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INTRODUCCIÓN

El hígado graso (HG) se caracteriza por la acumulación de grasa en el hepatocito (hepatoesteatosis) y comprende una variedad de alteraciones histológicas asociadas a inflamación hepática que frecuentemente evoluciona a patologías crónicas graves del hígado. En ella se evidencia activación de las células inflamatorias, producto de la acción de mediadores inflamatorios (citocinas y quimiocinas) cuyo rol principal en el proceso ha llevado a que sean consideradas como posibles blancos terapéuticos en el HG no alcohólico (HGNA) [6]. Existen diferentes compuestos químicos que provocan hepatoesteatosis, entre ellos la etionina, etil-análogo de la metionina (Met) que compite con ésta en las diferentes vías metabólicas en que interviene este aminoácido, tal como la síntesis de proteínas, con disminución de las lipoproteínas encargadas de drenar los triglicéridos desde el hígado hacia el torrente sanguíneo. Otra proteína que se encuentra disminuida es la apoproteína sérica C III en vacas (Bos taurus) con infiltración grasa hepática inducida por etionina [16]. El HG afecta a diferentes especies animales, entre ellas al ganado bovino induciendo alteraciones metabólicas del periparto [24]. El HG antecede con frecuencia a alteraciones puerperales con disminución de la eficiencia reproductiva [19].

El estrés oxidativo (EO) está involucrado en los procesos inflamatorios, es así como en las enfermedades del hígado se reportan altas concentraciones de especies reactivas del O₂ (ERO) [18] y el origen del daño hepático se ha relacionado con la existencia de radicales libres (RL) que pueden lipoperoxidar a componentes celulares como las membranas, y causar alteraciones que llevan a la pérdida de la función celular. En el HGNA, la funcionalidad hepática se encuentra afectada tal como ha sido determinado en forma experimental [13]. El presente estudio tuvo el objetivo de determinar si en el HG experimental causado por etionina en ratones albinos de laboratorio (Mus musculus Linnaeus, 1758) machos NMRI adultos, se establecía un estado de EO en el hígado, así como cuantificar la posible alteración en la función de dicho órgano.

MATERIALES Y MÉTODOS

Animales, manejo:

Se utilizaron para este estudio, ratones machos de la población de ratones albinos de laboratorio, específicamente de la cepa NMRI provenientes del Bioterio Central de la Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado (UCLA), Venezuela. Mediante muestreo aleatorio simple, se seleccionaron 20 ratones machos adultos con peso corporal promedio de 27,5 ± 1,5 gramos (g) establecido en una balanza para animales Ohaus (Tripe Bean Balance, Serie 700, Florham Park, NJ, EUA) Se colocaron en jaulas individuales de acero inoxidable, bajo ciclos de luz de 12 horas (h) de luz/12 h de oscuridad en las condiciones estandarizadas del Bioterio de la Unidad de Investigación en Ciencias Funcionales “Dr Haity Moussatché” (UNIHM) Decanato de Ciencias Veterinarias (DCV) de la UCLA. Con libre acceso al agua y a un pienso comercial para ratones Ratarina® (Protinal, Venezuela). El estudio fue conducido de acuerdo al Código de Bioética y Bioseguridad de FONACIT-Venezuela [10].

Inducción de HG no alcohólico:

Los animales fueron distribuidos aleatoriamente en dos grupos de 10 animales cada uno: un grupo control y otro inyectado con DL-etionina (Sigma Chemical Co, MO, EUA) disuelta en solución fisiológica estéril, administrada i.p. en dosis de 7,5 mg/20 g de peso corporal. A los controles se les inyectó sólo el vehículo (solución fisiológica estéril). Ambos grupos se sometieron a un ayuno de 48 h con libre acceso al agua de bebida.

Toma de muestras, determinaciones:

Luego de un ayuno de 48 h, los ratones, por venopunción coccígea, se obtuvo una muestra de sangre tratada con anticoagulante ácido etilendiamino tetra acético (EDTA)-Na al 2%. Los plasmas se separaron por centrifugación (800 g, 20⁴ minutos) en microcentrífuga refrigerada Eppendorf 5402 (Brinkman Instr., NY, EUA) y fueron mantenidos en un refrigerador Mabe RMT, 41XMVEB (Colombia). Obtenida la muestra de sangre, a los animales se les practicó la eutanasia bajo ligera anestesia con éter. Se disecó el hígado, se evaluó su aspecto macroscópico y se colocó en tampón Tris-sacarosa 250 mM pH 7,2 a 4 ºC. Se homogeneizó 1,5 g de hígado con 3 veces su peso en tampón Tris-sacarosa a 4 ºC en un potter NSI-12 Bodine (Electric Comp., Chicago, EUA). El sobrenadante del homogeneizado, diluido 1:40 con agua desionizada, se mantuvo refrigerado hasta el momento en que se le aplicó los análisis respectivos.

Determinación de la magnitud y características del HG: Una pequeña porción de hígado fijado en formol tamponado al 10%, fue utilizado para su estudio histopatológico realizado en el laboratorio de Anatomía Patológica del Hospital Veterinario “Dr. Humberto Ramírez Daza” del DCV-UCLA. Se obtuvieron secciones de 4 micras del tejido mediante el uso de un microtomo Jung AG (Heidelberg, Alemania) y posterior tinción de los cortes con hematoxilina-eosina de acuerdo a la técnica convencional.

Cuantía del depósito graso hepático: En el sobrenadante diluido del homogeneizado hepático se determinó la concentración de triglicéridos por método enzimático mediante kit de Qualitest (Ind. Qualitest, Caracas, Venezuela). Los resultados se expresaron en miligramos (mg) de triglicéridos/mg de proteínas, las cuales fueron determinadas mediante el kit Pierce (ILL, EUA) basado en la técnica de Bradford [5].

Cuantificación de los productos de la degradación lipoperoxidativa: En el sobrenadante del homogeneizado hepático, se determinó la concentración de dienos conjugados (DC), a través de la técnica descrita por Wallin [22] y también la concentración de malondialdehído (MDA) mediante el método de TBARS (sustancias reaccionantes con el ácido 2-tio barbitúrico) de acuerdo a Ohkawa [21].

Determinación del daño en la funcionalidad hepática: En el plasma fueron determinadas la actividad de la alanina amino- transferasa (ALT) y de la aspartato aminotransferasa (AST), mediante kits comerciales (Wiener lab, Rosario, Argentina). Todas las lecturas espectrofotométricas se llevaron a cabo en un Genesys 5 (NY, EUA).

Análisis estadístico de los resultados: Se realizó con la ayuda del programa estadístico informático SPSS (Statistical Package for the Social Sciences o Statistical Product and Service Solutions) versión 17.0 para Windows. Los resultados quedaron expresados como el promedio de los valores ± error estándar. Para establecer la significación estadística de los resultados se utilizó la prueba “t” de Student exigiéndose un 95% de certeza (P<0,05).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Análisis histopatológico

En la FIG. 1A se observa el aspecto macroscópico del hígado de ratón macho NMRI adulto control con tonalidad oscura y en la FIG.1B el hígado de un animal inyectado con DL-etionina, el cual presenta color claro a diferencia del animal control. El estudio histológico del hígado de ratones machos NMRI adultos controles mostró células hepáticas con un aspecto normal (FIG.1C). Sin embargo en el hígado de los ratones tratados con DL-etionina se observó metamorfosis grasa hepática moderada, con vacuolas citoplasmáticas grandes y pequeñas en los hepatocitos y presencia de megalocitos y células en anillo de sello (FIG. 1D).

Estrés oxidativo: cuantificación mediante DC y MDA

El estrés oxidativo se cuantificó por los niveles hepáticos de dienos conjugados (DC) y malondialdehído (MDA). Se observó que los DC se elevaron significativamente (P<0,05) a 297,45 ± 23,10 mmoles/mg proteínas en los ratones machos con HG inducido por la DL-etionina con respecto al valor control de 231,18 ± 15,53 µmoles/mg proteínas, como se muestra en la FIG. 2A. En forma similar la concentración de MDA se incrementó muy significativamente (P<0,001) a 852,91 ± 55,26 nmoles/mg proteínas en los ratones machos con HG por DL-etionina, al compararlos con su nivel control de 364,91 ± 17,73 nmoles/mg proteínas (FIG. 2B).

Depósito hepático: cuantificación de triglicéridos

Los hígados de los ratones machos inyectados con DL- etionina presentaron una elevación significativa (P<0,01) de los TG hepáticos a 2,26 ± 0,30 mg/mg proteínas de 0,63 ± 0,08 mg/mg proteínas obtenido en los hígados de los animales controles (FIG. 3), resultados que apoyan lo observado en el estudio histopatológico.

Daño de la funcionalidad hepática: cuantificación de ALT y AST

La administración de DL-etionina a ratones machos NMRI adultos aumentó significativamente (P<0,01) la actividad plasmática de la enzima alanina amino-transferasa (ALT) a 169,86 ± 18,78 U/L al comparar con el valor control de 59,40 ± 5,16 U/L, como es mostrado en la FIG 4. De igual manera la actividad de la aspartato amino transferasa (AST) se incrementó significativamente (P<0,01) a 241,93 ± 10,14 U/L en los ratones machos con hepatoesteatosis inducida por DL-etionina, en relación a la actividad control de 158,35 ± 13,54 U/L (FIG 4).

El HG puede ubicarse entre una de las principales alteraciones metabólicas del periparto bovino [23]. La administración de colina a vacas recién paridas previene el HG [17].

Los modelos experimentales para investigar el HGNA en animales de laboratorio [20] no sólo han proporcionado importantes aportes en cuanto a los aspectos ya indicados sino también, en relación al uso de agentes terapéuticos especialmente de productos naturales. En el presente estudio se utilizó como modelo experimental a ratones machos adultos NMRI a los que se indujo HGNA mediante administración i.p. (7,5 mg/20 g peso corporal) de DL-etionina, etil-análogo de la metionina (Met) que desplaza al aminoácido de sus vías metabólicas normales induciendo disminución del ATP hepático de la síntesis proteica, y la consecuente disminución, entre otras, de las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), que exportan lípidos desde el hígado a la sangre. Se debe señalar que la Met es transformada en el hígado animal por acción de la enzima Met-adenosiltransferasa que cataliza su conversión a S-adenosil-Met [14].

El estudio histopatológico de los hígados de los ratones machos administrados con DL-etionina, dio como resultado una metamorfosis grasa hepática moderada, con hepatocitos cuyos citoplasmas presentaron vacuolas grandes y pequeñas además de la presencia de megalocitos y células en anillo de sello. Estos resultados, son coincidentes con lo reportado en ratas machos Sprague Dawley alimentadas con una dieta enriquecida con fructosa durante cinco sem, las cuales mostraron cambios histopatológicos en el hígado, caracterizados por leve a moderado depósito graso macro y microvesicular, con mínimos signos de fibrosis perisinusoidal [2]. Por otra parte, la adición en la dieta de un 0,5% de niacina, agente terapéutico en el tratamiento de la dislipidemia y de enfermedad cardiovascular, revierte la hepatoesteatosis inducida por una dieta alta en grasas suministrada a ratas machos Sprague Dawley caracterizada por prominente micro y macroesteatosis con vacuolas intrahepáticas con un diámetro entre 4 a 10 mm [11].

En el HG, la acumulación de triglicéridos (TG) en los hepatocitos necesariamente corresponde a un desequilibrio entre la síntesis hepática de triacilgliceroles y la salida de éstos hacia el torrente sanguíneo. En forma general se puede decir que un aumento de la afluencia de ácidos grasos libres (AGL) hacia el hígado desde el tejido adiposo o de fuentes dietarias (quilomicrones) como también un incremento de la síntesis hepática endógena de AGL, pueden generar una acumulación de TG en el hepatocito, mediada ya sea por una insuficiente b-oxidación mitocondrial o una deficiente producción o secreción de VLDL [9]. Resulta adecuado señalar que los AGL se degradan por b-oxidación mitocondrial en la cual cada acetil CoA formado ingresa al ciclo de los ácidos tricarboxílicos (ATC), vía metabólica que se satura ante un exceso de acetil CoA, el cual podrá derivarse hacia la formación de cuerpos cetónicos, entre ellos el ácido b-hidroxibutírico [15]. Los eventos metabólicos descritos son aplicables a la movilización de reservas lipídicas particularmente desde el tejido adiposo, necesarias para satisfacer las demandas energéticas. El exceso de lípidos movilizados se acumula en las células del hígado en forma de TG con instauración de un HGNA [23]. En el presente estudio la concentración de TG hepáticos se mostró aumentada significativamente en los ratones machos con HG, en relación a sus controles. De forma coincidente, se ha descrito ampliamente la presencia de una elevada concentración de TG hepáticos en variadas condiciones inductoras de HGNA. Así, la administración oral de CCl4 disuelto en aceite de oliva fruto del olivo (Olea europaea), en dosis de 5 mL kg de peso alternadamente durante 14 días (d) a ratas machos albinas Wistar, duplica el contenido intrahepático de TG, efecto que es revertido por el extracto de hojas de Taraxacum officinale L. [3]. De igual manera, una dieta deficiente en metionina y colina, administrada durante cuatro sem ratones machos genéticamente obesos (db/db), de seis sem de edad, duplica la concentración de TG en el hígado, con respecto al nivel inicial [25]. También la administración durante cuatro sem de una dieta con alto contenido graso, induce en ratas machos Sprague Dawley, un exacerbado depósito de TG en los hepatocitos [12].

El daño celular debido al EO desempeña una función vital en la patogénesis de las alteraciones hepáticas, entre ellas el HG. El agente inductor iniciaría los procesos bioquímicos que llevan al EO, causal directo de procesos patológicos en diferentes territorios celulares como el hepático, por la producción de Radicales Libres. Estos agentes, causan daños a orgánulos celulares debido al proceso de lipoperoxidación (LPO) que altera la estructura normal de los lípidos de membrana y conduce a una distorsión del espacio hidrofóbico con pérdida de la función biológica de ella. La cuantificación de los productos de la LPO es una medida del EO. En el presente estudio la concentración hepática de DC y MDA estuvo significativamente aumentada en los ratones machos inyectados con DL-etionina, en comparación con los respectivos animales controles, resultado indicativo de la instauración de un estado de EO hepático. Este hallazgo también ha sido reportado en ratas machos Sprague Dawley a las 24 h de la administración de una sola inyección i.p. de 2 mL/kg de CCl4, con una muy significativa elevación de la concentración de MDA hepático [8]. Así mismo, una dieta deficiente en metionina y colina induce en ratones machos C57BL/6 una moderada esteatosis microvesicular del hígado, con elevación de la concentración hepática de triglicéridos y de MDA [26].

La enfermedad hepática grasa no alcohólica es quizás la causa más habitual de elevación sérica de las aminotransferasas, en el mundo occidental y también en el asiático [4]. El daño hepático, agudo o crónico, se asocia invariablemente con elevación plasmática de las transaminasas alanina aminotransferasa (ALT), enzima de ubicación intracelular mayoritariamente citoplasmática y de la aspartato aminotransferasa (AST), localizada en dos regiones intracelulares: citoplasma y mitocondrias, la enzima ALT presenta su mayor concentración en el hígado y su elevación se visualiza como específica de daño hepático [12].

En el presente estudio se observó cómo en los ratones machos NMRI inyectados con DL-etionina, las actividades plasmáticas de la ALT y de la AST se encontraron elevadas significativamente al compararlas con sus respectivos controles. Estos resultados coinciden con otros reportes que muestran que el CCl4, potente hepatotóxico, induce un aumento de los parámetros séricos de daño hepático, como las enzimas ALT y AST en ratas machos albinas de la cepa Wistar [1]. Además, la administración de CCl4 a ratones machos Kunming origina una hepatotoxicidad aguda evidenciada por una significativa elevación sérica de la ALT y AST y de los antioxidantes hepáticos [7]. La relación AST/ALT puede orientar el diagnóstico con respecto al tipo de hepatoesteatosis producida, así un valor mayor de 2 hace probable un HG de naturaleza alcohólica [12]. En el presente estudio se obtuvo un valor de AST/ALT de 1,4 en los ratones machos con HG, resultados cónsonos con su naturaleza no alcohólica.

CONCLUSIONES

De acuerdo a los resultados obtenidos en la presente investigación, la administración en ratones machos por vía i.p. de DL-etionina en dosis de 7,5 mg/20 g peso corporal induce un hígado graso no alcohólico (HGNA) caracterizado por metamorfosis grasa hepática moderada y un aumentado depósito de triglicéridos en el hígado. El HGNA inducido por etionina provocó un estado de estrés oxidativo hepático y la elevación plasmática de ALT y AST, indicando disfuncionalidad hepática.

Agradecimientos

AGRADECIMIENTO

Los autores agradecen al Consejo de Desarrollo Científico, Humanístico y Tecnológico de la Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado” (UCLA, Venezuela), por el financiamiento otorgado a este estudio.

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