbiota intestinal de estos animales, dado que este tipo de ganado es susceptible a diversas enfermedades infecciosas y parasitarias (Lai et al., 2011; Nguyen et al., 2013; Schär et al., 2014; Solaymani-Mohammadi y Petri, 2006), con el objetivo de advertir en los cerdos posibles cuadros intestinales severos en los que intervendría particularmente E. polecki ST3. Este trabajo propone una herramienta molecular confiable que no solo permite la detección e identificación de E. polecki, sino también permite identificar los subtipos de esta especie. Además, se describe por primera vez la presencia de este parásito en cerdos de establecimientos de producción diferencial en dos regiones argentinas.

CONFLICTO DE INTERESES

Los autores declaran no haber conflictos de interés. Los autores también afirman que no tienen ningún interés financiero o personal que pueda afectar a su objetividad, o influir inapropiadamente en sus acciones mientras se estaban llevando a cabo esta investigación.

Agradecimientos

Los autores agradecen a los miembros de las comunidades rurales y a las familias de MNP. También nos gustaría agradecer al Dr. H. Piscitelli y al Dr. F. Bessone de EEA-Marcos Juárez (INTA), quienes amablemente nos proporcionaron las muestras desde la provincia de Córdoba. Este trabajo fue financiado por la Universidad de Buenos Aires [Subsidio: R022 y S014 de NB y GG] y el INTA [PNBIO 1131032 y 1131043 de MF].

Las fuentes de financiación solo proporcionaron apoyo financiero para la realización de la investigación y no han participado en el diseño del estudio; en la recopilación, análisis e interpretación de datos; en la redacción del informe; y en la decisión de enviar el artículo para su publicación.

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